Purification and Characterization of Porcine Angiotensin Converting Enzyme 2
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摘要: 血管紧张素转换酶2（Angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是参与血压调节的关键酶之一，由于传统的ACE2纯化方法难度大、效率低，因此，有必要优化其分离纯化方法，为ACE2的基础研究提供保障。本研究以猪肾为原材料，通过酸沉淀、硫酸铵盐析，结合DEAE-Sepharose、Q-Sepharose及Phenyl Sepharose柱层析对ACE2进行分离纯化。探究了温度、pH、金属离子、抑制剂对纯化的ACE2的活性影响，并通过PAS染色验证其是否为糖蛋白。实验结果表明，纯化的ACE2分子量约为98 kDa，纯化倍数为149.8，得率为0.1%。对ACE进行质谱鉴定，得到41个肽段，与猪ACE2的氨基酸序列高度一致。酶学性质研究结果表明，ACE2为金属蛋白酶，最适pH为7.0，最适温度为40 ℃。Zn2+能激活其活性，而金属离子Cu2+、Fe3+和Cd2+对ACE2的活性有抑制作用。圆二色谱分析发现，ACE2的热变性温度为67.5 ℃。PAS染色结果显示猪ACE2为糖蛋白。本研究结果可为天然ACE2的高效纯化提供参考，也有助于推进以ACE2为靶点的功能性食品开发。
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关键词:
- 血管紧张素转换酶2（ACE2） /
- 组织分布 /
- 纯化 /
- 酶学性质
Abstract: Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) is one of the key enzymes involved in blood pressure regulation. Conventional purification method for ACE2 was complicated and with low efficacy. Thus, it is necessary to optimize the purification method to provide reference for the research of ACE2. In this study, porcine kidney was used as raw material, and ACE2 was purified by acid precipitation, ammonium sulfate precipitation, column chromatographies of DEAE-Sepharose, Q-Sepharose and Phenyl Sepharose. The effects of temperature, pH, metal ions, and inhibitors on the activity of ACE2 were explored, and PAS staining was adopted to verify whether it is glycoprotein or not. The results showed that the molecular weight of purified ACE2 was about 98 kDa, with purification folds of 149.8, and yield of 0.1%. Purified protein was identified by mass spectrometry, and 41 peptides were obtained which were identical to the amino acid sequence of porcine ACE2. ACE2 was a metalloproteinase, its optimum pH was 7.0 and optimum temperature was 40 ℃. Metal ion Zn2+ could activate its activity while Cu2+, Fe3+ and Cd2+ inhibited it. The results of circular dichroism spectrum showed that the denaturation temperature of ACE2 was 67.5 ℃, and its secondary structure irreversibly changed after heating. Porcine ACE2 was a glycoprotein as revealed by PAS staining. This study would provide a reference for effective purification of natural ACE2 and is also helpful to promote the development of functional foods targeting ACE2. -
