Optimization of the Enzymatic Hydrolysis Process of Acer truncatum Seed Meal by Response Surface Methodology and the Functional Characteristics of the Polypeptide Obtained
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摘要: 本文以元宝枫籽粕为原料，采用碱性蛋白酶法对元宝枫籽粕进行酶解，以酶解时间、加酶量、pH、酶解温度、料液比为考察因素，酶解多肽得率为评价指标，在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽制备工艺进行优化，并对优化工艺获得的酶解多肽进行了氨基酸组成、吸水性、吸油性、起泡性质、乳化性质和表面疏水性等功能特性表征。结果表明：最优的酶解制备工艺为：酶解时间3.3 h，pH为10，加酶量为3%，酶解温度为55 ℃。在最优制备工艺条件下元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率为40.13%±0.15%。氨基酸组成分析表明酶解多肽所含八种必需氨基酸量高达20.3%，远高于国际粮农组织所建议成人所需必需氨基酸量。此外，酶解多肽的吸油性（4.553 g/g）高于大豆蛋白（2.61 g/g），其表面疏水性（1365.3）与大豆7S球蛋白的表面疏水性相似，乳化性和乳化稳定性略低于大豆分离蛋白。本研究所获得的元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽具有较好的功能特性，这也表明它可作为一种潜在的功能成分应用于食品中，为元宝枫籽粕的新应用开发提供数据和理论支撑。Abstract: In this paper, Acer truncatum seed meal was hydrolyzed by alkaline protease method. The enzymatic hydrolysis time, enzyme dosage, pH, enzymatic hydrolysis temperature and solid-liquid ratio were investigated, and the yield of enzymatic hydrolysis polypeptide was taken as the evaluation index. On the basis of the single-factor experiments and the Box-Behnken central combination experimental design, the preparation process of alkaline protease hydrolyzed polypeptide of Acer truncatum seed meal was optimized. The amino acid composition, water absorption, oil absorption, foaming, emulsifying and surface hydrophobicity of the enzymatic hydrolyzed peptides were characterized. The results showed that the optimal enzymatic hydrolysis process was as follows: enzymatic hydrolysis time 3.3 h, pH10, enzyme dosage 3%, enzymatic hydrolysis temperature 55 ℃. Under the optimum preparation conditions, the yield of peptides hydrolyzed by alkaline protease from Acer truncatum seed meal was 40.13%±0.15%. The analysis of amino acid composition showed that the amount of eight essential amino acids contained in the enzymatic hydrolysis polypeptide was as high as 20.3%, which was much higher than the amount of essential amino acids recommended by FAO. In addition, the oil absorption of enzymatic hydrolysis polypeptide (4.553 g/g) was higher than that of soybean protein (2.61 g/g), its surface hydrophobicity (1365.3) was similar to that of soybean 7S globulin, and its emulsifying property and emulsifying stability were slightly lower than that of soybean protein isolate. The alkaline protease hydrolyzed polypeptide of Acer truncatum seed meal obtained in this study had good functional characteristics, which also showed that it could be used as a potential functional component in food, providing data and theoretical support for the new application and development of Acer truncatum seed meal.
