Effects of Walnut Pulp on the Cultivation Characteristics and Anti-hypoxia Potential of Lactobacillus rhamnosus Enriched with Selenium
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摘要: 为考察以核桃浆为原料开发廉价、高效的鼠李糖乳杆菌培养体系的可行性，本文用核桃浆代替MRS培养基中氮源，研究了核桃浆的颗粒度、料液比、用量、脱脂处理以及摇床转速对鼠李糖乳杆菌的生长、发酵液抗菌活性和抗氧化活性的影响，并用所得菌体经富硒处理后饲喂小鼠3 d，监测小鼠在暴露于低压缺氧条件下（海拔5000 m）6 h后的血细胞和血红蛋白含量，评价其抗缺氧潜力。结果发现，采用料液比为1:10 (g/mL)，经120目筛网过滤的去脂核桃浆完全替代MRS培养基中氮源（牛肉膏、蛋白胨），可使培养基成本降低70%，使菌体产量提高2.5倍（从2.6×109至7.6×109 CFU/mL），但不影响发酵液的抗菌活性和抗氧化活性（P>0.05）。连续口服富硒菌体3 d，可显著提高小鼠在低压缺氧条件下的血红蛋白含量（P<0.05），优于MRS培养基所得菌体。综上，用核桃浆能够完全代替MRS培养基中氮源用于培养鼠李糖乳杆菌，并能有效提高菌体产量和活性。Abstract: In order to develop a cheap and efficient culture system of Lactobacillus rhamnosus, walnut pulp was used to replace the nitrogen source in MRS medium. Taking cell growth as the indicator, the cultivation system was optimized in aspects of walnut pulp particle size, solid-liquid ratio, dosage, lipid removing treatment, and the shaking speed during the cultivation of Lactobacillus rhamnosus. The antibacterial activity and antioxidant activity of cell-free culture supernatant were also tested in all conditions. The obtained cells were also subjected to selenium enrichment treatment and then fed to mice for 3 d before they were exposed to simulated low-pressure hypoxia condition (altitude 5000 m) for 6 h to evaluate their anti-hypoxia potential. As results, complete replacement of the nitrogen source (beef extract and peptone) of MRS medium with the lipid-free walnut pulp filtered by 120 mesh screen at the solid-liquid ratio of 1:10 (g/mL) could reduce the cost of MRS medium by 70% and increase the cell yield by 2.5 times (from 2.6×109 to 7.6×109 CFU/mL), but did not affect the antibacterial activity and antioxidant activity of the fermentation broth (P>0.05). Continuous oral administration of selenium enriched bacteria for 3 days could significantly increase the hemoglobin content of mice when they were exposed to low-pressure hypoxia for 6 h (P<0.05), showing better effects than that cultivated in MRS medium. In conclusion, walnut pulp could be used to replace the nitrogen source in MRS medium for the culture of Lactobacillus rhamnosus, and effectively improve the cell growth and activity.
