Determination of Nine Kinds of Vitamin B Components in Healthy Food Vitamin B Tablets by HPLC
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摘要: 目的：建立高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）法测定B族维生素片中9种维生素B成分的含量。方法：样品中的叶酸经0.3%氨溶液超声提取，样品中的生物素、维生素B12和泛酸经水超声提取，样品中的维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸和烟酰胺经0.1%盐酸超声提取，经C18柱分离，以甲醇-0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相进行梯度洗脱，泛酸和生物素在205 nm波长处进行检测，维生素B1、维生素B2、烟酸和烟酰胺在256 nm波长处进行检测，维生素B6和叶酸在287 nm波长处进行检测，维生素B12在361 nm波长处进行检测。结果：9种成分能实现较好地分离，在各自线性范围内线性关系良好，决定系数R2均大于0.999，平均回收率为91.8%~106.9%，RSD为0.2%~4.8%，方法的检出限在0.05~4.7 mg/kg之间。结论：该方法操作快速简便、精密度和重复性好，能快速完成保健食品B族维生素片中9种维生素B成分的测定，并降低成本。Abstract: Objective: To establish a method for the determination of nine vitamin B components in vitamin B tablets by high performance liquid chromatography-diode array detector (HPLC-DAD). Method: Folic acid was ultrasonically extracted with 0.3% ammonia solution, biotin, vitamin B12 and pantothenate acid were ultrasonically extracted with water, the vitamins B1, B2, B6, niacin and nicotinamide were ultrasonically extracted by 0.1% hydrochloric acid, separated by C18 column with methanol-0.1 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution as the mobile phase for gradient elution. Pantothenate acid and biotin were detected at the wavelength of 205 nm, vitamins B1, B2, niacin and nicotinamide were detected at the wavelength of 256 nm, vitamins B6 and folic acid were detected at the wavelength of 287 nm, vitamins B12 was detected at the wavelength of 361 nm. Results: The results showed that the nine components could be separated well, and the linear relationship was good in their linear range. The average recoveries were 91.8%~106.9%, RSD were 0.2%~4.8%, and the detection limit of the method were 0.05~4.7 mg/kg. Conclusion: This method is rapid, simple, accurate and repeatable. It can quickly complete the determination of nine vitamin B components in health food vitamin B tablets and reduce the cost.
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Keywords:
- HPLC-DAD /
- vitamin B tablets /
- vitamins B1 /
- vitamins B2 /
- vitamins B6 /
- vitamin B12 /
- niacin /
- nicotinamide /
- folic acid /
- pantothenate acid /