血管紧张素转换酶2（ACE2，EC 3.4.17.23）是血管紧张素转换酶（ACE，EC 3.4.15.1）的同源酶，两者共同参与血压调节系统的稳定平衡[1-2]。ACE2对多种生物活性肽具有水解活性，并优先裂解以Pro-X结尾的肽段的末端氨基酸残基（X为疏水性氨基酸）[3]，如Ang II（DRVYIHPF）、Apelin-13（QRPRLSHKGPMPF）等[4]。Ang II是高血压系统中的关键调节因子之一，ACE2可水解Ang II生成Ang（1-7），进而作用于G蛋白偶联受体Mas受体，从而发挥舒张血压、抗氧化损伤、抗炎等作用，对抗平衡由ACE-Ang Ⅱ-AT1受体系统介导的升压效应[5-6]，并发挥减缓肠道内的炎症反应及氧化损伤等功能[7-8]。除此之外，ACE2还可协调肠道内氨基酸的转运和葡萄糖的稳态[9]。
近年来，随着对ACE2在高血压系统中作用研究的深入，关于食源性降压产品的研究不再局限于ACE抑制肽，ACE2激活肽的研究日益受到关注。Liao等[10]发现，蛋清蛋白中提取的一种可显著降低原发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHRs）血压的三肽IRW，其降压途径并非抑制ACE，而是通过上调ACE2发挥降压作用。这表明以激活ACE2为目的开发降压产品有望成为高血压防治的新靶点。有研究发现，ACE2激动剂氧杂蒽酮类化合物（Xanthenone，XNT）可与ACE2结合，打开其相对封闭的构象使更多的底物进入，且能显著降低原发性高血压大鼠（SHRs）的血压[11-12]。这表明以激活ACE2为靶点制备新型降血压产品是一种新途径，而食源性肽是ACE2激活产品的良好来源。
ACE2的组织分布广泛，在肾脏、心脏、睾丸、肠道等组织均有表达[13-14]，主要分布于冠状动脉、肾血管内皮和肾小管内皮[15]。前期的研究者通过分子生物学技术克隆并表达了人源[1]、猪源[16]以及牛源[17]等动物的ACE2，而天然ACE2由于含量低、纯化难度大等问题，其分离纯化以及性质研究鲜有报道。因此，本研究拟优化天然ACE的纯化方法，以猪肾实质为原材料分离纯化猪ACE2并对其酶学性质进行研究，为以ACE2活性为靶点的食源性功能食品的开发提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜猪肾脏、胰、脾、大肠、小肠、胃、心、脑及肺组织 厦门银祥食品有限公司，为排除个体差异，每个组织取样三份，分别来源于三头猪；DEAE-Sepharose、HiTrap Phenyl Sepharose、HiTrap Q-Sepharose层析柱 GE Healthcare公司；荧光底物Mca-Ala-Pro-Lys（Dnp）-OH （MCA-APK） GLPBIO公司；7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC） Peptide Institute公司；兔抗人ACE2单克隆抗体 ABclonal公司；兔抗β-actin单克隆抗体 Cell Signaling Technology公司；HRP标记的羊抗兔IgG抗体 Pierce公司；SDS标准蛋白 Fermentas公司；PAS染色试剂盒 Solarbio公司；其他试剂 均为国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
Avanti J-26SXP高速冷冻离心机 美国Beckman公司；G:BOX凝胶成像仪 英国Synegene公司；Fluor ChemQ化学发光成像仪 美国Alpha Innotech公司；Chirascan圆二色谱仪 英国Applied Photophysics；M200 PRO多功能酶标仪 奥地利Tecan公司；AKTA蛋白及多肽纯化装置 美国GE Healthcare公司；Nanodrop 100微量蛋白核酸测定仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；JS-Power 600电泳仪 中国培清科技。
1.2 实验方法
1.2.1 猪不同组织前处理
猪的肾、心、肝、脾、肺等组织在−18 ℃下预冻24 h后常温流水解冻。每个组织共取15 g，洗去血水，用3倍体积（w/v）的缓冲液A（50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）匀浆，而后加入0.7% Triton X-100（w/v）搅拌1 h，差速离心（0~8000×g，4 ℃，30 min）后取上清液，四层纱布过滤后的透过液即为样液。