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鼠李糖乳杆菌是国内外批准可用于婴幼儿食品的少数益生菌之一，并且具有降血脂、提高免疫、治疗多重耐药菌感染所致腹泻、肠炎，降解呕吐毒素等多种生理功效[1-4]，应用前景好，市场需求量大。大规模、低成本地培养该菌是对其进行工业化生产和产业化应用的前提。乳酸菌肉汤培养基（MRS）是用于培养该菌的主要培养基，其中所用氮源主要是牛肉膏和蛋白胨[5]，原料成本高。
为降低乳酸菌的培养基成本，国内外学者进行了大量尝试。丛美楠[6]通过优化培养基配方，将保加利亚乳杆菌的培养基成本降低了4000 元/吨；曹炎[7]开发了以玉米面为主要成分的廉价培养基，使乳酸菌的培养基成本降低了86%；邓楚津等[8]用罗非鱼下脚料水解液代酵母膏，作为乳酸菌发酵产L-乳酸的氮源；Michalczyk等[9]用廉价的豌豆种子水解液作为左旋芽孢乳杆菌培养过程中的可代替氮源，提高了D乳酸的生物合成量；Polak-berecka等[10]通过优化培养基组成，不仅提高了鼠李糖乳杆菌的生物量，还使培养基成本降低了25%。本课题组开发了用玉米淀粉加工业的废弃物——玉米浆为碳源的鼠李糖乳杆菌的培养体系，在降低该菌培养成本的同时，有效地提高了菌体活性与产量[11]。考虑到核桃富含蛋白质，具备作为乳酸菌氮源的可能性；同时核桃中含有生育酚、植物甾醇和黄酮类化合物等活性物质[12-14]，可能会有利于鼠李糖乳杆菌的活性功能的提升，本文拟探讨用核桃浆代替MRS培养基中氮源，进一步降低培养基成本的可能性。
此外，鉴于核桃浆具有抗氧化活性，鼠李乳杆菌具有抗菌活性，以及课题组前期发现鼠李乳杆菌能够提高小鼠在低压缺氧环境下的血红蛋白水平，推测其有抗缺氧能力。根据已有报道，很多具有抗氧化活性的活性成分、益生菌，以及富硒益生菌（如富硒干酪乳杆菌）都有一定的抗缺氧能力[15-16]。近年来，一些研究指出，富硒处理能够有效提高微生物的抗氧化活性[17-19]。据程远之[17]报道，富硒处理能够显著提高芽孢杆菌对四种自由基的清除能力，以及对肠上皮细胞的抗氧化能力；Liu等[18]发现，富硒处理提高了酵母对氧化胁迫下的仔猪免疫功能和抗氧化能力；Hamid等[19]发现，将富硒酵母和阿拉伯胶联用，能够进一步减轻四氯化碳中毒大鼠的氧化性肝损伤。由此推测，富硒处理可能会进一步加强鼠李糖乳杆菌的抗氧化活性，进而提高其抗缺氧能力。另外，根据徐颖等[20]研究报道，通过优化生产工艺，可以有效提高鼠李糖乳杆菌的富硒量和富硒率。综合现有报道推测，使用本身就具有一定抗氧化活性的核桃浆代替MRS培养中氮源，可能会进一步提高鼠李糖乳杆菌的抗氧化活性和抗缺氧能力。
为了验证上述假设，本文较为系统地考察了用不同浓度、颗粒度、用量的核桃浆代替MRS培养中氮源，以及核桃浆中脂肪的去除与否和摇床转速对鼠李糖乳杆菌的菌体产量、发酵液抗菌活性和抗氧化活性的影响，优化得到了提高鼠李糖乳杆菌产量的最佳条件，可为该菌的高效、低成本培养提供参考与借鉴；并且对比分析了用核桃浆培养的鼠李糖乳杆菌及其在富硒前后对小鼠暴露于低压缺氧环境（海拔5000 m）6 h后血红蛋白含量和血细胞含量的影响，评价了其抗缺氧潜力，可为其抗缺氧功能的开发利用提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus SHA113由本实验室前期从健康母乳中分离所得，目前保存于武汉典型微生物研究所，菌种编号为CCTCCM2017839[21]；大肠杆菌Escherichia coli ATCC 25922（E. coli ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213（S. aureus ATCC 29213）、沙门氏菌Salmonella typhimurium ATCC 50551（S. typhimurium ATCC 50551） 用作抗菌活性评价的指示病原菌；核桃果实 市售干燥的混合核桃品种，陕西省西安市农贸市场；蛋白胨、牛肉膏、Luria-Bertani（LB）培养基、乳酸菌肉汤培养基（MRS培养基） 北京奥博星生物科技有限责任公司；酵母提取物 英国Oxoid；磷酸氢二钾、葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰 均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；柠檬酸氢二铵、乙酸钠、吐温-80、氢氧化钠、亚硒酸钠 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉 北京索莱宝生物科技有限公司；脱脂奶粉 内蒙古伊利事业集团股份有限公司；120、150、180目筛网 绍兴市上虞区宇鼎标准筛具厂；SPF级昆明（KM）种小鼠 72只，雄性，4周龄，体质量18～22 g，购自西安交通大学实验动物中心，动物许可号：SCXK（陕）2018-001，在进入低压氧舱前，于动物室内标准条件下饲养，自由饮水和采食标准小鼠饲料。