- biotin
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水溶性维生素是人体维持正常生理功能所必需的一类微量有机物质，适量摄取对人的生长、代谢、发育都具有积极的促进作用[1-4] ，而过量摄入却会造成严重危害，如过量摄入维生素B6会对神经产生较大的不良影响，导致一些神经毒素的产生，并大幅度影响人们的肢体感官；维生素B1的大量使用会对人体的诸多新陈代谢环节产生很大的影响，最终导致人体产生头晕、恶心、心律失常、眼花等现象；维生素B12的过量使用也会导致人体另一种营养素叶酸的缺乏，同时导致心脏病患者病情的进一步加重[5]。由此可见，需要科学、合理地控制维生素的摄入量。
随着食品工业的发展和人们对保健食品需求程度的日渐提高，市场上出现了各类添加维生素B的保健食品，虽然已引起了质量监督部门极大的重视，但目前我国针对此类商品功效成分检测的相关标准[6-8]并未完善，在实际应用中只能参考食品标准或药典[9-16]。其中，GB/T 5009.197-2003在流动相中加入对柱效及泵损害较大的离子对试剂；GB 5009.84-2016用到气味较大的正丁醇，前处理需要繁琐的衍生化，并且测定时受衍生产物在4 h内稳定的限制；食品标准中测定烟酸、烟酰胺、叶酸、泛酸和生物素的仲裁法为微生物法，该方法普遍存在操作繁琐、测定时间长、测定误差大、测定结果重复性差等不足。这些方法并不适用于基质相对简单的保健食品，会降低待测组分的回收率。近年来，液相色谱-质谱联用检出限低，准确度高，备受科研人员的青睐[17-20]，但是质谱仪器价格较贵、日常维护费用也很高，很难在基层普及，另外，对于常量的维生素而言，容易污染仪器，造成仪器残留。文献报道[21-24]，用普通高效液相色谱法测定维生素B的并不少，但覆盖维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、泛酸、叶酸、生物素和维生素B12这9种常见成分进行含量测定的研究尚未见报道。
本研究旨在建立一种简便、快速、准确的高效液相色谱-二极管阵列（HPLC-DAD）检测方法，适用于保健食品B族维生素片中9种维生素B成分的含量测定，以期提高检测分析效率，并降低检测成本。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
10批B族维生素片 9批来自2018~2019年保健食品监督抽验样品，1批来自2017年保健食品委托检验样品；9种维生素标准品：维生素B1（纯度为97.9%）、维生素B2（纯度为98.2%）、维生素B6（纯度为98.2%）、烟酸（纯度为99.8%）、叶酸（纯度为89.3%）、泛酸钙（纯度为96.8%）、生物素（纯度为99.5%）、维生素B12（纯度为90.5%） 中国食品药品检定研究院；烟酰胺 纯度为99.5%，Dr. Ehrenstorfer GmbH；甲醇 色谱纯，霍尼韦尔国际公司；水 超纯水；其他试剂为分析纯 广州化学试剂厂。
Agilent 1260高效液相色谱仪-二极管阵列检测器 美国安捷伦公司； CPA224S 万分之一电子天平 德国赛多利斯集团；XS205DU 十万分之一电子天平 梅特勒-托利多集团；KQ-500DE 数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Milli Q Advantage with A10 超纯水发生器 默克密理博公司；LD5-2B 离心机 北京京立离心机有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液的配制
1.2.1.1 标准储备液
酸性储备液：精密称取维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸和烟酰胺各20 mg于100 mL容量瓶中，加适量0.1%盐酸，60 ℃超声（功率500 W，频率40 kHz）溶解，约10 min，放置至室温，用0.1%盐酸定容至刻度，摇匀，即得各成分浓度为200 μg/mL的酸性混合储备液。
碱性储备液：精密称取20 mg叶酸于100 mL容量瓶中，用0.3%氨溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为200 μg/mL的碱性储备液。
中性储备液：精密称取维生素B12 10 mg于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，即得200 μg/mL的维生素B12对照液。精密称取泛酸20 mg和生物素10 mg于100 mL容量瓶中，精密移取上述200 μg/mL的维生素B12对照液20 mL至此100 mL容量瓶中，再加适量水，超声溶解并定容至刻度，摇匀，即得泛酸浓度为200 μg/mL、生物素浓度为100 μg/mL、维生素B12浓度为40 μg/mL的中性混合储备液。
1.2.1.2 标准工作溶液
