Exploring the Intervention Effects of Mulberry Polyphenols on Nonylphenol-Induced Neurobehavioral Toxicity Based on Thyroid Hormone and Deiodinase
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摘要: 为研究桑葚多酚类物质对壬基酚（Nonylphenol，NP）所致神经行为毒性的干预效果，将70只SPF级SD雄性大鼠随机分为7组：空白对照组（玉米油+生理盐水）、桑葚对照组（玉米油+桑葚粗提液）、NP染毒组（NP+生理盐水）、桑葚干预组（NP+桑葚粗提液）、花青素干预组（NP+花青素）、白藜芦醇干预组（NP+白藜芦醇）、联合干预组（NP+花青素+白藜芦醇），其中桑葚粗提液灌胃量按照120 mg/kg·bw多酚含量计，花青素和白藜芦醇含量与桑葚粗提液中含量相对应。采用旷场实验（Open field test, OFT）和高架十字迷宫实验（Elevated plus maze, EPM）评价桑葚多酚类物质对NP神经行为毒性的干预效果，同时检测甲状腺素（FT3、FT4）、促甲状腺素（TSH）和脱碘酶（DIO1、DIO2、DIO3）水平。结果表明：与NP染毒组对比，四个干预组对NP导致的大鼠体重增长速度下降、食物利用率降低和脏器系数的增加均有一定程度的干预效果（P<0.05或P<0.01），大鼠在OFT中活动的总路程、进入中心区的次数和时间以及EPM中进入开臂次数和时间均显著或极显著大于NP染毒组（P<0.05或P<0.01），并且大鼠血清中FT3、FT4和TSH水平显著提高（P<0.05），肝脏中脱碘酶的含量降低但并无显著性差异。综上，桑葚粗提液、花青素及白藜芦醇可以改善NP所致的一般毒性和神经行为毒性，可能是与其调节甲状腺激素和促甲状腺激素以及脱碘酶水平的作用有关。Abstract: The purpose of this study was to explore the intervention effects of mulberry polyphenols on neurobehavioral toxicity induced by nonylphenol (NP). 70 SPF male SD rats were randomly divided into seven groups: Blank control group (corn oil+saline), Mulberry control group [corn oil+mulberry crude extract (MCE)], NP exposure group (NP+saline), mulberry group (NP+MCE), anthocyanin group (NP+anthocyanin), resveratrol group (NP+resveratrol), combined group (NP+anthocyanin+resveratrol). The gavage amount of MCE was calculated according to 120 mg/kg·bw polyphenol content, and the anthocyanin and resveratrol content corresponded to the content in MCE. Open field test (OFT) and elevated plus maze (EPM) were used to evaluate the intervention effects of mulberry polyphenols on neurobehavioral toxicity of NP, and the levels of thyroxine (FT3, FT4), thyroid-stimulating hormone (TSH) and deiodinase (DIO1, DIO2, DIO3) were measured. The results showed that compared with NP group, all four intervention groups had varying degrees of intervention effects on the decrease of body weight growth rate, food utilization rate and organ coefficient of rats induced by NP (P<0.05 or P<0.01). The total distance of movement in OFT, the times of entering the central area, the total time of entering the open arm and staying time in EPM were significantly higher in the intervention groups than those in the NP group (P<0.05 or P<0.01), the levels of FT3, FT4 and TSH in serum increased significantly (P<0.05), while the content of deiodinase in liver decreased but had no significant difference. In summary: The MCE, anthocyanin and resveratrol could improve the neurobehavioral toxicity induced by NP, which might be related to the regulation of thyroid hormone, thyrotropin and deiodinase.