MLS-3781高压蒸汽灭菌锅 日本三洋集团；SW-CJ-1C无菌超净工作台、HS-200破壁机 中山市海尚电器有限公司；BB15细菌培养箱 赛默飞世尔科技有限公司；PB-10/C pH计、BL610精密天平 德国Sartorius公司；Synergy HT多功能酶标仪 美国伯腾仪器；C165048高速离心机 美国BD公司；TF-FD-27真空冷冻干燥机 上海田枫实业有限公司；FLYDWC50-II低压低氧动物实验舱 贵州风雷航空军械有限责任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株培养
1.2.1.1 鼠李糖乳杆菌的活化与培养
取出保存于−80 ℃的L. rhamnosus SHA113（CCTCCM2017839，保存于中国典型培养物保藏中心），用MRS固体培养基，在37 ℃下平板倒置培养48 h，挑取形成的单菌落接种于5 mL MRS肉汤培养基中，于37 ℃恒温培养箱中静置，维持低溶氧条件，培养48 h；待菌体浓度达到109 CFU/mL（根据平板计数法检测结果与OD600 nm的吸光度间的标准曲线，由OD值进行推算而得），停止培养。
1.2.1.2 病原菌的活化与培养
取出保存于−80 ℃的E. coli ATCC 25922、S. aureus ATCC 29213和S. typhimurium ATCC 50551，用LB固体培养基中，在37 ℃下培养24 h，挑取形成的单菌落接种于5 mL LB肉汤培养基中于37 ℃、200 r/min条件下培养24 h，使菌体浓度达到109 CFU/mL（根据平板计数法检测结果与OD600 nm的吸光度间的标准曲线，由OD值进行推算而得），停止培养。
1.2.1.3 发酵上清液的收集
取培养至109 CFU/mL的鼠李糖乳杆菌的发酵培养物，经4 ℃、8000 r/min离心10 min，收集发酵上清液，备用。
1.2.1.4 菌悬液的制备
取上述培养至109 CFU/mL的鼠李糖乳杆菌的发酵培养物，经4 ℃、8000 r/min离心10 min，收集菌体沉淀，用生理盐水洗涤三次后，重新用生理盐水悬浮至其浓度为1×109 CFU/mL。
1.2.2 核桃浆的制备
取核桃仁适量，在8 g/L的NaOH溶液中煮沸3 min，得到脱皮核桃仁，用清水清洗后，根据实验设计，加入不同量的水置于食物料理机中打浆，经设定目数的筛网过滤，得核桃浆备用。
1.2.3 核桃浆对鼠李菌乳杆菌培养特性的影响
改变培养基中核桃浆的不同参数，培养基用量均为100 mL（250 mL三角瓶），灭菌后，按照1%的接种量接入上述制备好的鼠李糖乳杆菌培养物，然后在37 ℃的条件下静置培养（除摇床转速的实验外）48 h后，用平板计数法分析发酵物中菌体浓度，用pH计检测发酵液的最终pH，用抑菌圈法检测发酵液的抑菌活性。以活菌数、发酵液pH和抑菌圈大小为评价指标，探究不同因素对菌体生长量和生物活性的影响，考察不同因素影响时所设条件如下。
1.2.3.1 核桃浆料液比的影响
制备核桃浆的过程中，控制核桃仁与加水量的比例分别为1:5、1:7、1:10 g/mL，打浆后，按照20%体积比例加入MRS完全培养基中，灭菌后接种鼠李糖乳杆菌，静置培养。
1.2.3.2 核桃浆颗粒度的影响
固定核桃浆的料液比1:10 （g/mL），分别过120、150和180目筛网的核桃浆，按照20%体积比例加入去除氮源（牛肉膏、蛋白胨）的MRS培养基中，灭菌后接种鼠李糖乳杆菌，静置培养。
1.2.3.3 核桃浆用量的影响
固定核桃浆的料液比1:10 （g/mL），过120目筛，用核桃浆分别替代MRS中100%、80%、40%氮源（牛肉膏、蛋白胨），按照20%体积比例加入MRS培养基中，灭菌后接种鼠李糖乳杆菌，静置培养。
1.2.3.4 核桃浆去脂的影响
根据优化结果，按照料液比1:10 （g/mL）、过120目筛、完全替代MRS培养基氮源的方法制备核桃培养基，灭菌处理后，在无菌操作条件下，弃去上层脂肪，以不去除脂肪的培养基为对照，接种后静置培养。
1.2.3.5 摇床转速的影响
在上述MRS培养基，去脂和不去脂培养实验设计中，分别采用静置培养和在100 r/min转速下进行轻微供氧的方式下进行培养，考察是否供氧对菌体生长量和生物活性的影响。
1.2.4 鼠李糖乳杆菌的活菌数分析
菌体培养结束后，摇匀后吸取100 μL培养物，分别稀释10−2、10−4、10−5、10−6后，用涂布法接种于MRS固体平板中，经37 ℃静置培养48 h后，统计合格稀释度下的平板菌落后，计算培养物中菌体浓度[11]。
1.2.5 pH测定
采用pH计进行测定，每组样品测量三次。
1.2.6 抑菌活性分析
采用抑菌圈法进行检测，以E. coli ATCC 25922、S. aureus ATCC 29213和S. typhimurium ATCC 50551为指示菌株[22]。准确吸取100 μL浓度为1×106 CFU/mL的指示菌株，涂布于LB固体培养基中，再吸取100 μL浓度为1×109 CFU/mL的鼠李糖乳杆菌发酵液上清，置于孔径为6 mm的孔中，在37 ℃静置培养10 h后，测量抑菌圈直径（mm），分析其抑菌活性。