维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸和烟酰胺的标准工作溶液：精密吸取上述酸性混合储备液0.1、0.5、0.5、1.0、2.5、5.0 mL分别至20、20、10、10、10、10 mL的容量瓶中，用0.1%盐酸稀释至刻度，即得维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸和烟酰胺的混合标准工作溶液，经0.45 μm的水相微孔滤膜过滤，备用。
叶酸的标准工作溶液：精密吸取上述碱性储备液0.1、0.5、0.5、1.0、2.5、5.0 mL分别至20、20、10、10、10、10 mL的容量瓶中，用0.3%氨溶液稀释至刻度，即得叶酸的标准工作溶液，经0.45 μm的水相微孔滤膜过滤，备用。
维生素B12、泛酸和生物素的标准工作溶液：精密吸取上述中性混合储备液0.1、0.5、0.5、1.0、2.5、5.0 mL分别至20、20、10、10、10、10 mL的容量瓶中，用水稀释至刻度，即得维生素B12、泛酸和生物素的混合标准工作溶液，经0.45 μm的水相微孔滤膜过滤，备用。
1.2.1.3 标准曲线绘制
将标准工作溶液进样分析，分别以9种维生素B的浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，绘制系列标准曲线，进行线性回归，得到9种维生素B的标准曲线线性回归方程。
1.2.2 样品的前处理
1.2.2.1 维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺
称取混合均匀样品0.1 g至于50 mL离心管中，准确加入0.1%盐酸10 mL（个别样品超曲线范围进行适当稀释），摇匀，60 ℃超声（功率500 W，频率40 kHz）处理15 min，中途振摇一次，冷却至室温，摇匀，静置或离心（4000 r/min离心10 min），上清液经0.45 μm的水相微孔滤膜过滤，即得。
1.2.2.2 叶酸
称取混合均匀样品0.5 g至于50 mL离心管中，准确加入0.3%氨水10 mL，摇匀，60 ℃超声（功率500 W，频率40 kHz）处理15 min，中途振摇一次，冷却至室温，摇匀，静置或离心（4000 r/min离心10 min），上清液经0.45 μm的水相微孔滤膜，即得。
1.2.2.3 泛酸、生物素、维生素B12
称取混合均匀样品1 g至于50 mL离心管中，准确加入超纯水10 mL，摇匀，60 ℃超声（功率500 W，频率40 kHz）处理15 min，中途振摇一次，冷却至室温，摇匀，静置或离心（4000 r/min离心10 min），上清液经0.45 μm的水相微孔滤膜过滤，用于测定生物素与维生素B12，稀释10倍用于测定泛酸。操作过程应避免强光照射。
1.2.3 色谱条件
色谱柱：COSMOSIL C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流速：0.5 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；检测波长：泛酸和生物素：205 nm，维生素B1、维生素B2、烟酸和烟酰胺：256 nm，维生素B6和叶酸：287 nm，维生素B12：361 nm；检测器：二极管阵列检测器（DAD）；流动相：A为甲醇，B为0.1 mol/L的磷酸二氢钾，梯度洗脱：0.00~8.00 min，A由5%递增至20%，8.00~8.01 min，A由20%快速增至55%，8.01~16.00 min，A保持55%，16.00~17.00 min，A由55%递减至5%，17.00~28.00 min，A保持5%。
1.3 数据处理
方法学考察中重复性平行测定6份，回收率测定三组9份，适用性样品测定2份，采用Microsoft Office Excel 2007进行数据处理，结果以平均数表示。
2. 结果与分析
2.1 溶剂的选择
保健食品B族维生素片基质相对简单，其中的9种维生素B成分均为水溶性维生素，但化学结构并不相关，理化性质和色谱行为差异较大，所以要在同一个溶剂下同时测定B族维生素片的9种成分比较困难。维生素B12易溶于水和乙醇，在强酸（pH<2）和碱性溶液中易分解，导致其检测结果偏低[25-26]。维生素B1在酸性条件下稳定，在中性和碱性中稳定性差[27]。维生素B2、泛酸在碱性条件下不稳定，叶酸和泛酸在酸性条件下不稳定[28]。维生素B6在空气与酸性溶液中稳定，但在碱性溶液中易被破坏[29]。因此，本实验用酸溶液提取测定维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸和烟酰胺；用碱溶液提取叶酸；用水提取泛酸、生物素和维生素B12，以确保样品中的成分稳定，结果可靠。
本实验比较了盐酸含量为0.05%、0.1%、0.3%和0.5%对样品提取的影响，经试验，维生素B1随着盐酸含量增加，出峰时间提前，0.3%盐酸提取液中维生素B1开始有干扰（见图1），维生素B2、维生素B6和烟酰胺用0.1%盐酸提取比用0.05%盐酸提取效果稍好些，所以选用了0.1%盐酸作为维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸和烟酰胺的提取液。参照《中华人民共和国药典》（二部）叶酸“含量测定”项，叶酸用0.3%氨溶液作为提取溶剂。