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元宝枫（Acer truncatum Bunge.）又名元宝槭，隶属于槭树科槭树属[1-2]，是一种落叶乔木，主要分布在吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、山东、陕西、及甘肃等地区。作为我国特有的食用木本油料树种，元宝枫籽仁含油率为42.6%[3]，元宝枫籽油富含神经酸[4]，被认为是一种优良的食用油[5]，其籽仁中蛋白质含量也仅次于大豆[6]。卫生部已于2011年3月将元宝枫籽油列入新的资源食品[7]。目前，我国元宝枫种植面积已超过4×104公顷[8]，每年籽粒产量约为30×104吨，如果将全部种仁用于生产籽油，每年可产生19.5×104吨左右的元宝枫籽粕剩余物。元宝枫籽粕剩余物不仅蛋白质含量高（52%），而且所含蛋白为不含淀粉的完全蛋白质。当前关于元宝枫的开发研究还主要集中在油的提取、食用、保健，以及药理特性方面[9-11]。对于元宝枫籽粕剩余物应用的研究甚少，仅仅有少量应用于酿制酱油、生产饲料、肥料等[12-14]，大部分被堆弃，这就造成了严重的资源浪费和环境污染。因此，元宝枫籽粕开发利用研究迫在眉睫。
多肽是蛋白质水解的中间产物，与蛋白质相比，其转换后的多肽具有分子量小，利于人体吸收和较强的生理活性等优点[15]。通常制备多肽的方法有：生物提取法[16-17]、微生物发酵法[18-19]、合成法[20-21]、化学法[22]和酶解法[23]等。Fu等[24]利用高氯酸从牛肉中提取内源性活性肽，由于提取流程复杂，难度比较大，投入成本高，活性肽产量少，不能满足人们的需求[25]，因而不具备实际生产价值；王文江等[26]利用黑曲霉发酵法制备山杏多肽，微生物发酵法虽然具有繁殖速度快，生长周期较短等优势，但很多的产酶菌有毒或对人体有害，目前已经证明无毒，可以用于食品开发的菌种并不多，安全问题、作用机理成为阻碍微生物发酵法制备活性肽的最大障碍；Yu等[27]采用固相多肽合成的方法，先确定目标肽段中氨基酸的组成及排列顺序，然后分步合成抗癌生物活性肽。但该方法存在副反应多，不易控制，产生的肽活性低，多样性差等缺点。化学方法是用酸或碱水解，酸碱水解虽然简单，成本低，但不易控制生产，生产条件较苛刻，所获氨基酸营养价值有所降低，目前此方法很少采用[28-29]。酶解法是近年来发展比较快的一种获取生物活性肽的方法，它具有稳定性好、可操作性强、反应条件比较温和、多肽制备效率高、周期短、安全性高、生产成本低等优点。安兆祥等[30]采用碱性蛋白酶提取黑木耳蛋白，所提取的黑木耳蛋白具有较好的溶解性、乳化性、乳化稳定性、泡沫稳定性。程赞等[31]采用碱性蛋白酶对核桃分离蛋白进行酶解，发现酶解后所获得的核桃分离蛋白吸水性、吸油性、溶解性、乳化性和起泡性有了明显改善。综上所述，酶解法的应用更为广泛，发展前景更好。
目前，关于元宝枫籽粕酶解工艺及其多肽功能特性方面的研究较少。本研究采用碱性蛋白酶酶解法制备元宝枫籽粕酶解多肽。通过单因素实验和Box-Behnken中心组合试验设计，确定了元宝枫籽粕酶解多肽的最优制备工艺条件。并对元宝枫籽粕酶解多肽进行氨基酸成分分析和功能特性测定，以期为元宝枫籽粕酶解多肽的提取和高值化利用提供数据和理论支撑。减少废弃物对环境污染同时，也对资源进行了合理利用，具有重要的经济意义和生态意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
元宝枫籽粕 陕西金旺农林科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸钠（ANS） 上海麦克林生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS） 天津百伦斯生物技术有限公司；碱性蛋白酶（200 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；大豆色拉油 九三粮油工业集团有限公司；其余试剂 均为国产分析纯。
多功能粉碎机（QJ-20） 上海兆申科技有限公司；紫外-可见光分光光度计（UV-5500） 上海元析仪器有限公司；荧光分光光度计（F-700） 天美（中国）科学仪器有限公司；电子调温加热套（98-1-B） 天津市泰斯特仪器有限公司；高速电动匀浆器（FSH-II） 江苏金坛市环宇科学仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 原料预处理
将元宝枫籽粕机械粉碎，并使用40目筛过滤，得到元宝枫籽粕粉，置于0～4 °C冰箱封存供后续使用。脱油处理：按料液比1:10，石油醚回流提取时间4.0 h，重复提取3次，60 ℃烘干得到脱油后元宝枫籽粕粉末样品。脱糖处理：按照料液比1:20 g·mL−1将脱油后的元宝枫籽粕粉末，沸水回流提取4.0 h，在8000 r·min−1下离心5 min，将离心后的沉淀于105 ℃烘箱中烘干，得到脱油脱糖粉，储存在棕色干燥器中，供后续实验使用。
1.2.2 碱性蛋白酶酶解多肽的制备
称取一定质量的脱油脱糖元宝枫籽粕粉121 ℃灭菌15 min后，用氢氧化钠和盐酸将样品溶液调整到适当pH，加入适量的碱性蛋白酶，预设环境下进行酶解，反应结束后，沸水浴中灭活15 min，在5000 r·min−1下离心10 min，取上清液装于截留分子质量为3000 Da的透析袋中透析，每4 h更换一次透析液，直至透析液pH为中性不在发生变化为止，透析后溶液冻干，得到元宝枫籽粕粉酶解多肽，0～4 °C低温保存，用于后续实验。酶解多肽得率（Y1）的计算公式如下：