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Keywords:
- nonylphenol /
- mulberry polyphenol /
- thyroid hormone /
- open field test /
- elevated cross maze
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壬基酚（Nonylphenol，NP）是一种重要的工业原料，常被用于生产表面活性剂、杀虫剂、润湿剂和乳化剂等[1]。国内对NP的需求量巨大，是仅次于美国的第二大消费市场[2]。研究显示，空气、水体和土壤中的NP污染情况十分严重[3-5]，工业、农业和生活污水是环境中NP的主要来源，我国大多数河流均有较高水平的NP检出[3-4, 6-7]。水体中的NP污染不仅会降低鱼类的生育能力，造成鱼类脏器毒性和胚胎发育毒性，更重要的是会对以鱼类为食的人类造成威胁[8-9]，对人体产生生殖、免疫、神经等方面的毒性[10-12]。有研究发现NP在体内具有模拟雌激素的作用，影响雌性SD大鼠仔鼠早期神经行为的发育，降低仔鼠的空间学习记忆[13]。相似地，有研究显示长期暴露于NP会导致其蓄积在大鼠甲状腺和血清中，使甲状腺的组织形态及超微结构发生变化，并且会干扰甲状腺受体和雌激素受体的表达，从而影响大鼠的神经行为[14]。
桑葚是一种营养价值较高的小浆果，在世界各地种植广泛，果实可作为水果和中药食用，叶子可以用于喂养桑蚕[15]。桑葚中除了富含人体必需的多种氨基酸，维生素和矿物质，还含有多种活性成分，如花青素、白藜芦醇等。桑葚已经被证实具有抗氧化和保护神经系统的作用，改善大鼠的内分泌紊乱，影响焦虑行为等[16-19]。桑葚中主要的多酚类物质花青素和白藜芦醇对神经退行性疾病有明显的改善效果，如花青素具有较强的抗氧化能力，能改善不溶性淀粉样蛋白所致的神经毒性，提高大鼠在Morris水迷宫中的空间记忆能力[16]；白藜芦醇能够通过影响细胞的自噬，提高对大脑中病理性蛋白的清除能力[20]。目前有研究表明桑葚粗提液对NP所致的神经毒性有一定的干预效果[21]，但桑葚粗提液中主要是哪种成分以及通过哪种途径对NP毒性发挥干预作用尚不明晰。
本研究用桑葚粗提液和桑葚多酚类物质（花青素、白藜芦醇、花青素和白藜芦醇联合）对NP染毒大鼠进行干预，从大鼠体重、食物利用率和脏器系数评价桑葚多酚类物质对NP一般毒性的干预作用。通过旷场实验（Open field test, OFT）和高架十字迷宫实验（Elevated plus maze, EPM）对大鼠的神经行为进行评价，从甲状腺激素通路和脱碘酶水平分析桑葚及其多酚类物质对NP染毒大鼠的神经调节作用，研究结果有助于深入探讨NP导致大鼠神经毒性的机制，并且对进一步挖掘桑葚及桑葚多酚类物质的健康效应以及研发具有抗外源化学物毒性的保健食品具有重要的参考意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜桑葚 国家桑树种植资源华南分圃（广州）；桑葚花青素（纯度≥95%） 成都草源康生物科技有限公司；白藜芦醇（HPLC≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；壬基酚 上海阿拉丁试剂公司；大鼠脱碘酶（DIO1、DIO2、DIO3）ELISA检测试剂盒、大鼠甲状腺素（FT3，FT4）ELISA检测试剂盒、大鼠促甲状腺素（TSH）ELISA检测试剂盒 上海江莱生物科技有限公司；SPF级雄性SD大鼠 70只，体重70～90 g，4周龄，动物和饲料购于广东省医学实验动物中心（SCXK（粤）2018-0002），实验动物合格证号：44007200078791，通过华南农业大学实验动物伦理委员会批准（编号：2020b031）。
旷场实验装置和高架十字迷宫装置 上海移数信息科技有限公司；Ethovision 8.0型行为轨迹跟踪分析系统 荷兰Noldus公司；高效液相色谱仪 日本岛津公司。
1.2 实验方法
1.2.1 制备桑葚粗提液
参考杨婕[21]的方法制备桑葚粗提液（MCE），该方法主要提取具有相应活性作用的多酚类物质，又以其中的花青素和白藜芦醇为代表参与后续的干预实验。将新鲜桑葚冷冻干燥后粉碎过筛（60目），称取500 g粉末，按照料液比1:15加入乙醇（体积分数80%），超声辅助提取1.5 h。静置后取上清液，桑葚果渣按以上步骤重复提取，将提取液进行真空抽滤，得到的浓缩液用超纯水定容至500 mL，即为桑葚粗提液，4 ℃避光保存备用。
1.2.2 桑葚粗提液总多酚、总花青素和白藜芦醇含量的测定
a.福林-酚法测定桑葚粗提液总多酚含量[22]。使用80%乙醇溶液配制1 mg/mL的没食子酸标准溶液，然后用80%乙醇溶液将其稀释为400、350、300、250、200、150和50 mg/mL的标准溶液。分别取125 μL各浓度标准溶液与福林酚溶液1:1混合，避光静置90 min后测定760 nm处吸光值，以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。将桑葚粗提液稀释100倍，按上述步骤绘制标曲计算总多酚含量。
b.pH示差法测定桑葚粗提液中总花青素含量[23]。首先配制pH1.0的氯化钾和pH4.5的乙酸钠缓冲液。将桑葚粗提液稀释100倍后取2份，每份2.5 mL，分别用pH1.0的氯化钾和pH4.5的乙酸钠缓冲液定容至25 mL，得到浓度相同的不同样品缓冲液。将样品缓冲液进行水浴平衡（氯化钾缓冲液：70 ℃，45 min；乙酸钠缓冲液：40 ℃，45 min），分别在520和700 nm处检测吸光值，根据参考文献中公式计算花青素含量。
c.参考标准NY/T 2641-2014《植物源性食品中白藜芦醇和白藜芦醇苷的测定 高效液相色谱法》，测定桑葚粗提液中白藜芦醇的含量。
1.2.3 实验动物分组及处理