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图 1 不同含量盐酸提取样品的液相色谱图注：A：0.05%盐酸提取液；B：0.1%盐酸提取液；C：0.3%盐酸提取液；D：0.5%盐酸提取液。Figure 1. Liquid chromatograms of samples extracted with different contents of hydrochloric acid2.2 提取条件的选择
比较了20、30、40、60 ℃各超声（功率500 W，频率40 kHz）处理15 min的样品中各成分的响应值，以20 ℃测得的响应值为基底，折算出20、30、40、60 ℃的相对峰面积（相对峰面积=不同温度提取的峰面积/20 ℃提取的峰面积×100），绘制柱形图，总的来说60 ℃条件下提取相对较好。再比较60 ℃超声（功率500 W，频率40 kHz）处理15、30、45、60 min的样品中各成分的响应值，以15 min测得的响应值为基底，折算出15、30、45、60 min的相对峰面积（相对峰面积=不同超声时间提取的峰面积/15 min提取的峰面积×100），绘制柱形图，结果显示差异不明显，所以确定提取条件为60 ℃超声15 min，见图2。
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图 2 不同温度（A）和不同超声时间（B）的提取效果比较Figure 2. Comparison of extraction effects at different temperatures (A) and ultrasonic time (B)2.3 流动相的选择
高效液相色谱法测定维生素B的标准及文献中很多用到了离子对试剂，离子对试剂平衡时间长，而且对柱子寿命影响比较大，所以本研究不考虑离子对试剂。参考标准，遴选出流动相中可以添加乙酸钠和磷酸二氢钾，本实验对乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙酸钠（0.05 mol/L）、甲醇-磷酸二氢钾（0.01 mol/L）、甲醇-磷酸二氢钾（0.05 mol/L）和甲醇-磷酸二氢钾（0.1 mol/L）不同流动相进行了考察。结果显示甲醇-乙酸钠（0.05 mol/L）体系中在205 nm波长下基线波动大，不利于泛酸和生物素的测定，乙腈-水和甲醇-水体系中有些成分难以被洗脱，甲醇-0.1 mol/L磷酸二氢钾体系的分离效果最好，为本实验的最终流动相，见图3。
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图 3 不同流动相体系下20 μg/mL混合标准品溶液的液相色谱图注：A: 甲醇-乙酸钠（0.05 mol/L）基线图；B：甲醇-磷酸二氢钾（0.05 mol/L）基线图；C:不同流动相下维生素B的色谱图（a~e分别为乙腈-水、甲醇-水、甲醇-磷酸二氢钾（0.01 mol/L）、甲醇-磷酸二氢钾（0.05 mol/L）和甲醇-磷酸二氢钾（0.1 mol/L））。Figure 3. Liquid chromatograms of 20 μg/mL mixed standard solution under different mobile phase systems2.4 流速与柱温的选择
固定柱温为28 ℃，比较了0.5、0.8、1.0 mL/min的出峰情况，实验结果显示，0.5 mL/min的条件下，叶酸和维生素B12的分离效果最好，其他成分之间的分离度都大于2，所以选用0.5 mL/min。分离度见表1。
表 1 不同流速和柱温的分离度Table 1. Resolution of different flow rates and columm temperatures成分 不同流速分离度（mL/min） 不同柱温分离度（℃） 0.5 0.8 1.0 20 25 30 35 维生素B1 / / / / / / / 烟酸 3.60 3.46 3.28 4.60 4.11 3.63 3.20 维生素B6 4.27 4.47 4.41 4.87 4.47 4.04 3.74 烟酰胺 13.42 12.64 11.99 14.05 13.85 13.46 13.10 泛酸 2.78 3.16 3.31 1.95 2.53 3.06 3.54 维生素B12 10.41 23.12 29.86 7.13 9.30 11.21 13.47 叶酸 2.03 1.61 1.43 2.60 2.30 2.01 1.69 生物素 3.45 2.80 2.40 3.17 3.35 3.52 3.61 维生素B2 2.40 2.76 3.05 2.30 2.37 2.43 2.54 注：分离度为相邻峰之间的分离度。 在0.5 mL/min的条件下，比较了柱温分别为20、25、30、35 ℃的出峰情况，实验结果显示，温度越低，叶酸和B12的分离度越大，20、25、30、35 ℃温度下叶酸和B12的分离度分别为2.60、2.30、2.01、1.69，但泛酸和烟酰胺20 ℃时的分离度为1.95<2，所以选用25 ℃。分离度见表1。