1.2.2 免疫印迹（Western blot）分析ACE2在不同组织中的存在
取上述样液，参考李婉玉等[18]的方法进行实验操作。选择兔抗人ACE2单克隆抗体（1:2000稀释）作为一抗，内参蛋白以兔抗β-actin单克隆抗体（1:10000稀释）作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG（1:20000稀释）作为二抗。用Image J软件对图像进行灰度分析。
1.2.3 猪肾实质ACE2的分离纯化
1.2.3.1 猪肾实质前处理
使用400 g猪肾用于ACE2的分离纯化，处理过程均在4 ℃下进行。具体方法参考1.2.1。
1.2.3.2 酸沉淀及硫酸铵盐析
1.2.3.1所得粗酶液用1 mol/L盐酸缓慢调pH至4.2，于50 ℃水浴加热20 min后转移至37 ℃水浴2 h，冰水冷却后，离心（12000×g，4 ℃，30 min），四层纱布过滤后取透过液。透过液经终浓度2.1~2.7 mol/L （NH4）2SO4盐析，所得沉淀立即用少量的缓冲液A溶解后置于透析袋中，以同缓冲液A在4 ℃充分透析以除去（NH4）2SO4，透析期间更换3次相同缓冲液。
1.2.3.3 柱层析分离纯化
透析后的粗酶液上样于预先以缓冲液A平衡的DEAE-Sepharose阴离子交换柱，采用含0~0.4 mol/L NaCl（800 mL）的缓冲液A作线性梯度洗脱，柱层析期间保持流速为1 mL/min。收集酶活力高且杂蛋白相对较少的组分在缓冲液B（50 mmol/L Tris-HCl，pH8.5）中充分透析。透析后上样于以缓冲液B预先平衡的Q-HP（Q-High Performance）柱，依次用含0.125 mol/L（200 mL）、0.25 mol/L（220 mL）和0.5 mol/L NaCl（125 mL）的缓冲液B进行梯度洗脱，柱层析期间保持流速为2 mL/min。收集酶活力较高的部分，选用30 kDa浓缩管置换至缓冲液A中，预先加入（NH4）2SO4至终浓度为1.4 mol/L，上样于Phenyl-HP（Phenyl-High Performance）柱，依次用含1.05 mol/L（20 mL）、0.70 mol/L （NH4）2SO4（35 mL）的缓冲液A进行洗脱，柱层析期间保持流速为2 mL/min。将活性组分收集进行SDS-PAGE验证纯度，并使用Western blot进行验证，而后立即用于酶学性质分析。
1.2.4 ACE2的活性测定
酶活力测定以MCA-APK为底物，参照Sriramula等[19]的方法并略作修改，具体方法如下：在黑色酶标板中，将17.5 µL待测酶液加入到80 µL 50 mmol/L Tris-HCl （pH7.0，含0.3 mol/L NaCl，10 µmol/L ZnCl2）中并混匀，立即加入2.5 µL底物MCA-APK使其终浓度为10 µmol/L。在酶标仪中37 ℃下避光反应30 min后，立即在激发波长320 nm，发射波长405 nm下测定反应所释放产物的荧光强度，以7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）标准溶液对反应产物进行定量。
一个酶活力单位（U）定义为每分钟释放1 nmol AMC所需的酶量。
1.2.5 蛋白含量测定
使用微量蛋白核酸测定仪测定蛋白样品在280 nm的吸光值，以标准浓度的牛血清白蛋白为对照。
1.2.6 ACE2的LC-MS/MS分析
纯化过程中，对ACE2的纯度进行SDS-PAGE分析。用考马斯亮蓝染液对最终纯化的ACE2凝胶进行染色，充分脱色后切胶回收目的蛋白条带，用LC-MS/MS进行氨基酸序列鉴定，该工作委托深圳市微纳菲生物技术有限公司完成。
1.2.7 猪肾ACE2酶学性质分析
1.2.7.1 温度对ACE2活性的影响
ACE2最适温度的测定：将适量的酶液在不同的温度下（15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）进行酶促反应，按照酶活检测方法，测定酶活。
ACE2热稳定性的测定：将适量的酶液与50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.0，含0.3 mol/L NaCl，10 µmol/L ZnCl2）混合后，置于不同温度下（0~70 ℃）孵育20 min，立即在冰水中冷却，按照酶活检测方法在37 ℃下测定ACE2的剩余酶活力。
1.2.7.2 pH对ACE2活性的影响
ACE2最适pH的测定：将适量的酶液在不同的pH条件下（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）进行酶促反应，按照酶活检测方法，在37 ℃下测定酶活。