将70只大鼠单笼饲养于屏障环境中，大鼠可自由饮食，室内温度为（22±0.5） ℃，相对湿度为50%~60%，明/暗12 h循环。适应性饲养一周后，通过随机区组设计分组，根据大鼠体重分为7组：空白对照组（C组），桑葚对照组（MC组：MCE，以多酚含量计，120 mg/kg·bw），NP染毒组（NP组：NP，270 mg /kg·bw，溶剂为玉米油），桑葚干预组（M组，NP+MCE），花青素干预组（A组，NP+花青素，按桑葚粗提液中花青素含量计），白藜芦醇干预组（R组，NP+白藜芦醇，按桑葚粗提液中白藜芦醇含量计），花青素和白藜芦醇联合干预组（AR组，NP+花青素+白藜芦醇，按桑葚粗提液中花青素和白藜芦醇含量混合）。NP溶于玉米油后按照4 mL/kg·bw灌胃。干预组溶剂为生理盐水，另添加0.5%的羧甲基纤维素钠溶液辅助溶解，按照10 mL/kg·bw灌胃。每天上午9:00空白对照组和桑葚对照组灌胃玉米油，染毒组和干预组灌胃壬基酚（溶于玉米油）；1 h后，空白对照组和NP染毒组灌胃生理盐水，桑葚对照组灌胃桑葚粗提液（溶于生理盐水），干预组分别灌胃MCE、花青素、白藜芦醇和花青素与白藜芦醇的混合液（溶于生理盐水）。各组大鼠每天具体灌胃设计见表1，连续灌胃28 d。
表 1 大鼠每天灌胃设计表Table 1. Operation table of rats by intragastric administration every day组别 灌胃药物 上午9:00 上午10:00 空白对照组（C） 玉米油 生理盐水 桑葚对照组（MC） 玉米油 桑葚粗提液 NP染毒组（NP） NP（270 mg/kg） 生理盐水 桑葚干预组（M） NP（270 mg/kg） 桑葚粗提液 花青素干预组（A） NP（270 mg/kg） 桑葚花青素 白藜芦醇干预组（R） NP（270 mg/kg） 白藜芦醇 联合干预组（AR） NP（270 mg/kg） 桑葚花青素+白藜芦醇 1.2.4 大鼠体重和食物利用率的测定
每4 d为一个灌胃期，每个灌胃期结束当天的同一时间称量体重和饲料剩余量，记录数据，食物利用率=（体重增量/饲料消耗量）×100
1.2.5 大鼠脏器系数的测定
大鼠在断颈处死前称量其体重，处死后在冰上进行解剖，将大鼠肝脏、肾脏、睾丸和大脑完整的剥离后称重，脏器系数=（脏器重量/大鼠体重）×100
1.2.6 行为学测试
行为学装置在彻底清洁后进行实验，实验开始前1 h将大鼠转移到行为学实验室让其适应环境，开始实验时，从大鼠背后轻柔地将其取出鼠笼，放入OFT和EPM行为学装置中，然后立即离开实验区域，并通过行为学装置配套软件自动记录大鼠在5 min内产生的行为学数据（OFT：总路程，进入中心区域次数、时间和路程，直立次数、修饰次数；EPM：入臂总次数和总时间，进入开臂次数和时间），实验结束后将行为学装置中大鼠的排泄物清理干净，并用75%的乙醇消除气味再进行下一次实验。
1.2.7 甲状腺激素水平的测定
行为学实验结束后，对大鼠进行眼眶取血，采血后常温静置30 min，然后3000 r/min离心15 min，得到的上清液即为血清，用相应的ELISA试剂盒检测血清中的FT3、FT4和TSH。
1.2.8 脱碘酶水平的测定
大鼠断颈处死后，在冰上解剖分离肝脏。切取同一部位的适量肝脏组织并称重记录，按1:9的质量比例加入PBS缓冲液，在冷冻研磨仪中重复研磨，得到的匀浆液在4 ℃，3000 r/min离心20 min，取上清液用相应的ELISA试剂盒检测DIO1、DIO2和DIO3。
1.3 数据处理
实验数据处理后以均值±标准差（mean±SD）表示，使用SPSS20.0软件对数据进行统计学分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较组间差异。若方差齐则采用LSD检验，若方差不齐则采用Games-Howell检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2. 结果与分析
2.1 桑葚粗提液多酚类物质含量
通过实验测定得到，桑葚粗提液中总多酚含量为24.21 mg/mL，花青素含量为14.08 mg/mL，白藜芦醇含量为129.67 mg/mL。
2.2 大鼠体重和食物利用率变化
由图1可知，在28 d的灌胃期间各组大鼠的平均体重均呈现上升的趋势，C组平均体重增长速度最快，MC组和R组次之。但随着灌胃天数的增加，各组大鼠体重的增长速率逐渐减缓，其中NP组在28 d灌胃期后期体重增长速度最慢。
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图 1 桑葚多酚类物质对NP染毒大鼠体重增长的影响Figure 1. Effects of mulberry polyphenols on body weight gain of rats exposed to NP由表2可知，灌胃前各组间大鼠体重无显著性差异（P>0.05）。经过28 d的灌胃后，与C组相比，各组大鼠体重和体重增量均显著或极显著低于C组（P<0.05或P<0.01）。与NP染毒组相比，四个干预组除R组体重显著增加（P<0.05）、体重增量极显著提高（P<0.01）外，M、A和AR组大鼠体重和体重增量均无显著性差异（P>0.05）。