2.5 波长的选择
混合标准溶液经C18柱分离后，由二极管阵列检测器于190~550 nm波长范围内扫描，获得各化合物的吸收光谱图，维生素B1的光谱在242 nm处有强吸收峰，维生素B2的光谱在266 nm处有强吸收峰，烟酸、烟酰胺的光谱在260 nm处有强吸收峰，维生素B6的光谱在290 nm处有强吸收峰，叶酸的光谱在284 nm处有强吸收峰，维生素B12的光谱在361 nm处有强吸收峰，泛酸和生物素没有明显的强吸收峰，参考GB/T 22246-2008[7]在200 nm处测定泛酸，GB/T 17778-2005[30]在210 nm处测定生物素，为兼顾多种组分的同时检测，并综合考虑灵敏度等因素，泛酸和生物素的检测波长为205 nm，维生素B1、维生素B2、烟酸、烟酰胺的检测波长为256 nm，维生素B6和叶酸的检测波长为287 nm，维生素B12的检测波长为361 nm，标品的检测结果见图4。
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图 4 20 μg/mL混合标准品溶液的液相色谱图注：A~D分别为205、256、287、361 nm的色谱图。Figure 4. Liquid chromatograms of 20 μg/mL mixed standard solution2.6 方法学考察
2.6.1 方法的线性及方法检出限浓度
在试验条件下，对标准工作溶液进行测定。结果表明9种维生素B均在各自线性范围内有良好的线性关系，决定系数R2均大于0.999。取维生素B的标准品，以信噪比（S/N）3~5配制检出限溶液，按本方法最大取样量1 g，最小稀释倍数10，计算检出限（LOD）。见表2。
表 2 9种维生素B的线性回归方程、线性关系和LODTable 2. Linear regression equation,correlation coefficient and LOD of 9 kinds of vitamin B成分 线性方程 决定系
数（R2）检出限
（mg/kg）维生素B1 y=37.0699x−4.8520 1.0000 0.4 烟酸 y=28.2656x−10.7949 0.9999 0.6 烟酰胺 y=25.9636x+0.4596 1.0000 0.2 维生素B2 y=60.9041x+10.1378 1.0000 0.05 维生素B6 y=36.3405x+1.7111 1.0000 0.1 叶酸 y=77.6801x−3.5187 1.0000 0.1 泛酸 y=16.9963x−1.6844 1.0000 1.9 生物素 y=12.1273x+2.3880 1.0000 4.7 维生素B12 y=23.5442x−0.1077 1.0000 0.2 2.6.2 重复性
烟酰胺是烟酸的酰胺化合物，通常不会同时添加在同一样品中，所以通过样品1和样品2来完成9种成分的重复性试验。在相同的仪器条件下，按照1.2.2实验步骤，分别测得样品1中维生素B1、烟酰胺、维生素B2、维生素B6、叶酸、泛酸、生物素及维生素B12的含量，按照1.2.2.1实验步骤，分别测得样品2中烟酸的含量，结果表明重复性良好，其RSD见表3。
表 3 9种维生素B的重复性和稳定性（n=6）Table 3. Repeatability and stability of 9 kinds of vitamin B (n=6)成分 含量
（mg/g）重复性
RSD（%）稳定性时间
RSD（%）稳定性峰面积
RSD（%）维生素B1 3.7 0.7 0.3 0.5 烟酸 16.8 0.8 0.2 0.8 烟酰胺 18.4 1.0 0.1 0.4 维生素B2 4.1 0.5 0.1 0.8 维生素B6 3.9 0.6 0.6 0.5 叶酸 0.42 0.7 0.1 0.2 泛酸 8.5 1.0 0.2 0.2 生物素 0.053 1.0 0.1 0.5 维生素B12 0.0053 5.2 0.1 0.3 2.6.3 稳定性考察
在相同的仪器条件下，对同一混合标准工作溶液（20 μg/mL）进行0、1、2、4、8、16、24、36、48 h进样测定，可以看出9种维生素B保留时间稳定，峰面积的相对标准偏差（RSD）≤0.8%（n=9），结果表明，维生素B族9种成分48 h内的稳定性良好，其RSD见表3。
2.6.4 方法回收率
通过样品1和样品2来完成9种成分的回收试验。精密称取9份同批次样品1，按样品各成分含量约80%、100%、120%高中低三个水平加入各标准溶液，每个水平各3份样品，按照1.2.2实验步骤，分别测得样品1中三个水平的维生素B1、烟酰胺、维生素B2、维生素B6、叶酸、泛酸、生物素及维生素B12的浓度并计算回收率，精密称取9份同批次样品2，按样品烟酸含量约80%、100%、120%低中高三个水平加入烟酸标准溶液，每个水平各3份样品，按照1.2.2.1实验步骤，测得样品2中三个水平的烟酸浓度并计算回收率。结果显示平均回收率为91.8%~106.9%，RSD为0.2%~4.8%，可以满足维生素B族9种成分的检测要求，各回收率及RSD见表4。