Y1(%)=m1×cm2×100 (1) 式中：m1—冻干所获得样品质量，g；c—冻干所获得样品中多肽的含量，%；m2—酶解前元宝枫籽粕（去油去糖）的质量，g。
1.2.3 单因素实验
固定料液比1:20 g·mL−1，加酶量3%，酶解温度55 ℃，酶解体系pH10，酶解时间3 h，在上述工艺条件下，以酶解多肽得率为响应值，分别探讨酶解时间（0.5、1、2、3、4 h）、加酶量（0.3%、1.5%、3%、15%、30%）、酶解温度（25、40、55、70、85 ℃）、酶解体系pH（4、6、8、10、12）、料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g·mL−1）5个因素对元宝枫籽粕酶解多肽得率的影响。每个实验重复3次，取均值。
1.2.4 响应面法优化酶解工艺
根据Box-Behnken中心组合实验的设计原理，在单因素实验基础上，以多肽得率为响应值，进行四因素三水平响应面分析试验（见表1），四个因子分别为酶解时间（h）、加酶量（%）、酶解温度（℃）和酶解体系pH，试验总共设计29个试验点，其中包括5个中心点用来验证试验误差。
表 1 响应面试验因素与水平Table 1. Response surface test factors and levels因素 水平 −1 0 1 A酶解体系pH 8 10 12 B加酶量（%） 2 3 4 C酶解时间（h） 2 3 4 D酶解温度（℃） 40 55 70 1.2.5 酶解多肽氨基酸组成分析
参照Jin等[32]的方法，称取一定量的酶解多肽样品，加入6.0 mol/L HCl，氮气保护下密封在玻璃管中，110 °C水解24 h。使用超纯水将过滤后的水解液稀释至50.0 mL。取1.0 mL溶液在45 ℃真空脱酸，再用5.0 mL 0.1 mol/L HCl溶解。另外，进行色氨酸含量分析时，称取一定量的酶解多肽样品，4.0 mol/L LiOH在氮气保护下加入到聚四氟乙烯管中，110 ℃下水解24 h。水解产物过滤后，用6.0 mol/L盐酸中和至pH2.2。加入超纯水，定容到100.0 mL。酶解多肽的氨基酸组成成分采用A300氨基酸分析仪（德国）进行分析，依据不同氨基酸积峰面积和相应标准曲线来计算相应氨基酸含量，即C氨基酸=f（A氨基酸）。
1.2.6 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽功能特性的测定
1.2.6.1 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽溶解度
元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽与水混合，用1.0 mol/L NaOH和HCl将混合物的pH调节至2.0～12.0。室温下搅拌30 min，5000 r·min−1离心5 min，通过凯氏定氮法[33]确定样品中的总蛋白质浓度和上清中的蛋白浓度，6.25作为转换因子。平行测定三次，并通过蛋白质的浓度（%）与pH作图来获得溶解度曲线。溶解度（P）的计算方法如下：
P(%)=W1W2×100 (2) 式中：W1—上清中蛋白的浓度，mg·mL−1；W2—样品中总蛋白的浓度，mg·mL−1。
1.2.6.2 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽吸油性和吸水性
根据Monteiro等[34]方法测定元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的吸油性或吸水性。称0.5 g元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽，于离心管中。缓慢向离心管中加入5 mL的大豆油或超纯水，涡旋振荡器充分振荡混匀后，室温静置0.5 h后，5000 r·min−1离心10 min，准确测量上清液体积。以每克样品吸附油或水的体积来评估其吸油性或吸水性。
1.2.6.3 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽乳化性及乳化稳定性
根据Pearce等[35]的方法对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的乳化特性进行测定。用乳化活性指标（EAI）和乳化稳定性（ES）评估元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的乳化活性。准确称取100 mg元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽，分散于100 mL的蒸馏水中，置于涡旋振荡器上室温振荡溶解，用1.0 mol/L NaOH和HCl调节酶解多肽溶液pH为2、4、6、8、10，加入15 mL大豆油10000 r·min−1室温匀浆2 min。用移液器在0和5 min时迅速从容器底部取样50 μL乳状液置于10 mL离心管中，再加入4.95 mL的SDS（0.1%）溶液，涡旋振荡器振荡混匀30 s。在500 nm的条件下，测定样品的吸光值。乳化活性指标（EAI）和乳化稳定性（ES）的计算方法如下：