1.2.7 抗氧化活性分析
取培养后的鼠李糖乳杆菌培养物，在8000 r/min离心5 min，取上清液备用。参考文献[23]，用DPPH自由基清除能力评价上清液的抗氧化活性。实现时，准确称取8 mg DPPH，加入无水乙醇，定容至100 mL，避光放置，现配现用。取100 μL所得发酵液上清与100 μL乙醇DPPH溶液混合，对照为100 μL乙醇与100 μL乙醇DPPH溶液的混合物，置于96孔板中室温黑暗孵育30 min后，检测其在517 nm处吸光度，按照公式（1）计算DPPH自由基的清除率：
清除率(%)=[1−(Ai−Aj)Ac]×100 (1) 式中：Ac表示100 μL无水乙醇+100 μL DPPH在517 nm处吸光度值；Ai表示100 μL待测样品+100 μL DPPH在517 nm处吸光度值；Aj表示100 μL待测样品+100 μL无水乙醇在517 nm处吸光度值。
1.2.8 可溶性蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝法[24]进行测定。配制0.5 mg/mL的BSA蛋白质标准液。检测时，分别移取标准液0、1、2、4、8、12、16、20 μL，不足20 μL体系中用PBS补足至20 μL。每孔加入200 μL考马斯亮蓝G250，室温放置5 min后，于595 nm波长处测定反应体系的吸光度值（A）。以浓度（C）为横坐标，得到标准曲线的回归方程为A=0.0587c+0.3138，决定系数R2=0.9608。将待测液释至合适浓度，按上述步骤加入考马斯亮蓝，于595 nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算可溶性蛋白含量。
1.2.9 总糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[25]测定总糖含量。配制0.02 mg/mL的葡萄糖标准溶液。检测时，分别移取浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL的标准液于试管中，不足1 mL的反应体系中，用水溶液补至1 mL。先加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀；再加入浓硫酸5 mL，摇匀。反应10 min后，以水作参比液调零，于490 nm波长处测定吸光度值（A）。以浓度（C）为横坐标，得到标准曲线的回归方程为A=5.254c+0.1252，决定系数R2=0.9945。取待测液1 mL于试管中，按上述步骤加入苯酚和浓硫酸，于490 nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算总糖含量。
1.2.10 富硒鼠李糖乳杆菌的制备
将MRS培养36 h的菌体发酵液，以及用核桃浆完全替代MRS中氮源培养36 h的菌体发酵液，按照终浓度为3 mmol/L加入一定量的100 mmol/L亚硒酸钠母液，在37 ℃下继续静置培养24 h，再将整个培养物在8000 r/min下离心10 min，取沉淀部分用无菌水清洗三次后，得到富硒鼠李糖乳杆菌。按照来自每100 mL发酵液的菌体量混合1 g奶粉的剂量加入脱脂奶粉作为保护剂，经真空冷冻干燥24 h后，得富硒鼠李糖乳杆菌制剂。按照每300 g小鼠普通饲料中加入6 g菌剂的比例，制备成小鼠饲料；在普通饲料中加入与菌剂中奶粉和核桃剂量相同的奶粉或核桃，作为对照饲料。所有饲料在4 ℃下贮存，并在一周内用完。
菌体中硒含量的测定：参考GB 5009.93-2017《食品安全国家标准 食品中硒的测定》的第一法氢化物原子荧光光谱法测定[26]。
1.2.11 富硒菌的模拟胃肠液活性分析
模拟胃肠液的配置：根据中国药典中配置人工胃液、人工肠液所示方法。
将在MRS培养基中培养的菌体和富硒菌，以及在核桃浆培养基中培养的普通菌和富硒菌的菌悬液加入到模拟胃肠液中，测定经过模拟胃肠液消化后各组体外的抗氧化活性的变化。将1 mL菌悬液加至9 mL模拟胃液中，混合均匀，于37 ℃条件下孵育4 h。然后将1 mL孵育后的菌液和模拟胃液的混合溶液，加入到9 mL模拟肠液中，混合均匀，于37 ℃条件下孵育4 h[27]。然后按照1.2.7中的方法测定经过模拟胃肠液消化后菌悬液的DPPH自由基清除率。
1.2.12 小鼠抗缺氧实验
试验动物分组：实验共采用72只雄性昆明小鼠。对小鼠进行为期7 d的预养，自由饮食，不做任何处理，使小鼠适应饲养环境。随后随机分成6个处理组，每组12只，其中6只置于常规环境，6只置于低压氧舱（海拔高度5000 m）。各组间小鼠初始体重无统计学差异（P>0.05）。动物房饲养条件为，温度20~25 ℃，相对湿度40%~70%。
实验组小鼠：采用自由进食的方式，饲喂3 d。饲喂普通饲料（CK组），饲喂仅添加奶粉的饲料（M组）、仅添加核桃的饲料（W组）、添加MRS培养基所得鼠李糖乳杆菌的饲料（L组）、添加用MRS培养基所得菌体制备的富硒菌饲料（SL组），以及用含核桃浆培养基所得菌体的富硒菌饲料（SLW组）。