表 4 9种维生素B的回收率Table 4. Recoveries of 9 kinds of vitamin B化合物 加标量（低）
（mg/kg）回收率
（%）RSD
（%）加标量（中）
（mg/kg）回收率
（%）RSD
（%）加标量（高）
（mg/kg）回收率
（%）RSD
（%）维生素B1 2502.3 101.8 0.8 3753.5 102.0 0.7 5421.7 103.0 0.2 烟酸 10144.7 104.3 0.2 16231.5 104.3 0.6 23332.7 105.9 0.7 烟酰胺 10326.1 99.4 1.1 18588.4 98.2 1.0 25815.3 99.3 0.4 维生素B2 2569.8 106.2 0.6 3953.5 106.9 0.4 5732.6 105.4 0.3 维生素B6 2237.4 104.7 1.2 3661.1 103.3 0.5 5288.3 104.0 0.3 叶酸 266.2 100.3 0.5 446.0 100.9 0.5 618.7 99.8 0.5 泛酸 4506.9 100.4 0.5 7511.5 100.9 0.9 10516.1 100.0 0.6 生物素 31.7 102.2 4.4 52.8 98.1 4.8 73.9 97.1 4.4 维生素B12 4.0 91.8 1.2 6.6 94.3 2.2 8.8 93.2 3.2 2.6.5 适用性
为考察方法的普遍适用性，采用本试验方法，对收集的9个品种10批次B族维生素片样品进行检测，并与检验标准规定的方法测定结果进行比较，2号和3号样品的检验标准并没有对维生素B6、叶酸、泛酸及维生素B12作要求，其它结果与本方法结果的相对偏差在允许范围内，表明本方法适用于B族维生素片中9种维生素B的含量测定，见表5。
表 5 10批样品的维生素B含量（mg/g）Table 5. Contents of vitamin B in 10 samples (mg/g)序号 维生素B1 烟酸 烟酰胺 维生素B2 维生素B6 叶酸 泛酸 生物素 维生素B12 1A 3.7 / 18.3 4.1 3.9 0.42 8.5 0.053 0.0053 1B 3.8 / 20.0 4.2 4.0 0.40 8.3 0.058 0.0056 1C（%） 1.3 / 4.4 1.2 1.3 2.4 1.2 4.5 2.8 2A 3.1 16.8 / 3.0 3.6 0.42 10.5 / 0.0050 2B 2.9 17.0 / 3.0 / / / / / 2C（%） 3.3 0.6 / 0.0 / / / / / 3A 3.2 16.5 / 2.9 3.6 0.45 11.1 / 0.0056 3B 3.5 16.5 / 3.2 / / / / / 3C（%） 4.5 0.0 / 4.9 / / / / / 4A 3.4 / / 4.3 3.5 0.57 / / / 4B 3.7 / / 4.3 3.4 0.55 / / / 4C（%） 4.2 / / 0.0 1.4 1.8 / / / 5A 2.3 / / 2.2 2.5 0.27 / / 0.0040 5B 2.5 / / 2.4 2.3 0.29 / / 0.0040 5C（%） 4.2 / / 4.3 4.2 3.6 / / 0.0 6A 17.6 / 32.2 16.5 10.0 0.46 22.7 / 0.0086 6B 16.9 / 35.5 16.5 9.1 0.42 20.8 / 0.0094 6C（%） 2.0 / 4.9 0.0 4.7 4.5 4.4 / 4.4 7A 15.8 / 57.0 22.5 10.6 0.36 15.8 / / 7B 17.5 / 53.3 20.7 11.7 0.40 17.2 / / 7C 5.1 / 3.4 4.2 4.9 5.3 4.2 / / 8A 3.2 / / 2.2 1.3 / / / 0.0021 8B 3.5 / / 2.0 1.3 / / / 0.0018 8C 4.5 / / 4.8 0.0 / / / 7.7 9A 16.0 / 74.5 24.0 10.1 0.42 25.1 / 0.0099 9B 17.2 / 81.0 26.1 11.1 0.41 22.8 / 0.0100 9C 3.6 4.2 4.2 4.7 1.2 4.8 / 0.5 10A 16.7 / 76.9 27.3 10.3 0.44 24.8 / / 10B 18.1 / 70.4 24.8 11.2 0.41 22.6 / / 10C 4.0 / 4.4 4.8 4.2 3.5 4.6 / / 注：A为本方法测定结果；B为标准测定结果；C为A与B的相对偏差SD（%）。 3. 结论
在本研究建立的HPLC色谱条件下，9种维生素B成分能得到较好的分离。线性、精密度、稳定性、重复性和回收率等试验结果表明，本方法灵敏、快速、准确，适用于保健食品B族维生素片中9种维生素B的含量测定。与目前的国家标准和文献报道的方法相比，在保证准确性好、灵敏度高的同时，尽可能省去了复杂的前处理，降低了检测成本，提高了检测效率。从实际样品的测定实验发现，个别产品（本实验中的2、3号样品）标签有添加维生素B6、叶酸、泛酸及维生素B12这几种成分，但企业标准中并没有作相应的要求，检验机构一般按标准检验，从而造成监管漏洞，该方法可快速测定B族维生素片中9种维生素B成分的含量，尤其适用于大批量的监督抽验，可为该类保健品质量标准的制定提供定量依据，为监督B族维生素类保健食品市场提供保障。