表 2 各组大鼠体重变化Table 2. Changes of body weight of rats in each group组别 灌胃前体重（g） 灌胃28 d后体重（g） 体重增量（g） C 175.01±11.21 426.98±31.61 251.97±22.38 MC 173.39±13.40 400.17±30.28* 226.78±20.05** NP 173.42±8.36 358.96±23.44**&& 185.55±21.45**&& M 174.85±10.00 378.83±18.32** 203.75±10.72**& A 175.50±10.23 376.59±28.78** 199.68±21.88**&& R 175.51±10.51 387.21±29.92**# 211.70±25.00**## AR 175.08±11.77 380.65±32.22** 203.67±26.21**& 注：*：与C组相比，具有显著性P<0.05；**：与C组相比，具有极显著性P<0.01；&：与MC组相比，具有显著性P<0.05；&&：与MC组相比，具有极显著性P<0.01；#：与NP组相比，具有显著性P<0.05；##：与NP组相比，具有极显著性P<0.01。C：空白对照组，MC：桑葚对照组，NP：壬基酚染毒组，M：桑葚干预组，A：花青素干预组，R：白藜芦醇干预组，AR：花青素+白藜芦醇干预组；表3~表7，图1~图4同。 由表3可知，在28 d灌胃期间，各组大鼠的食物利用率均逐渐下降。在灌胃前期，各组大鼠食物利用率没有明显差异。与C组相比，NP组食物利用率从第4个灌胃期开始出现极显著下降（P<0.01）；M组食物利用率从第3个灌胃期开始显著下降（P<0.05），但从第6个灌胃期开始有所恢复，与C组无显著性差异（P>0.05）；A、R和AR组食物利用率仅在第4个灌胃期有显著降低（P<0.05）。与NP组相比，四个干预组食物利用率均从第6个灌胃期开始显著或极显著上升（P<0.05或P<0.01）。从总食物利用率来看，四个干预组与NP染毒组相比只有M组食物利用率有极显著提升（P<0.01）。
表 3 各组大鼠食物利用率的变化Table 3. Changes of food utilization rate of rats in each group组别 C MC NP M A R AR 灌胃期1 36.38±3.72 36.31±7.38 33.96±4.70 37.46±6.54 35.30±3.39 37.60±4.15 34.77±4.72 灌胃期2 32.25±4.02 32.06±3.06 32.91±3.69 28.30±6.39 29.33±3.46 31.61±6.49 29.53±4.40 灌胃期3 32.53±2.27 33.18±2.38 28.70±6.28 28.03±3.56*& 26.78±5.39& 29.65±6.52 29.45±3.44 灌胃期4 31.34±3.43 30.31±3.57 25.21±7.24**& 26.27±7.00*& 25.61±4.01*& 24.83±4.08*& 25.95±2.82*& 灌胃期5 29.51±2.13 27.47±3.95 25.31±5.80* 23.19±4.27**& 23.23±8.08 28.90±4.00 26.72±5.13 灌胃期6 25.44±1.73 26.41±5.46 12.61±4.47**&& 24.92±4.76## 22.66±9.59## 22.19±7.65## 23.87±5.26## 灌胃期7 21.72±2.18 26.13±9.23 13.72±3.57*&& 26.39±11.18## 24.26±9.88## 20.69±6.03# 18.15±5.98& 总利用率 29.69±1.53 29.87±1.96 24.24±2.67**&& 28.09±1.83## 26.17±1.90**&& 26.87±1.89*& 26.18±1.98**&& 综上所述，连续28 d的NP暴露后，大鼠体重和食物利用率会明显降低，说明NP会影响大鼠的正常生长发育。四个干预组对NP导致的大鼠体重和食物利用率的下降都有恢复作用，白藜芦醇对体重变化的改善最明显，而桑葚粗提液可以更好地改善NP导致的食物利用率降低。
2.3 大鼠脏器系数的变化
由图2可知，与C和MC组相比，NP组大鼠的肾脏系数和肝脏系数均有显著或极显著增加（P<0.05或P<0.01），说明NP染毒后大鼠的肾脏和肝脏产生了形态学变化；与NP组相比，四个干预组的肾脏系数都有降低但无显著性差异（P>0.05），肝脏系数也都有下降，并且A组的肝脏系数显著下降（P<0.05），这可能是因为花青素能够调节促凋亡蛋白和促炎因子的表达，从而抑制肝脏细胞凋亡[24]。就大脑系数而言，与C组相比，除MC组和R组，其余4组大鼠大脑系数均显著或极显著增加（P<0.05或P<0.01），说明NP染毒可能使大鼠大脑产生了形态学变化；与NP组相比，M、R、AR组大脑系数都有下降趋势，其中R组下降最明显，但没有显著降低，说明桑葚粗提液、白藜芦醇和联合干预组对大脑系数的有干预效果但不是很明显。就睾丸系数而言，各组大鼠间没有显著性差异（P>0.05）。
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图 2 桑葚多酚类物质对NP染毒大鼠脏器系数的影响Figure 2. Effects of mulberry polyphenols on organ coefficient of rats exposed to NP2.4 桑葚多酚类物质对NP染毒后大鼠神经行为的影响
各组大鼠在28 d灌胃期前后的OFT结果如表4和表5所示。由表4可知，各组大鼠的OFT行为指标均无显著性差异（P>0.05）。由表5可知，与C组、MC组相比，NP组大鼠活动总距离极显著下降（P<0.01）。NP组大鼠进入中心区的次数和时间显著低于C组（P<0.05），且在中心区活动距离和直立次数显著低于MC组（P<0.05）。大鼠进入中心区次数和时间越少，焦虑程度越高，这说明NP染毒造模成功。与NP染毒组相比，四个干预组的大鼠活动总路程都显著增加（P<0.05），M组、R组和AR组大鼠进入中心区域次数显著或极显著增加（P<0.05或P<0.01），R组大鼠在中心区域活动时间显著上升（P<0.05），M组和AR组大鼠在中心区域活动距离显著增加（P<0.05），AR组大鼠直立次数极显著增加（P<0.01），这些结果说明M组、R组和AR组对大鼠焦虑均有一定的干预效果，而A组的干预效果不明显。