EAI(m2/g)=2×2.303×A0C×φ×104×N (3) ES(min)=A0A0−A5×Δt (4) 式中：N—稀释倍数；C—蛋白质的质量分数（g·mL−1）；
φ —混合体系油的体积分数；A0—0 min时乳化液的吸光值；A5—5 min后乳化液的吸光值；△t—5 min。1.2.6.4 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽起泡性和起泡稳定性
根据Booma等[36]的方法对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽起泡性和起泡稳定性进行测定。称取一定质量的元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽样品，用蒸馏水将其配制成浓度为50 mg·mL−1溶液。取10 mL样品溶液，调节pH为2、4、6、8、10，10000 r·min−1高速均浆3 min。将酶解多肽溶液移到量筒中，测量此时的泡沫体积（记为V），在室温静置，并间隔不同的时间（0、5、10、20、30 min）测量此时泡沫的体积（记为V1）。起泡性（FC）和起泡稳定性（FS）的计算公式如下：
FC(%)=V10mL×100 (5) FS(%)=V1V×100 (6) 式中：V—在0 min时溶液的气泡体积，mL；V1—在5、10、20、30 min时的泡沫体积，mL。
1.2.6.5 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽表面疏水性
元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的表面疏水性通过荧光探针（ANS）的方法进行测定[37-38]。10 mg酶解多肽样品悬浮在10 mL磷酸缓冲液中（0.01 mol/L，pH7），250 r·min−1低速搅拌2 min，通过磷酸缓冲液将酶解多肽样品溶液对半稀释成不同浓度。取4 mL酶解多肽溶液，加入 20 μL 8 mmol/L的ANS（用0.01 mol/L PBS溶液配置）溶液后，混匀、避光静置5 min后10000 r·min−1离心5 min，取上清液用荧光光度计测定酶解多肽样品的荧光强度 （Fluorescenceintensity，FI）。设置酶解多肽样品的激发波长、发射波长、狭缝宽度分别为287、352、5 nm，图像自变量为酶解多肽的浓度，因变量为荧光强度（FI），初始斜率为酶解多肽的表面疏水性指数。
1.3 数据处理
使用Design-Expert 10.0.1软件进行Box-Behnken试验设计及响应面试验数据处理，并对实验数据进行方差分析及二次多项式回归拟合。每组实验数据设置3个平行，实验数据以平均值±标准误差来表示，采用Excel和Origin 2018.0进行数据和图像处理并生成图片。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 酶解时间对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的影响
在其他因素固定条件下，比较不同酶解时间对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的影响（见图1A）。可以看出，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率随着酶解时间的不断延长表现为先上升的趋势，在3 h时到达峰值，而后趋势逐渐下降。因此，选择酶解时间为3 h。
2.1.2 加酶量对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的影响
同样固定其他反应条件不变，比较不同加酶量对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的影响（见图1B）。可以看出，随着碱性蛋白酶用量的增加，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率表现为先急剧增加的趋势，而后趋于平缓，即当碱性蛋白酶用量超过3%时，元宝枫籽粕碱性蛋白酶的多肽得率变化不明显。因此，考虑到加工成本，选择加酶量3%。
2.1.3 pH对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的影响
同样固定其他反应因素不变，比较不同pH对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的影响（见图1C）。从图可以看出，随着溶液体系pH逐渐升高，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率也逐渐增加。当溶液体系pH超过10时，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率略有降低。这是过量的碱影响了酶分子的特殊构象，使碱性蛋白酶的活性受到抑制。因此，溶液体系pH选为10。
2.1.4 酶解温度对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的影响