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图 1 不同含量盐酸提取样品的液相色谱图
注：A：0.05%盐酸提取液；B：0.1%盐酸提取液；C：0.3%盐酸提取液；D：0.5%盐酸提取液。
Figure 1. Liquid chromatograms of samples extracted with different contents of hydrochloric acid
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图 2 不同温度（A）和不同超声时间（B）的提取效果比较
Figure 2. Comparison of extraction effects at different temperatures (A) and ultrasonic time (B)
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图 3 不同流动相体系下20 μg/mL混合标准品溶液的液相色谱图
注：A: 甲醇-乙酸钠（0.05 mol/L）基线图；B：甲醇-磷酸二氢钾（0.05 mol/L）基线图；C:不同流动相下维生素B的色谱图（a~e分别为乙腈-水、甲醇-水、甲醇-磷酸二氢钾（0.01 mol/L）、甲醇-磷酸二氢钾（0.05 mol/L）和甲醇-磷酸二氢钾（0.1 mol/L））。
Figure 3. Liquid chromatograms of 20 μg/mL mixed standard solution under different mobile phase systems
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图 4 20 μg/mL混合标准品溶液的液相色谱图
注：A~D分别为205、256、287、361 nm的色谱图。
Figure 4. Liquid chromatograms of 20 μg/mL mixed standard solution
表 1 不同流速和柱温的分离度
Table 1 Resolution of different flow rates and columm temperatures
成分 不同流速分离度（mL/min） 不同柱温分离度（℃） 0.5 0.8 1.0 20 25 30 35 维生素B1 / / / / / / / 烟酸 3.60 3.46 3.28 4.60 4.11 3.63 3.20 维生素B6 4.27 4.47 4.41 4.87 4.47 4.04 3.74 烟酰胺 13.42 12.64 11.99 14.05 13.85 13.46 13.10 泛酸 2.78 3.16 3.31 1.95 2.53 3.06 3.54 维生素B12 10.41 23.12 29.86 7.13 9.30 11.21 13.47 叶酸 2.03 1.61 1.43 2.60 2.30 2.01 1.69 生物素 3.45 2.80 2.40 3.17 3.35 3.52 3.61 维生素B2 2.40 2.76 3.05 2.30 2.37 2.43 2.54 注：分离度为相邻峰之间的分离度。 
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表 2 9种维生素B的线性回归方程、线性关系和LOD
Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient and LOD of 9 kinds of vitamin B
成分 线性方程 决定系
数（R2）检出限
（mg/kg）维生素B1 y=37.0699x−4.8520 1.0000 0.4 烟酸 y=28.2656x−10.7949 0.9999 0.6 烟酰胺 y=25.9636x+0.4596 1.0000 0.2 维生素B2 y=60.9041x+10.1378 1.0000 0.05 维生素B6 y=36.3405x+1.7111 1.0000 0.1 叶酸 y=77.6801x−3.5187 1.0000 0.1 泛酸 y=16.9963x−1.6844 1.0000 1.9 生物素 y=12.1273x+2.3880 1.0000 4.7 维生素B12 y=23.5442x−0.1077 1.0000 0.2
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表 3 9种维生素B的重复性和稳定性（n=6）
Table 3 Repeatability and stability of 9 kinds of vitamin B (n=6)
成分 含量
（mg/g）重复性
RSD（%）稳定性时间
RSD（%）稳定性峰面积