ACE2的pH稳定性测定：将适量的酶液与不同pH的缓冲液混合后，置于4 ℃孵育30 min，按照酶活检测方法，在37 ℃，pH7.0下测定ACE2的剩余酶活力。
1.2.7.3 ACE2的热变性温度分析
采用圆二色谱法（Circular dichroism，CD）分析热变性和冷却复性过程中ACE2二级结构的变化。操作前将ACE2酶液置换至不含盐的缓冲液中，蛋白浓度为0.3 mg/mL，扫描温度范围为20~90 ℃，速率为0.5 ℃/min，以1 nm的光谱间隔从190~260 nm对样品进行测定。通过Global3软件对ACE2的热变性温度Tm进行预测。
1.2.7.4 金属离子对ACE2活力的影响
在ACE2酶液中，加入不同金属离子（Zn2+、Fe3+、Ca2+、Ba2+、Cu2+、Cd2+、Na+、Co2+、Mn2+）至终浓度为1 mmol/L。在4 ℃下孵育30 min后，立即按照酶活检测方法测定剩余酶活力。其中，对照组以50 mmol/L Tris-HCl （pH7.0）代替金属离子溶液。
1.2.7.5 抑制剂对ACE2活力的影响
将ACE2与不同蛋白酶抑制剂（EDTA，1,10-Phenanthroline，Pepstatin A，AEBSF，Leupeptin，E-64，Benzamidine）在常温下孵育30 min，然后测定其剩余酶活力。对照组不添加蛋白酶抑制。
1.2.7.6 PAS染色法鉴定糖蛋白
将纯化的ACE2上样于10% 的SDS-PAGE，电泳后，按照PAS染色试剂盒的说明对凝胶进行染色。
1.3 数据处理
采用Excel 2013软件对数据进行整理，应用GraphPad Prism 5软件进行绘图，使用Adobe Illustrator CS5处理图像，所有实验数据均重复3次进行测定，并取其平均值±标准差。
2. 结果与分析
2.1 ACE2在猪不同组织中的分布
利用Western blot法分析ACE2在猪不同组织中的分布。如图1，结果发现，ACE2按蛋白表达水平从多到少依次为肾，小肠，肝，胃；在脑、肺、大肠、胰脏中几乎没有ACE2的存在。王珊珊等[20]通过RT-PCR和免疫组化方法对仔猪不同组织中ACE2分布进行分析，结果显示ACE2 mRNA在仔猪肾脏、小肠及胃底中显著表达，另外在十二指肠、空肠及结肠中表达量较高，与本研究从蛋白水平分析的结果相似。
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图 1 ACE2在猪不同组织中分布的免疫印迹分析Figure 1. Western blot analysis of ACE2 distribution in different tissues of porcine2.2 ACE2的分离纯化与免疫印迹
在纯化时选用Triton-X100增加ACE2溶解性，经酸沉淀和硫酸铵盐析去除部分杂蛋白后得到ACE2粗酶液。ACE2粗酶液经DEAE-Sepharose阴离子交换柱初步纯化，收集活性较高且杂蛋白较少的组分，经透析后上样于Q-Sepharose强阴离子交换柱，在0.25 mol/L NaCl时目的蛋白被洗脱下来（图2）。活性组份继续上样于Phenyl Sepharose疏水柱，最终在0.7 mol/L （NH4）2SO4的洗脱部分酶活峰与蛋白峰重叠，获得目的蛋白（图2C）。SDS-PAGE分析显示，纯化蛋白分子量为98 kDa（图2D），Western blot表明抗ACE2单克隆抗体能与该蛋白产生特异性反应（图2E）。对ACE2的纯化结果如表1所示，从400 g猪肾实质中纯化得到0.6 mg ACE2，得率为0.1%，纯化倍数为149.8倍（表1）。
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图 2 ACE2的柱层析纯化、SDS-PAGE及免疫印迹分析注：A. DEAE-Sepharose；B. Q-Sepharose HP；C. Phenyl-Sepharose；D. SDS-PAGE；E. Western blot；M. 标准蛋白；1. 纯化的ACE2。Figure 2. Column chromatography purification, SDS-PAGE and Western blot analysis of ACE2表 1 猪肾ACE2纯化结果Table 1. Purification of angiotensin converting enzyme 2 from porcine kidney纯化过程 总蛋白（mg） 总酶活力（U） 比活力（U/mg） 得率（%） 纯化倍数 粗酶 60890.2 2406.8 0.04 100.0 1.0 酸沉淀 7856.6 595.2 0.08 25.0 1.9 硫酸铵盐析 780.1 320.5 0.41 13.3 10.4 DEAE-Sepharose 74.8 44.3 0.59 1.8 15.0 Q-Sepharose 29.7 21.1 0.71 0.9 18.0 Phenyl-Sepharose 0.6 3.0 5.99 0.1 149.8 2.3 ACE2的质谱鉴定