抗缺氧实验：每组小鼠在进舱前，对6只暴露于常规环境的小鼠取血；另外6只经低压氧舱处理6 h后取血。
血液采取与检测：采用腹腔注射戊巴比妥钠（5 mg/100 g BW）的方法麻醉小鼠。5 min后，通过眼球取血法采集小鼠血液（约0.1 mL），置于EDTA抗凝管中，用血液学分析仪分析其中各种血细胞的绝对数量或百分比，主要包括血红蛋白（Hemoglobin Count，HGB）、平均血红蛋白浓度（Mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、红细胞数（Red Blood Cell Count，RBC）、白细胞数（White Blood Cell Count，WBC）、中性粒细胞（Neutrophils，NEUT）、淋巴细胞（Lymphocytes，LYMPH）。
1.3 数据处理
将所得实验数据，用GraphPad Prism 8绘制图形。使用SPSS 25.0分析不同组之间的统计差异。单因素实验组数据用ANOVA分析方法，双因素实验组数据用双向方差分析进行组间和组内分析，独立实验组数据用均值±SEM（均值标准误差）的Tukey法进行检验。分析各组数据在P<0.05水平上的差异显著性。指标检测设三个重复，小鼠实验每组6只。
2. 结果与分析
2.1 核桃浆对鼠李糖乳杆菌生长特性的影响
2.1.1 核桃浆料液比的影响
如图1所示，随着核桃浆料液比的减小，鼠李糖乳杆菌的生长量不断增大，在制备核桃浆时所用料液比为1:10 g/mL时达到最大值3.3×109 CFU/mL，显著高于MRS培养基活菌数（P<0.05）。由此说明，核桃浆料液比过高时并不利于菌体的生长，这可能是因为核桃浆引入的过多脂肪和蛋白质不利于菌体的生长。为此，后续实验中均采用料液比为1:10 g/mL的方法制备核桃浆，并在其基础上进一步优化培养基组成与培养条件。
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2.1.2 核桃浆颗粒度的影响
控制所用核桃浆的过筛目数，可以改变其中的物质颗粒度。由图2A可以看出：当用核桃浆完全代替MRS培养基中的氮源（牛肉膏、蛋白胨）时，使用120目和180目核桃浆所得培养物中活菌数显著高于无核桃浆的MRS培养基（P<0.05）；并以用120目核桃浆培养系中的活菌数更高，可达3.2×109 CFU/mL。图2B显示，不同目数的核桃浆对发酵液pH无显著影响（P>0.05），说明核桃浆的使用对菌体的产酸能力没有显著影响。图2C~图2E显示，与对照组相比，不同目数核桃浆的加入也不影响鼠李糖乳杆菌发酵液上清对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。由此说明，核桃浆的使用也不会影响鼠李糖乳杆菌代谢产生抑菌活性物质的能力。考虑到菌体生长量较高，采用120目的核桃浆进行后续的培养条件优化。
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图 2 核桃浆颗粒度对鼠李糖乳杆菌生长和发酵液抑菌活性的影响注：A.培养物中活菌数；B.发酵液pH；C~E为发酵液上清对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。Figure 2. Effects of walnut pulp grain size on the cell growth of Lactobacillus rhamnosus and the antibacterial activity of cell-free fermentation liquid2.1.3 核桃浆含量的影响
用核桃浆替代MRS培养中全部，或者部分蛋白胨、牛肉膏后，培养鼠李糖乳杆菌，所得结果如图3所示。从中可以看出，用核桃浆提供MRS培养基中40%和80%的氮源时，能显著提高培养物中菌体数量（图3A），并显著降低发酵液的pH（图3B）（P<0.05），但对发酵液的抗氧化活性（图3C）和抗菌活性（图3D~图3F）均无显著影响（P>0.05）。这说明，核桃浆的使用会提高菌体的产酸量，可能会有利于其对肠道菌群的调控作用。已有大量研究报道，鼠李糖乳杆菌可以著显增加小鼠粪便中短链脂肪酸含量。短链脂肪酸能够为结肠细胞提供能量并增强肠道屏障作用，调节肠腔内的pH，参与宿主免疫调节等[28-29]。同时，鼠李糖乳杆菌也能够通过改变肠道菌群组成，如显著提高丙酸和丁酸产生菌丰度，提高肠道菌群的多样性[30]。此外，用核桃浆替代培养基中蛋白胨、牛肉膏，还能有效降低菌体的生产成本。
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图 3 核桃浆含量对鼠李糖乳杆菌生长和发酵液活性的影响注：A.培养物中活菌数；B.发酵液pH；C~F为发酵液上清的抗氧化活性及其对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。Figure 3. Effects of walnut pulp content on the growth of Lactobacillus rhamnosus and the activity of liquid culture supernatant2.1.4 核桃浆中脂肪的影响