同样固定其他反应因素不变，比较不同酶解温度对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的得率呈现逐渐增加的趋势。而当反应温度高于55 ℃时，随着反应温度的增加，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率呈现逐渐降低的趋势。因此，酶解温度选定为55 ℃。
2.1.5 料液比对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的影响
同样固定其他反应因素不变，比较不同料液比对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的影响（见图1E）。增加料液比，元宝枫籽粕碱性蛋白酶解多肽得率急剧增加。当料液比超过1:20 （g·mL−1）时，元宝枫籽粕碱性蛋白酶解多肽得率趋于平缓，多肽得率增加不明显。因此，选择料液比为1:20 （g·mL−1）。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 回归方程与检验
对表2酶解多肽得率（Y）的实验数据进行多元回归拟合后，得到元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的酶解多肽得率对pH（A）、加酶量（B）、酶解时间（C）、酶解温度（D）各因素变量的多元二次回归方程为：
表 2 响应面试验设计及试验结果Table 2. Response surface test design and test results编号 A B C D Y多肽得率（%） 1 −1 −1 0 0 28.13 2 1 −1 0 0 32.07 3 −1 1 0 0 33.66 4 1 1 0 0 36.75 5 0 0 −1 −1 33.35 6 0 0 1 −1 36.85 7 0 0 −1 1 31.21 8 0 0 1 1 37.46 9 −1 0 0 −1 34.79 10 1 0 0 −1 37.48 11 −1 0 0 1 32.94 12 1 0 0 1 36.44 13 0 −1 −1 0 27.07 14 0 1 −1 0 30.85 15 0 −1 1 0 31.67 16 0 1 1 0 36.03 17 −1 0 −1 0 29.44 18 1 0 −1 0 32.68 19 −1 0 1 0 35.42 20 1 0 1 0 36.87 21 0 −1 0 −1 31.06 22 0 1 0 −1 35.61 23 0 −1 0 1 30.11 24 0 1 0 1 34.14 25 0 0 0 0 39.95 26 0 0 0 0 39.16 27 0 0 0 0 39.28 28 0 0 0 0 40.22 29 0 0 0 0 39.78 Y(%)=39.68+1.49A+2.24B+2.48C−0.57D− 0.21AB−0.45AC+0.20AD+0.14BC−0.13BD+0.69CD−2.43A2−4.87B2−3.40C2−1.83D2
如表3所示，对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率来说，模型F值为107.95（P<0.01），说明该模型显著性良好，失拟项（P=0.4267>0.05）不显著，说明回归模型拟合程度良好。其中，R2=0.9908，单因素变量可以解释99.08%的响应值变化。模型一次项A、B和C，交互项CD和二次项A2、B2、C2、D2对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的影响极显著（P<0.01），如表4所示，校正系数R2Adj=0.9816，表明仅有总变量的1.84%不能用此模型来解释，R2与R2Adj二者之差小于0.2，更加验证回归方程和实验结果一致性较高。变异系数（CV）为1.44%（<5%），信噪比35.974（>4），均表明该回归方程精度和可信性比较高，可以用该模型分析并确定制备元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的最佳工艺参数。
表 3 响应面回归模型及方差分析结果Table 3. Response surface regression model and analysis of variance results方差来源 离差平方和 自由度 均方和 F值 P值 显著性 模型 371.98 14 26.57 107.95 <0.0001 ** pH（A） 26.73 1 26.73 108.60 <0.0001 ** 加酶量（B） 60.44 1 60.44 245.53 <0.0001 ** 酶解时间（C） 73.51 1 73.51 298.64 <0.0001 ** 酶解温度（D） 3.90 1 3.90 15.84 0.0014 ** AB 0.18 1 0.18 0.73 0.4061 AC 0.80 1 0.80 3.25 0.0928 AD 0.16 1 0.16 0.67 0.4280 BC 0.084 1 0.084 0.34 0.5682 BD 0.068 1 0.068 0.27 0.6084 CD 1.89 1 1.89 7.68 0.0150 * A2 38.15 1 38.15 155.00 <0.0001 ** B2 153.54 1 153.54 623.78 <0.0001 ** C2 74.83 1 74.83 304.01 <0.0001 ** D2 21.70 1 21.70 88.16 <0.0001 ** 残差 3.45 14 0.25 失拟项 2.64 10 0.26 1.31 0.4267 误差项 0.80 4 0.20 总和 375.43 28 注：*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）。 表 4 回归方程的可信度分析Table 4. Reliability analysis of regression equation类别 指标 标准误差（Std.Dev） 0.50 R2 0.9908 R2Adj 0.9816 预测复R2 0.9561 精确度（%） 1.44 平均值 34.50 信噪比 35.974 2.2.2 响应面曲面分析