将纯化得到的ACE2蛋白条带切胶回收，经胰蛋白酶酶切后得到的多肽样品上样于LC-MS/MS，共得到41个肽段，含386个氨基酸残基。通过Uniprot下载的Sus scrofa蛋白数据库进行检索，得到的结果如图3所示，酶解后得到的41个肽片段与猪的ACE2（NP_001116542.1）序列高度一致，表明纯化的蛋白为猪ACE2。
2.4 ACE2的酶学性质分析
2.4.1 最适温度与热稳定性
ACE2的最适温度为40 ℃（图4A），该结果与多数哺乳动物体内的温度为35~40 ℃相对应，表明ACE2在该温度附近能够发挥其最高的酶活力。
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图 4 温度（A）和pH（B）对猪肾ACE2活性的影响Figure 4. Effect of temperature (A) and pH (B) on the activity of ACE2当温度在15~50 ℃时，ACE2的酶活力较为稳定，相对酶活在90%以上，而当温度升高至55 ℃时，ACE2的相对酶活开始下降，到60 ℃时下降至15%左右，到70 ℃时几乎完全丧失酶活，表明ACE2的耐热性较差（图4A）。
2.4.2 最适pH与pH稳定性
ACE2在pH7.0时的活性最高，当pH高于或低于7.0，ACE2的相对酶活明显下降，在pH10.0时酶活基本丧失，表明ACE2在中性偏酸的环境中更宜发挥其活性（图4B）。该结果与报道的在Sf9昆虫细胞中表达纯化的重组人ACE2的最适pH为6.5相似[5]。
对ACE2的pH稳定性分析发现，当pH在5.0~7.0的范围内，ACE2的稳定性较好，相对酶活保持在80%以上，pH为6.0时ACE2的活性最高。而当pH上升至10.0时ACE2的相对酶活仅有50%左右，表明其在中性偏酸的环境相对稳定（图4B）。
2.4.3 ACE2热变性分析
为了研究温度对猪ACE2二级结构的影响，对纯化ACE2进行圆二色谱扫描分析，扫描波长范围为190~260 nm。如图5所示，通过Global 3软件对ACE2的热变性温度（Tm）进行预测，其Tm值为（67.5±0.1） ℃，即当环境温度在67.5 ℃附近时，ACE2的氢键和范德华力会受到破坏，从而导致其构象开始发生变化（图5A）。图5B显示了加热前后以及回温后ACE2的结构变化，当温度升高至90 ℃时，与天然状态下即30 ℃时的二级结构对比有较大的差异，此时ACE2的二级结构已经被破坏，当温度回复至30 ℃时无法恢复至天然状态下的结构，表明90 ℃加热可导致ACE2的不可逆变性。
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图 5 圆二色谱法检测温度对ACE2结构的影响Figure 5. Effect of temperature on the structure of ACE2 as detected by CD spectrum2.4.4 金属离子对ACE2相对酶活的影响
金属离子对于酶的表达和调控具有重要的作用，某些金属离子对酶有催化作用，而一些金属离子，如重金属离子Cu2+、Pb2+等，在低浓度时会对某些酶产生抑制作用，高浓度时会使酶变性失活。表2总结了不同金属离子在同一浓度（1.0 mmol/L）下对ACE2酶活的影响，其中Zn2+、Na+、Co2+及Mn2+对ACE2的酶活有一定的激活作用，Zn2+的激活作用最强。Cd2+对ACE2的酶活有一定的抑制作用，Cu2+和Fe3+几乎能完全抑制ACE2的活性。
表 2 金属离子对ACE2活性的影响Table 2. Effect of metal ions on the activity of ACE2金属离子 浓度（mmol/L） 相对酶活力（%） Zn2+ 1.0 162.1±1.3 Na+ 1.0 112.7±0.8 Mg2+ 1.0 105.0±1.0 Ca2+ 1.0 100.1±0.5 Co2+ 1.0 97.7±0.9 Mn2+ 1.0 95.4±1.6 Cd2+ 1.0 87.7±0.3 Cu2+ 1.0 4.3±1.3 Fe3+ 1.0 0.0±0.0 对照 0.0 100.0±1.0 2.4.5 抑制剂对ACE2活性的影响
如表3，金属蛋白酶抑制剂EDTA，1,10-Phenanthroline几乎能完全抑制ACE2的活力，而其他抑制剂如丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF、Leupeptin及Benzamidine，胃蛋白酶抑制剂Pepstatin A，半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对ACE2的活力无明显影响。这些结果反映了ACE2具备金属蛋白酶特性，与Donoghue等[2]发现ACE2有潜在金属蛋白酶锌结合位点的结果类似。