培养基中脂肪的存在通常会影响微生物的发酵过程。一方面，脂肪能够起到乳化作用，有利于消除有氧发酵过程所产气泡；另一方面，脂肪漂浮在发酵液上面，会阻隔氧气与菌体的接触。如图4A所示，去除核桃浆中脂肪，能够显著（P<0.05）提高发酵液中鼠李糖乳杆菌产量，可达7.6×109 CFU/mL；同时，也有利于菌体产酸；但对发酵液的抗氧化活性和抗菌活性无显著影响（P>0.05）。此外，从图中还可以看出，控制摇床转速为100 r/min时有助于增加菌体产量，但对其产酸、抗氧化活性和抗菌活性无显著影响（P>0.05）。相对而言，适当的摇床转速对无脂肪核桃浆发酵体系中菌体数量的增加更为显著。这是因为，鼠李糖乳杆菌并非严格厌氧菌，一定量的溶解氧不会对其产生致死作用，但是由低转速提供的搅拌作用会有肋于增加菌体与培养基中营养成分间的接触，从而提高菌体对营养物质的利用率，进而促进了菌体生长。
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图 4 摇床转速和核桃浆的去脂处理对鼠李糖乳杆菌生长与特性的影响注：A.培养物中活菌数；B.发酵液pH；C~G为发酵液上清的抗氧化活性及其对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。Figure 4. Effects of shaking speed and fat removing treatment on the growth and characteristics of Lactobacillus rhamnosus综上所述，去除核桃浆中脂肪和适当调节摇床转速都有利于鼠李糖乳杆菌的菌体生长，但不会对其产酸、抗氧化活性、抗菌活性等产生不利影响。因此，采用去脂核桃浆完全代替MRS培养基中氮源来培养鼠李糖乳杆菌是可行的。
2.2 培养基中营养成分的利用情况
从本质上讲，核桃浆之所以能够替代MRS培养中牛肉膏和蛋白胨之类的氮源，甚至是促进了鼠李糖乳杆菌的生长，是因为它提供了菌体生长所需要的营养成分。为此，本文测定了MRS培养基和优化后的核桃浆培养基中可溶性蛋白质含量和总糖含量在菌体前后的变化情况，结果如表1所示。从中可以看出，核桃浆培养基中可溶性蛋白质含量在菌体培养前为0.4 mg/mL，是MRS培养基2倍多，但在菌体培养后低于MRS培养基，利用率可达80%，而MRS培养基中蛋白质的利用率只有33.3%。由此说明，鼠李糖乳杆菌可以有效利用核桃浆中的蛋白质，这也是其能够用于替代MRS培养基中氮源的主要原因。同时，与MRS培养基中原有氮源牛肉膏和蛋白胨相比，核桃浆的价格和成本要低很多。按照各物质机有的市场价计算，用核桃浆的成本是用牛肉膏和蛋白胨的30%，仅此一项比MRS培养基的成本降低了70%。
表 1 培养基中主要营养成分含量在菌体培养前后的变化Table 1. Chang of nutrient contents in the medium before and after bacterial cultivation培养基 可溶性蛋白质含量（mg/mL） 总糖含量（mg/mL） 菌体培养前 菌体培养后 菌体培养前 菌体培养后 MRS 0.18±0a 0.12±0.01a 2.51±0.07a 1±0.01a 核桃浆 0.4±0.1b 0.08±0.04a 2.26±0.01a 1±0.04a 注：同一列中的不同字母表示数据的t检验具有显著性差异（P<0.05）。 核桃浆培养和MRS培养中的总糖含量在菌体培养前后，均无显著性差异（P>0.05）。由此说明，核桃浆的使用并没有影响菌体对培养基中碳源的利用率。目前，也有用可食用植物和动物乳制品，如糙米乳[31]、大豆乳[32]以及驼乳、牛乳[33]等生产益生菌的一些研究。与MRS培养基相比，这些方法更适合用于食品领域。在节约成本的同时，这些天然动植物原料中的其它营养成分也可以进入益生菌的培养物，从而在功能活性方面起到多重复合效应。
2.3 核桃浆培养所得富硒菌体对模拟胃肠液的耐受性
有研究指出，乳酸菌能够将无机硒转化成有机硒，降低其毒性，使其更易于被吸收，同时提高菌体的抗氧化活性[34]。将核桃浆培养所得鼠李糖乳杆菌与无机硒进行共同孵育后，可得富硒菌体（图5A、图5B）。图5C显示，核桃浆培养所得富硒菌中的硒含量低于用MRS培养基所得菌体，但是其初始菌悬液的体外抗氧化活性显著高于后者（P<0.05）（图5D），这可能是这是因为核桃浆本身就具有抗氧化性所致。所有菌体，无论是富硒还是原始菌在模拟胃肠液条件下的抗氧化活性无显著差异（P>0.05）（图5D），说明富硒处理并不能增强菌体在模拟体内环境下的抗氧化活性。