酶解时间、酶解温度、溶液体系pH、加酶量对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率影响的三维立体图以及等高线图（如图2）。由图可知，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率与4个因素的三维立体图抛物面的开口均向下，有最大值，等高线图近似呈椭圆形，各个因素之间存在交互作用，由图2k可知，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率随着酶解时间和酶解温度增大呈现先上升后下降趋势，等高线图（如图2l）较为密集，图形接近椭圆形，说明酶解时间和酶解温度交互作用对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率影响显著。根据系数估计值绝对值的大小，4个因素对多肽得率的影响大小依次为：C（酶解时间）>B（加酶量）>A（pH）>D（酶解温度）。
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图 2 各因素交互作用对多肽得率影响的响应面图Figure 2. Response surface diagram of the interaction of various factors on the yield of peptides2.2.3 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽最优工艺条件验证
由Design Expert 10.0.1软件分析，得到最优的工艺条件为：酶解时间为3.30 h，加酶量为3.01%，酶解温度为52.29 ℃，pH为10.25，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率的预测值为40.2682%。考虑实际的操作性，对工艺参数进行调整：酶解时间为3.30 h，加酶量为3%，酶解温度为55 ℃，pH为10。进行3次验证实验，最后实际酶解多肽得率为40.13%±0.15%，与预测值相差0.1382。较为接近，表明优化的试验条件较为可信，具有实际应用价值。
2.3 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽氨基酸组成分析
元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的氨基酸组成分析如图3A。从图可以看出，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽中所检测到的十八种氨基酸含量均高于原料，其中含量最高的是谷氨酸（Glu）（8.096%），然后是脯氨酸（Pro）（5.719%）和亮氨酸（Leu）（4.731%），这表明经过碱性蛋白酶处理后元宝枫籽粕的多肽含量有了很大程度的提高，这也与核桃多肽的氨基酸组成具有相似性[39]，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为0.6238，高于大豆蛋白（0.4804）[40]。元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽所含八种必需氨基酸的含量高达20.3%，远高于国际粮农组织所建议成人所需必需氨基酸的量（10.75%）[41]。另外，除不含有谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn），元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽含有其他全部十二种非必需氨基酸。通过对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽氨基酸的增量进行分析（见图3B），可以看出经过碱性蛋白酶酶解处理后，氨基酸增量最大的为脯氨酸（Pro），其次是谷氨酸（Glu）、苏氨酸（Thr）和亮氨酸（Leu）。其中，脯氨酸不仅可以有效清除自由基，还可用于营养不良、蛋白质缺乏症和胃肠道疾病治疗[42]，谷氨酸属于呈味氨基酸的一种[43]，苏氨酸和亮氨酸属于人体八种必需氨基酸，这些都表明元宝枫籽粕经过碱性蛋白酶后所获得的酶解多肽具有更高的营养价值。
2.4 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的溶解度