RSD（%）维生素B1 3.7 0.7 0.3 0.5 烟酸 16.8 0.8 0.2 0.8 烟酰胺 18.4 1.0 0.1 0.4 维生素B2 4.1 0.5 0.1 0.8 维生素B6 3.9 0.6 0.6 0.5 叶酸 0.42 0.7 0.1 0.2 泛酸 8.5 1.0 0.2 0.2 生物素 0.053 1.0 0.1 0.5 维生素B12 0.0053 5.2 0.1 0.3
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表 4 9种维生素B的回收率
Table 4 Recoveries of 9 kinds of vitamin B
化合物 加标量（低）
（mg/kg）回收率
（%）RSD
（%）加标量（中）
（mg/kg）回收率
（%）RSD
（%）加标量（高）
（mg/kg）回收率
（%）RSD
（%）维生素B1 2502.3 101.8 0.8 3753.5 102.0 0.7 5421.7 103.0 0.2 烟酸 10144.7 104.3 0.2 16231.5 104.3 0.6 23332.7 105.9 0.7 烟酰胺 10326.1 99.4 1.1 18588.4 98.2 1.0 25815.3 99.3 0.4 维生素B2 2569.8 106.2 0.6 3953.5 106.9 0.4 5732.6 105.4 0.3 维生素B6 2237.4 104.7 1.2 3661.1 103.3 0.5 5288.3 104.0 0.3 叶酸 266.2 100.3 0.5 446.0 100.9 0.5 618.7 99.8 0.5 泛酸 4506.9 100.4 0.5 7511.5 100.9 0.9 10516.1 100.0 0.6 生物素 31.7 102.2 4.4 52.8 98.1 4.8 73.9 97.1 4.4 维生素B12 4.0 91.8 1.2 6.6 94.3 2.2 8.8 93.2 3.2
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表 5 10批样品的维生素B含量（mg/g）
Table 5 Contents of vitamin B in 10 samples (mg/g)
序号 维生素B1 烟酸 烟酰胺 维生素B2 维生素B6 叶酸 泛酸 生物素 维生素B12 1A 3.7 / 18.3 4.1 3.9 0.42 8.5 0.053 0.0053 1B 3.8 / 20.0 4.2 4.0 0.40 8.3 0.058 0.0056 1C（%） 1.3 / 4.4 1.2 1.3 2.4 1.2 4.5 2.8 2A 3.1 16.8 / 3.0 3.6 0.42 10.5 / 0.0050 2B 2.9 17.0 / 3.0 / / / / / 2C（%） 3.3 0.6 / 0.0 / / / / / 3A 3.2 16.5 / 2.9 3.6 0.45 11.1 / 0.0056 3B 3.5 16.5 / 3.2 / / / / / 3C（%） 4.5 0.0 / 4.9 / / / / / 4A 3.4 / / 4.3 3.5 0.57 / / / 4B 3.7 / / 4.3 3.4 0.55 / / / 4C（%） 4.2 / / 0.0 1.4 1.8 / / / 5A 2.3 / / 2.2 2.5 0.27 / / 0.0040 5B 2.5 / / 2.4 2.3 0.29 / / 0.0040 5C（%） 4.2 / / 4.3 4.2 3.6 / / 0.0 6A 17.6 / 32.2 16.5 10.0 0.46 22.7 / 0.0086 6B 16.9 / 35.5 16.5 9.1 0.42 20.8 / 0.0094 6C（%） 2.0 / 4.9 0.0 4.7 4.5 4.4 / 4.4 7A 15.8 / 57.0 22.5 10.6 0.36 15.8 / / 7B 17.5 / 53.3 20.7 11.7 0.40 17.2 / / 7C 5.1 / 3.4 4.2 4.9 5.3 4.2 / / 8A 3.2 / / 2.2 1.3 / / / 0.0021 8B 3.5 / / 2.0 1.3 / / / 0.0018 8C 4.5 / / 4.8 0.0 / / / 7.7 9A 16.0 / 74.5 24.0 10.1 0.42 25.1 / 0.0099 9B 17.2 / 81.0 26.1 11.1 0.41 22.8 / 0.0100 9C 3.6 4.2 4.2 4.7 1.2 4.8 / 0.5 10A 16.7 / 76.9 27.3 10.3 0.44 24.8 / / 10B 18.1 / 70.4 24.8 11.2 0.41 22.6 / / 10C 4.0 / 4.4 4.8 4.2 3.5 4.6 / / 注：A为本方法测定结果；B为标准测定结果；C为A与B的相对偏差SD（%）。
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