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图 5 富硒处理对鼠李糖乳杆菌氧化活性的影响注：A.菌体富硒过程中的状态变化；B.冻干富硒菌粉；C.富硒菌中的硒含量；D.不同培养条件所得菌悬液在不同条件下的抗氧化活性；MRS菌：MRS培养基所得菌体；MRS富硒菌：MRS培养基所得富硒菌；核桃菌：核桃浆培养基所得菌体；核桃富硒菌：核桃浆培养基所得富硒菌；*表示在P<0.05水平上差异显著。Figure 5. Effects of selenium enrichment on the antioxidant capacity of Lactobacillus rhamnosus cells用MRS培养基所得原始菌和富硒菌在模拟胃液中的抗氧化活性高于体外条件，但其在模拟肠液中的抗氧化活性低于体外条件，而且在肠液中的抗氧化活性远远低于模拟胃液条件。然而，核桃浆培养所得原始菌和富硒菌在模拟胃肠液条件下的抗氧化活性均低于体外条件，而且在模拟肠液中的活性更低。
总体而言，与MRS培养基所得菌体相比，核桃浆的使用能够显著提高菌体的体外抗氧化活性，但对其在模拟胃肠液条件下的抗氧化活性无显著影响（P>0.05）；与不富硒的菌体相比，富硒不能增强菌体在体外和模拟胃肠液条件下的抗氧化活性。这可能是因为没有对菌体进行破碎操作，菌体内的硒未能释放出来所致。就体外抗氧化活性而言，MRS培养基所得菌体和富硒菌体在模拟胃液条件下的抗氧化活性有显著增大（P<0.05），说明所得菌体在该条件下会有所破损，从而导致菌体内抗氧化活性物质释放。然而，硒的抗氧化活性依然没有体现出优势。但是，与体外抗氧化活性相比，用核桃浆培养的菌体抗氧化活性在模拟胃液中的抗氧化活性均有所下降。这可能是因为模拟胃液条件下破坏了一些抗氧化活性物质所致[35-36]。
2.4 核桃浆培养基所得菌体的抗缺氧功能
根据优化结果，采用料液比1:10 g/mL，过120目筛的去脂核桃浆完全代替MRS培养基中氮源，通过静置培养法制备鼠李糖乳杆菌。经过富硒处理后，离心收集菌体，混合奶粉保护剂进行冻干，得到粉末状制剂，进一步制备成不同饲料，饲喂小鼠，可得不同条件下的血液指标如下。
血红蛋白是是维持血液和组织中足够O2水平的重要蛋白。血红蛋白的水平增加说明机体携带的O2量更多，能够提高机体在缺氧环境下的摄氧能力[37]。人参等复方中药功能液[38]就是通过增加小鼠血液中的红细胞数量和血红蛋白含量，从而延长小鼠在高原缺氧条件下的存活时间，对心、脑功能具有一定的保护作用。一些抗缺氧药物也能通过提高血红蛋白水平来缓解缺氧损伤[39]。高原训练能够增加运动员的血红蛋白水平，提高了红细胞的携氧功能，从而维持高质量的运动[40]。
从图6A可以看出，小鼠在进入低压氧舱前，SLW组的血红蛋白含量显著高于L组（P<0.05）。进舱后，SLW组的血红蛋白含量也相对CK、M、W和L组有明显上升。对比进入低压氧舱前后的小鼠中血红蛋白含量可以看出，SLW组的血红蛋白水平在进舱前后有显著差异，即在经过模拟高原缺氧环境胁迫后，进食核桃富硒菌的小鼠中血红蛋白含量显著升高（P<0.05），而其他组小鼠的血红蛋白在进舱前后无显著变化（P>0.05）。
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图 6 不同菌剂对小鼠血液指标的影响注：A.血红蛋白；B.平均血红蛋白浓度；C.红细胞数；D.白细胞数；E.淋巴细胞；F.中性粒细胞；1表示进低压氧舱前；2表示进低压氧舱后；普通饲料（CK），仅添加奶粉的饲料（M）、仅添加核桃的饲料（W）、添加MRS培养基所得鼠李糖乳杆菌的饲料（L）、添加用MRS培养基所得菌体制备的富硒菌饲料（SL）、含核桃浆培养基所得菌体的富硒菌饲料（SLW）；*表示在P<0.05水平上差异显著；**表示在P<0.01水平上差异显著；***表示在P<0.001水平上差异显著。Figure 6. Effects of different bacterials agents on blood indexes of mice同样，从图6B~图6C可以看出，进食含有核桃富硒菌的饲料能够显著提升小鼠在进舱前后的平均血红蛋白浓度和红细胞数（P<0.05）。由此说明，用核桃浆培养的富硒鼠李糖乳杆菌能够显著提高小鼠在缺氧环境下的血红蛋白、平均血红蛋白浓度和红细胞水平，从而对小鼠适应缺氧环境起到积极作用。
白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的增高与细菌感染和体内炎症有关[41-42]。图6D~图6F显示，与对照组相比，饲喂添加富硒菌饲料的小鼠在进舱前的白细胞和淋巴细胞均有显著降低（P<0.05），进舱后各组无显著性差异（P>0.05）。这说明，进食添加富硒菌和核桃富硒菌不会对小鼠造成炎症反应。
综合上述结果分析可以看出，用核桃浆培养的富硒菌具有潜在的抗缺氧功效。它能够通过提高小鼠在缺氧环境下的血红蛋白水平，使机体适应低压低氧环境，而且不会对机体造成炎症损伤。
3. 结论
本文研究证明，用核桃浆可以完全代替MRS培养中的牛肉膏和蛋白胨作为氮源，不仅不会影响鼠李乳杆菌发酵液的抑菌活性和抗氧化活性，而且能够提高培养后的菌体产量和产酸量，是一种经济、有效的益生菌培养方法。经过条件优化，可得有利于菌体生长的最优培养基制备条件为：按照料液比为1:10 g/mL制备核桃浆，过120目筛网后，去除脂肪，用于替代MRS培养基中氮源，灭菌接种后，在37 ℃静置培养48 h后，可使菌体产量增大2倍以上（从2.6×109 CFU/mL增加至7.6×109 CFU/mL）。用核桃浆培养的菌体经富硒处理后，能够显著提高小鼠在低压缺氧环境下的血液中血红蛋白含量，而且不会引起炎症反应，表现出很好的抗缺氧能力。