表 4 灌胃前OFT行为指标分析Table 4. Analysis of behavioral indexes of OFT before intragastric administration组别 总距离（cm） 中心区次数 中心区时间（s） 中心区距离（cm） 直立次数 修饰次数 C 1045.95±211.44 7.63±2.88 32.56±10.73 160.90±41.25 12.40±5.13 2.9±1.20 MC 1102.71±151.06 7.70±2.41 41.67±24.71 168.68±47.58 13.44±5.55 3.36±1.86 NP 1040.13±121.60 8.45±3.91 32.14±13.93 178.89±59.68 13.09±4.70 3.10±1.85 M 1024.29±208.17 8.38±4.69 34.99±24.51 176.79±68.14 12.78±5.02 2.89±1.05 A 1185.35±125.97 8.18±3.97 33.56±8.74 184.85±68.30 13.09±3.70 3.09±2.17 R 1059.67±195.74 7.89±4.14 40.39±20.96 184.47±85.05 13.44±4.59 3.40±2.41 AR 1106.98±134.25 7.63±1.30 36.85±15.01 179.68±53.71 12.33±3.84 2.75±1.49 表 5 灌胃后OFT行为指标分析Table 5. Analysis of behavioral indexes of OFT after intragastric administration组别 总距离（cm） 中心区次数 中心区时间（s） 中心区距离（cm） 直立次数 修饰次数 C 1017.49±258.91 10.00±2.76 36.19±7.99 123.48±48.79 10.82±3.31 2.29±0.95 MC 1053.14±179.26 8.89±3.37 33.23±11.35 159.67±63.98 12.09±4.72 2.82±1.83 NP 673.82±173.70**&& 5.90±2.23* 20.81±13.70* 86.91±39.08& 8.40±3.44& 2.10±1.20 M 959.08±241.15# 9.43±3.69# 34.22±16.96 183.91±72.60# 12.33±5.61 3.00±1.93 A 971.65±177.21## 9.00±3.82 32.27±17.90 148.68±69.43 12.25±4.30 2.25±1.39 R 1064.76±211.18## 9.50±3.42# 35.00±15.46# 152.75±73.47 10.80±4.02 1.80±0.92 AR 1023.72±254.31## 9.90±3.51## 31.78±11.38 170.60±57.32# 13.27±3.52## 2.82±1.08 由表6可知，各组间大鼠在28 d灌胃期前的EPM行为指标均无显著性差异（P>0.05），28 d灌胃期后各组大鼠在EPM的行为指标分析如表7所示。与C组和MC组相比，NP组大鼠入臂总次数、进入开臂的次数和时间均显著或极显著减少（P<0.05或P<0.01），说明NP染毒使大鼠产生了焦虑情绪，造模成功。与NP组相比，M组、A组和R组大鼠入臂总次数、进入开臂的次数和时间均有显著或极显著提高（P<0.05或P<0.01），AR组的入臂总次数和进入开臂的次数也显著提高（P<0.05），这些结果说明四个干预组对大鼠焦虑均有一定的干预效果。
表 6 灌胃前EPM行为指标分析Table 6. Analysis of behavioral indexes of EPM before intragastric administration组别 入臂总次数 入臂总时间（s） 开臂次数 开臂时间（s） C 15.25±4.33 258.48±12.84 5.67±1.94 45.10±16.42 MC 15.25±6.36 262.24±15.83 5.00±2.07 38.50±15.32 NP 13.63±5.58 259.62±18.00 5.13±2.03 46.59±18.55 M 14.00±8.08 271.87±10.56 5.71±3.99 47.91±19.83 A 12.50±6.72 266.96±11.10 5.57±2.76 42.69±18.00 R 14.63±5.85 267.61±15.13 6.13±2.47 43.92±18.08 AR 16.13±5.14 258.78±14.85 6.88±2.47 47.82±19.54 表 7 灌胃后EPM行为指标分析Table 7. Analysis of behavioral indexes of EPM after intragastric administration组别 入臂总次数 入臂总时间（s） 开臂次数 开臂时间（s） C 18.29±3.55 243.36±9.25 6.57±2.44 38.84±15.88 MC 19.17±5.95 240.97±22.36 6.00±2.76 33.46±17.09 NP 11.56±2.83**&& 255.96±14.53 2.22±2.17**&& 14.74±13.53*&& M 17.14±2.34## 263.21±11.16 6.14±1.95## 41.08±15.18## A 18.57±4.58## 240.60±19.81 5.86±2.54## 36.34±17.92# R 18.29±6.16## 243.24±19.50 6.14±2.67## 42.35±24.00## AR 15.78±2.59# 251.85±12.04 4.86±1.86# 29.72±14.21 综上所述，OFT和EPM测试结果同时说明NP暴露会导致大鼠的焦虑行为。NP暴露后可能会在蓄积大脑中并导致神经元细胞排列紊乱和胞核固缩，随着暴露浓度越高，脑组织中NP蓄积浓度越高[25]。结合本研究中NP暴露后大脑系数显著增加的结果，推测NP可能通过蓄积在大脑中对神经元产生损伤，从而产生神经行为毒性。杨婕[21]发现桑葚粗提液能够显著增加大鼠在OFT测试中进入旷场中心区域次数，还可以显著提高EPM测试中进入开臂的次数和时间，说明桑葚粗提液能够改善焦虑程度，本研究结果与之一致。