表 3 抑制剂对ACE2活力的影响Table 3. Effect of inhibitors on ACE2 activity抑制剂 终浓度（mmol/L） 相对酶活力（%） 对照 − 100.0±1.8 EDTA 5.000 2.1±0.3 1,10-Phenanthroline 1.000 24.4±1.7 Pepstatin A 0.001 96.1±2.5 AEBSF 1.000 101.3±3.8 Leupeptin 0.010 109.1±4.1 Benzamidine 1.000 102.4±2.4 E-64 0.010 100.2±0.9 2.4.6 糖蛋白鉴定
目前对于糖蛋白的鉴定通常采用PAS染色法，即通过高碘酸与Schiff碱的氧化还原反应形成明显的红色复合物进行鉴别。对ACE2进行PAS染色鉴定是否为糖蛋白，结果如图6所示。ACE2（泳道3）与阳性对照二肽基肽酶（Dipeptidyl Peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ）（泳道1）同显示为一条红色条带，而阴性对照牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）（泳道2）则不显示红色条带，表明ACE2是糖蛋白。蛋白质的糖基化，除了结构特征不明显的O-糖基化外，还有结构特征为N-X-S（T）（X代表任何一种氨基酸）的N-糖基化，而ACE2中具有该结构特征的位点有多个（图3）。
3. 讨 论
前期对ACE2的研究工作中，Lin等[21]通过硫酸铵盐析，Q-Sepharose，Phenyl-Sepharose，DEAE-Sepharose，SP-Sepharose和Superose HR等多种柱层析结合的方法从人心脏左心室膜中分离纯化出了ACE2与整合素β1的复合物，分子量为130 kDa，但得率仅为0.0006%。该方法存在流程繁琐、得率低等问题。为了建立更加有效的天然ACE2纯化方法，本研究利用免疫印迹法从蛋白水平探究了猪不同组织中ACE2的分布差异。以ACE2蛋白水平最高的肾脏为原材料优化条件，采用Triton-X100增加ACE2溶解性，简化了柱层析步骤，最终实现了ACE2的高度纯化。纯化ACE2的分子量约为98 kDa，得率为0.1%。
不同物种的ACE2分子量在60~130 kDa不等[1,22-24]，其分子量的差异可归因于不同程度的糖基化。糖基化是蛋白质翻译后修饰的方式之一，在哺乳动物体内超过50%的蛋白质都会发生糖基化[25]。本研究纯化的猪ACE2在SDS-PAGE（图2D）及免疫印迹（图2E）中显示其分子量约为98 kDa，比重组猪ACE2（92 kDa）略高[16]，提示天然ACE2在合成及转运过程中可能发生了糖基化、磷酸化等翻译后修饰。PAS染色结果证实了猪ACE2是一种糖蛋白（图6）。实际上，蛋白质糖基化具有识别定位、稳定蛋白质构象和信息传递等作用[26]。
金属离子作为蛋白酶结构的一部分或作为酶激活因子，对蛋白酶的稳定性有重要的影响[27]。ACE2是锌离子蛋白酶家族成员，含有一段高保守的锌结合序列，本研究结果也表明Zn2+能显著激活其酶活性。质谱结果同样显示，ACE2的第374～378位氨基酸残基为HEMGH，该片段为ACE2的锌结合序列，与其功能和活性相关[28]。另外，第402位的谷氨酸高度保守，与第374位的组氨酸同为ACE2的锌离子配体[1]，Zn2+与ACE2的这些残基位点形成配位键，对ACE2的催化起重要作用。
蛋白质的结构和稳定性在决定其生理功能方面起着至关重要的作用[29]，影响其结构的外在因素主要有pH、温度、盐浓度等[30]。猪ACE2与ACE的热变性温度分别为67.5与58.5 ℃。当温度达到50 ℃时，ACE的活性急剧下降，而ACE2仍能保持90%的活性，表明ACE2的热稳定性更好[31]。蛋白酶的稳定性通常与自身的结构相关联，酶的活性位点是决定温度对酶的重要影响因素之一[32]。Towler等[33]对重组人ACE2胞外区域的晶体结构进行了解析，结果表明除了一些活性氨基酸被ACE2的某些氨基酸替代外，ACE的S2活性口袋被ACE2的Arg273覆盖，导致ACE2的活性区域比ACE狭小，这些区别使得两者在水解底物及其他性质方面有差异。作为与高血压密切相关的2种酶，分析ACE2与ACE在结构上的差异以及糖基化程度等，对于了解它们的酶学性质进而开发降血压产品具有重要意义。
4. 结 论