本研究阐明了用核桃浆高效、低成本地培养高活性鼠李糖乳杆菌的可行性，揭示了其富硒处理后提高机体在低压缺氧条件下抗缺氧能力的潜力，为开发与制备新型抗缺氧微生态制剂提供了理论依据与参考。
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图 2 核桃浆颗粒度对鼠李糖乳杆菌生长和发酵液抑菌活性的影响
注：A.培养物中活菌数；B.发酵液pH；C~E为发酵液上清对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。
Figure 2. Effects of walnut pulp grain size on the cell growth of Lactobacillus rhamnosus and the antibacterial activity of cell-free fermentation liquid
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图 3 核桃浆含量对鼠李糖乳杆菌生长和发酵液活性的影响
注：A.培养物中活菌数；B.发酵液pH；C~F为发酵液上清的抗氧化活性及其对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。
Figure 3. Effects of walnut pulp content on the growth of Lactobacillus rhamnosus and the activity of liquid culture supernatant
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图 4 摇床转速和核桃浆的去脂处理对鼠李糖乳杆菌生长与特性的影响
注：A.培养物中活菌数；B.发酵液pH；C~G为发酵液上清的抗氧化活性及其对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。
Figure 4. Effects of shaking speed and fat removing treatment on the growth and characteristics of Lactobacillus rhamnosus
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图 5 富硒处理对鼠李糖乳杆菌氧化活性的影响
注：A.菌体富硒过程中的状态变化；B.冻干富硒菌粉；C.富硒菌中的硒含量；D.不同培养条件所得菌悬液在不同条件下的抗氧化活性；MRS菌：MRS培养基所得菌体；MRS富硒菌：MRS培养基所得富硒菌；核桃菌：核桃浆培养基所得菌体；核桃富硒菌：核桃浆培养基所得富硒菌；*表示在P<0.05水平上差异显著。
Figure 5. Effects of selenium enrichment on the antioxidant capacity of Lactobacillus rhamnosus cells
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图 6 不同菌剂对小鼠血液指标的影响
注：A.血红蛋白；B.平均血红蛋白浓度；C.红细胞数；D.白细胞数；E.淋巴细胞；F.中性粒细胞；1表示进低压氧舱前；2表示进低压氧舱后；普通饲料（CK），仅添加奶粉的饲料（M）、仅添加核桃的饲料（W）、添加MRS培养基所得鼠李糖乳杆菌的饲料（L）、添加用MRS培养基所得菌体制备的富硒菌饲料（SL）、含核桃浆培养基所得菌体的富硒菌饲料（SLW）；*表示在P<0.05水平上差异显著；**表示在P<0.01水平上差异显著；***表示在P<0.001水平上差异显著。
Figure 6. Effects of different bacterials agents on blood indexes of mice
表 1 培养基中主要营养成分含量在菌体培养前后的变化
Table 1 Chang of nutrient contents in the medium before and after bacterial cultivation
培养基 可溶性蛋白质含量（mg/mL） 总糖含量（mg/mL） 菌体培养前 菌体培养后 菌体培养前 菌体培养后 MRS 0.18±0a 0.12±0.01a 2.51±0.07a 1±0.01a 核桃浆 0.4±0.1b 0.08±0.04a 2.26±0.01a 1±0.04a 注：同一列中的不同字母表示数据的t检验具有显著性差异（P<0.05）。 
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