2.5 桑葚多酚类物质对NP染毒后大鼠甲状腺激素的影响
桑葚粗提液、花青素及白藜芦醇对各组大鼠血清中FT3、FT4和TSH水平的影响如图3所示。与C组和MC组相比，NP组大鼠血清中的FT3、FT4和TSH都有极显著降低（P<0.01），说明NP对甲状腺激素和促甲状腺激素的分泌产生了干扰。干预组中，M组和AR组与NP组大鼠相比，血清中FT3、FT4和TSH水平都有显著回升（P<0.05或P<0.01），R组大鼠血清中的FT3水平有极显著的上升（P<0.01），说明桑葚粗提液干预和联合干预能够在一定程度上缓解NP对甲状腺激素和促甲状腺激素的影响。
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图 3 桑葚多酚类物质对NP染毒大鼠血清中甲状腺激素的影响Figure 3. Effects of mulberry polyphenols on thyroid hormone in serum of rats exposed to NP2.6 桑葚多酚类物质对NP染毒后大鼠脱碘酶的影响
桑葚粗提液、花青素及白藜芦醇对各组大鼠肝脏中脱碘酶DIO1、DIO2和DIO3水平的影响如图4所示。与C组相比，NP组、R组和AR组大鼠肝脏内的DIO1、DIO2和DIO3水平均显著或极显著增加（P<0.05或P<0.01），说明NP暴露引起了大鼠肝脏中脱碘酶表达异常，花青素及联合干预没能逆转NP诱导的脱碘酶升高。M组和A组大鼠肝脏中DIO1、DIO2和DIO3水平与对照组相比没有显著性差异（P>0.05），与NP组相比均有下降的趋势，但无显著性差异（P>0.05），说明桑葚粗提液和花青素对大鼠肝脏脱碘酶的干预有一定效果，但不是很明显。
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图 4 桑葚多酚类物质对NP染毒大鼠脱碘酶的影响Figure 4. Effects of mulberry polyphenols on deiodinase in rats exposed to NP3. 讨论与结论
本研究中，连续28 d的NP暴露导致大鼠体重和食物利用率明显降低，而四组干预组中白藜芦醇组对体重变化的改善最明显，其他三个干预组也有所改善，但程度不大。另外，桑葚干预组的食物利用率明显高于NP组且恢复到与C组相当的水平，而其余三组恢复程度不明显。结果说明桑葚粗提液可以改善NP导致的食物利用率降低，而白藜芦醇的干预作用更好地体现在了体重的恢复上，先前的研究亦显示，白藜芦醇能够在一定程度上改善环磷酰胺引起的免疫力低下导致的小鼠体重下降[26]。
脏器系数是评价毒性作用的常用指标，能够在一定程度上反映实验动物的机能状态和内脏器官的病理变化。从本实验的脏器系数结果来看，NP暴露后的大鼠肝脏系数、肾脏系数和大脑系数均显著增加，这可能是因为NP是脂溶性物质，容易蓄积于脏器，从而导致脏器出现充血、水肿或肥大等变化[27]。A组肝脏系数的干预效果最明显，可能是花青素发挥了调节促凋亡蛋白和促炎因子的作用[28-29]，从而减轻肝脏的炎症反应。然而，四组干预物质对NP导致的肾脏和大脑系数的增加无显著的逆转效果，这表明在一定程度上，桑葚多酚类物质未能有效缓解NP所致肾脏和大脑的形态学变化。
OFT和EPM实验是评估大鼠神经行为状态的经典手段，可以通过大鼠在OFT中进入中心区活动的时间和距离或在EPM中进入的开臂次数和停留时间等指标来评估其焦虑状态，在OFT中心区活动越少，或进入EPM开臂次数越少，说明大鼠的焦虑程度越高[30]。本研究中，NP组大鼠与C组和MC组相比，在OFT中活动的总路程、直立次数和进入中心区次数明显减少，在EPM中进入开臂的次数和停留时间也明显降低，表明NP暴露可引起大鼠焦虑情绪。而在桑葚粗提液和多酚类物质干预后，上述指标均有一定程度的提高，并恢复到对照组水平，说明干预组大鼠的焦虑水平被有效缓解。多酚类物质能够对焦虑抑郁情绪有一定的缓解作用，例如富含多酚的黑果海葵汁能够显著增加大鼠在EPM中进入开臂的时间和次数，且具有剂量-效应关系，对大鼠具有明显的抗焦虑作用[31]；黑莓汁中的花青素对大鼠也有镇定和抗焦虑的作用，而且在一定剂量下可达到抗焦虑药物相似的效果[32]；白藜芦醇也具有多种治疗作用，如抗氧化、抗炎、神经保护等[33]。
甲状腺激素对于大脑发挥正常功能有着重要的作用，而内分泌干扰物会影响甲状腺激素的水平，进而影响大脑的神经系统。有报道称甲状腺激素的降低会导致海马体神经元突触结构生长缓慢，造成记忆力下降和认知障碍[34]。本研究结果显示，与C组和MC组相比，大鼠在暴露于NP后血清中FT3、FT4和TSH水平极显著下降，说明NP可能对大鼠的甲状腺造成了一定的损伤。与NP组相比，桑葚粗提液干预、花青素和白藜芦醇联合干预都能显著或极显著提高FT3、FT4和TSH的水平（P<0.05或P<0.01），白藜芦醇单独处理也能显著提高FT3的水平（P<0.05），而花青素单独处理后，FT3、FT4和TSH均没有明显回升。研究显示，白藜芦醇能够通过改善甲状腺功能减退大鼠血浆TSH水平和下丘脑促甲状腺激素释放激素（TRH）水平，从而改善其学习记忆能力[35]。因此，推测桑葚多酚类物质可能是通过调控大鼠体内甲状腺激素和TSH水平等，减少NP导致的神经毒性，从而缓解焦虑情绪。
脱碘酶的作用在于维持甲状腺激素水平的稳定[36]。本研究结果显示，NP染毒后大鼠肝脏中的脱碘酶DIO1、DIO2和DIO3水平与对照组相比均显著升高（P<0.05）。经过桑葚粗提液和花青素干预后，三种脱碘酶的水平均有下降趋势，且与对照组无显著性差异，而白藜芦醇和联合干预后三种脱碘酶水平还是显著高于对照组。结果提示桑葚粗提液和花青素对肝脏脱碘酶水平有一定的调节作用，其对NP染毒大鼠的干预效应可能是通过调节甲状腺激素和脱碘酶水平的稳态、改善大鼠的焦虑情绪，从而达到减轻神经行为毒性的途径来实现的。