对猪不同组织比较发现，猪肾中ACE2含量最高，其分子量约为98 kDa，是一种典型的金属蛋白酶。ACE2的最适pH为7.0，最适温度为40 ℃，变性温度为67.5 ℃。ACE2含一个HEMGH锌离子结合域和第402位的谷氨酸锌离子结合配体。在锌离子存在下，其活性增加62%。部分金属离子如Cu2+、Fe3+和Cd2+对ACE2的活性有抑制作用。ACE2是糖基化蛋白，这也是其稳定性较好的一个因素。本研究为高效纯化天然ACE2提供了技术参考，为开发以ACE2为靶标的功能性食品提供了思路。
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图 1 ACE2在猪不同组织中分布的免疫印迹分析
Figure 1. Western blot analysis of ACE2 distribution in different tissues of porcine
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图 2 ACE2的柱层析纯化、SDS-PAGE及免疫印迹分析
注：A. DEAE-Sepharose；B. Q-Sepharose HP；C. Phenyl-Sepharose；D. SDS-PAGE；E. Western blot；M. 标准蛋白；1. 纯化的ACE2。
Figure 2. Column chromatography purification, SDS-PAGE and Western blot analysis of ACE2
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图 4 温度（A）和pH（B）对猪肾ACE2活性的影响
Figure 4. Effect of temperature (A) and pH (B) on the activity of ACE2
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图 5 圆二色谱法检测温度对ACE2结构的影响
Figure 5. Effect of temperature on the structure of ACE2 as detected by CD spectrum
表 1 猪肾ACE2纯化结果
Table 1 Purification of angiotensin converting enzyme 2 from porcine kidney
纯化过程 总蛋白（mg） 总酶活力（U） 比活力（U/mg） 得率（%） 纯化倍数 粗酶 60890.2 2406.8 0.04 100.0 1.0 酸沉淀 7856.6 595.2 0.08 25.0 1.9 硫酸铵盐析 780.1 320.5 0.41 13.3 10.4 DEAE-Sepharose 74.8 44.3 0.59 1.8 15.0 Q-Sepharose 29.7 21.1 0.71 0.9 18.0 Phenyl-Sepharose 0.6 3.0 5.99 0.1 149.8 
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表 2 金属离子对ACE2活性的影响
Table 2 Effect of metal ions on the activity of ACE2
金属离子 浓度（mmol/L） 相对酶活力（%） Zn2+ 1.0 162.1±1.3 Na+ 1.0 112.7±0.8 Mg2+ 1.0 105.0±1.0 Ca2+ 1.0 100.1±0.5 Co2+ 1.0 97.7±0.9 Mn2+ 1.0 95.4±1.6 Cd2+ 1.0 87.7±0.3 Cu2+ 1.0 4.3±1.3 Fe3+ 1.0 0.0±0.0 对照 0.0 100.0±1.0
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表 3 抑制剂对ACE2活力的影响
Table 3 Effect of inhibitors on ACE2 activity
抑制剂 终浓度（mmol/L） 相对酶活力（%） 对照 − 100.0±1.8 EDTA 5.000 2.1±0.3 1,10-Phenanthroline 1.000 24.4±1.7 Pepstatin A 0.001 96.1±2.5 AEBSF 1.000 101.3±3.8 Leupeptin 0.010 109.1±4.1 Benzamidine 1.000 102.4±2.4 E-64 0.010 100.2±0.9
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1. 郭湘蕾，陈凌利，陈慧，于传龙，王文君. 预制菜生产过程关键加工技术研究进展. 食品科技. 2024(08): 64-71 . 
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