综上所述，NP短期重复染毒可导致大鼠体重和食物利用率下降，部分脏器损伤，焦虑行为，血清FT3、FT4和TSH水平的降低和肝脏DIO1、DIO2和DIO3水平的升高。桑葚粗提液及其主要多酚成分花青素和白藜芦醇可以有效缓解NP所致的有害作用，推测其中的机制可能是桑葚多酚类物质可以通过调节甲状腺激素水平稳态达到减轻神经行为毒性的干预效果。
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图 1 桑葚多酚类物质对NP染毒大鼠体重增长的影响
Figure 1. Effects of mulberry polyphenols on body weight gain of rats exposed to NP
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图 2 桑葚多酚类物质对NP染毒大鼠脏器系数的影响
Figure 2. Effects of mulberry polyphenols on organ coefficient of rats exposed to NP
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图 3 桑葚多酚类物质对NP染毒大鼠血清中甲状腺激素的影响
Figure 3. Effects of mulberry polyphenols on thyroid hormone in serum of rats exposed to NP
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图 4 桑葚多酚类物质对NP染毒大鼠脱碘酶的影响
Figure 4. Effects of mulberry polyphenols on deiodinase in rats exposed to NP
表 1 大鼠每天灌胃设计表
Table 1 Operation table of rats by intragastric administration every day
组别 灌胃药物 上午9:00 上午10:00 空白对照组（C） 玉米油 生理盐水 桑葚对照组（MC） 玉米油 桑葚粗提液 NP染毒组（NP） NP（270 mg/kg） 生理盐水 桑葚干预组（M） NP（270 mg/kg） 桑葚粗提液 花青素干预组（A） NP（270 mg/kg） 桑葚花青素 白藜芦醇干预组（R） NP（270 mg/kg） 白藜芦醇 联合干预组（AR） NP（270 mg/kg） 桑葚花青素+白藜芦醇 
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表 2 各组大鼠体重变化
Table 2 Changes of body weight of rats in each group
组别 灌胃前体重（g） 灌胃28 d后体重（g） 体重增量（g） C 175.01±11.21 426.98±31.61 251.97±22.38 MC 173.39±13.40 400.17±30.28* 226.78±20.05** NP 173.42±8.36 358.96±23.44**&& 185.55±21.45**&& M 174.85±10.00 378.83±18.32** 203.75±10.72**& A 175.50±10.23 376.59±28.78** 199.68±21.88**&& R 175.51±10.51 387.21±29.92**# 211.70±25.00**## AR 175.08±11.77 380.65±32.22** 203.67±26.21**& 注：*：与C组相比，具有显著性P<0.05；**：与C组相比，具有极显著性P<0.01；&：与MC组相比，具有显著性P<0.05；&&：与MC组相比，具有极显著性P<0.01；#：与NP组相比，具有显著性P<0.05；##：与NP组相比，具有极显著性P<0.01。C：空白对照组，MC：桑葚对照组，NP：壬基酚染毒组，M：桑葚干预组，A：花青素干预组，R：白藜芦醇干预组，AR：花青素+白藜芦醇干预组；表3~表7，图1~图4同。
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表 3 各组大鼠食物利用率的变化
Table 3 Changes of food utilization rate of rats in each group
组别 C MC NP M A R AR 灌胃期1 36.38±3.72 36.31±7.38 33.96±4.70 37.46±6.54 35.30±3.39 37.60±4.15 34.77±4.72 灌胃期2 32.25±4.02 32.06±3.06 32.91±3.69 28.30±6.39 29.33±3.46 31.61±6.49 29.53±4.40 灌胃期3 32.53±2.27 33.18±2.38 28.70±6.28 28.03±3.56*& 26.78±5.39& 29.65±6.52 29.45±3.44 灌胃期4 31.34±3.43 30.31±3.57 25.21±7.24**& 26.27±7.00*& 25.61±4.01*& 24.83±4.08*& 25.95±2.82*& 灌胃期5 29.51±2.13 27.47±3.95 25.31±5.80* 23.19±4.27**& 23.23±8.08 28.90±4.00 26.72±5.13 灌胃期6 25.44±1.73 26.41±5.46 12.61±4.47**&& 24.92±4.76## 22.66±9.59## 22.19±7.65## 23.87±5.26## 灌胃期7 21.72±2.18 26.13±9.23 13.72±3.57*&& 26.39±11.18## 24.26±9.88## 20.69±6.03# 18.15±5.98& 总利用率 29.69±1.53 29.87±1.96 24.24±2.67**&& 28.09±1.83## 26.17±1.90**&& 26.87±1.89*& 26.18±1.98**&&
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表 4 灌胃前OFT行为指标分析
Table 4 Analysis of behavioral indexes of OFT before intragastric administration
组别 总距离（cm） 中心区次数 中心区时间（s） 中心区距离（cm） 直立次数 修饰次数 C 1045.95±211.44 7.63±2.88 32.56±10.73 160.90±41.25 12.40±5.13 2.9±1.20 MC 1102.71±151.06 7.70±2.41 41.67±24.71 168.68±47.58 13.44±5.55 3.36±1.86 NP 1040.13±121.60 8.45±3.91 32.14±13.93 178.89±59.68 13.09±4.70 3.10±1.85 M 1024.29±208.17 8.38±4.69 34.99±24.51 176.79±68.14 12.78±5.02 2.89±1.05 A 1185.35±125.97 8.18±3.97 33.56±8.74 184.85±68.30 13.09±3.70 3.09±2.17 R 1059.67±195.74 7.89±4.14 40.39±20.96 184.47±85.05 13.44±4.59 3.40±2.41 AR 1106.98±134.25 7.63±1.30 36.85±15.01 179.68±53.71 12.33±3.84 2.75±1.49
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表 5 灌胃后OFT行为指标分析
Table 5 Analysis of behavioral indexes of OFT after intragastric administration
组别 总距离（cm） 中心区次数 中心区时间（s） 中心区距离（cm） 直立次数 修饰次数 C 1017.49±258.91 10.00±2.76 36.19±7.99 123.48±48.79 10.82±3.31 2.29±0.95 MC 1053.14±179.26 8.89±3.37 33.23±11.35 159.67±63.98 12.09±4.72 2.82±1.83 NP 673.82±173.70**&& 5.90±2.23* 20.81±13.70* 86.91±39.08& 8.40±3.44& 2.10±1.20 M 959.08±241.15# 9.43±3.69# 34.22±16.96 183.91±72.60# 12.33±5.61 3.00±1.93 A 971.65±177.21## 9.00±3.82 32.27±17.90 148.68±69.43 12.25±4.30 2.25±1.39 R 1064.76±211.18## 9.50±3.42# 35.00±15.46# 152.75±73.47 10.80±4.02 1.80±0.92 AR 1023.72±254.31## 9.90±3.51## 31.78±11.38 170.60±57.32# 13.27±3.52## 2.82±1.08
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表 6 灌胃前EPM行为指标分析
Table 6 Analysis of behavioral indexes of EPM before intragastric administration
组别 入臂总次数 入臂总时间（s） 开臂次数 开臂时间（s） C 15.25±4.33 258.48±12.84 5.67±1.94 45.10±16.42 MC 15.25±6.36 262.24±15.83 5.00±2.07 38.50±15.32 NP 13.63±5.58 259.62±18.00 5.13±2.03 46.59±18.55 M 14.00±8.08 271.87±10.56 5.71±3.99 47.91±19.83 A 12.50±6.72 266.96±11.10 5.57±2.76 42.69±18.00 R 14.63±5.85 267.61±15.13 6.13±2.47 43.92±18.08 AR 16.13±5.14 258.78±14.85 6.88±2.47 47.82±19.54
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表 7 灌胃后EPM行为指标分析
Table 7 Analysis of behavioral indexes of EPM after intragastric administration
组别 入臂总次数 入臂总时间（s） 开臂次数 开臂时间（s） C 18.29±3.55 243.36±9.25 6.57±2.44 38.84±15.88 MC 19.17±5.95 240.97±22.36 6.00±2.76 33.46±17.09 NP 11.56±2.83**&& 255.96±14.53 2.22±2.17**&& 14.74±13.53*&& M 17.14±2.34## 263.21±11.16 6.14±1.95## 41.08±15.18## A 18.57±4.58## 240.60±19.81 5.86±2.54## 36.34±17.92# R 18.29±6.16## 243.24±19.50 6.14±2.67## 42.35±24.00## AR 15.78±2.59# 251.85±12.04 4.86±1.86# 29.72±14.21
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