元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽溶解度受溶液体系pH的影响比较明显（如图4），在pH为2～12范围内，元宝枫碱性蛋白酶酶解多肽的溶解度图形呈“V”形，pH为4时溶解度最小。这与王性炎等[44]报道的在等电点处溶解度较低的结果相似，随着pH从4逐渐增加到10，元宝枫碱性蛋白酶酶解多肽的溶解度逐渐增大，这可能是因为在碱性环境条件下，蛋白质分子和水之间的相互作用增大，从而导致溶解度的增大。在茶籽多肽[45]中也观察到类似的pH溶解度曲线。
2.5 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽吸水性和吸油性
吸水性和吸油性用来表示多肽分子与水（油）相的结合能力。元宝枫碱性蛋白酶酶解多肽的吸水性为2.02 mL/g（即2.02 g/g）与冷榨大豆饼粉的吸水性（2.27 g/g）较为接近，吸水性在食品加工过程中对食品的黏性，可塑性以及样品流动性具有很大的影响。Aletor等报道建议蛋白质的持水性在1.49到4.72 g/g范围内就可以应用在有一定粘性的食品中[46]。元宝枫碱性蛋白酶酶解多肽吸油性为4.95 mL/g（即4.553 g/g）要高于大豆蛋白的吸油性（2.61 g/g）[47]，蛋白质的吸油性是影响食品风味的保留，具有延长保质期的功能特性[48]。因此，元宝枫碱性蛋白酶酶解多肽可以作为食品中的一种潜在的功能成分，如烘焙型产品和乳液型食品。
2.6 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽乳化性和乳化稳定性
蛋白质乳化性是指蛋白质能够使油和水之间形成乳状液的能力，而在一定时间内，维持乳状液分散体系稳定而不破碎的能力称为乳化稳定性。由图5可知，随着溶液体系pH的不断变化，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的乳化性和乳化稳定性也不断变化。当溶液体系pH4时，多肽的乳化性较小，原因可能是pH4临近蛋白质等电点，此处静电荷较少，导致元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽聚集形成沉淀，溶解度较低，乳化性较低。酶解多肽的乳化性及乳化稳定性随着pH增加（4～10）而逐渐增强。碱性环境下，酶解多肽所带负电荷对多肽在水油界面乳状液的形成更加有利[49]。另外，酶解多肽在碱性环境下，较高的溶解度有利于增大水油间相互作用力，使酶解多肽乳化活性增加[50]。元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽乳化性和乳化稳定性略低于大豆分离蛋白乳化性和乳化稳定性[51]。
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图 5 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的乳化性和乳化稳定性Figure 5. Emulsifying property and emulsifying stability of polypeptides hydrolyzed by alkaline protease from Acer truncatum seed meal2.7 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽起泡性和起泡稳定性
从图6A能够看出，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的起泡性在pH4时较低，这是因为在临近等电点时，酶解多肽的溶解度比较低，溶液中较低的多肽浓度导致形成泡沫的数量比较少，不利于多肽分子在界面形成刚性膜[52-55]。随着pH的增加，酶解多肽的起泡性逐渐增强，这主要是因为酶解多肽的溶解度随着溶液体系pH的增大而逐渐增加，且在pH10时起泡性达到最大值。而元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的起泡稳定性呈现逐渐增加的趋势（见图6B），这是由于随着pH的增大，酶解多肽的溶解度增加，增强分子间的作用，形成的泡沫的稳定性也增强[56]，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽起泡性低于大豆酶解分离蛋白，其起泡稳定性与大豆酶解分离蛋白相当[57]。
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图 6 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽起泡性和起泡稳定性Figure 6. Foaming property and foaming stability of polypeptides hydrolyzed by alkaline protease from Acer truncatum seed meal2.8 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽表面疏水性
元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽表面疏水性主要反映的是多肽分子疏水集团的暴露程度，可以用来表征多肽的分子构象及其稳定性。实验结果表明元宝枫籽粕碱性蛋白酶解多肽的表面疏水性为1365.3，这与范丽丽等[58]的研究以微生物转谷氨酰胺酶素交联处理大豆7S球蛋白的表面疏水性结果相似。
3. 结论
本研究以元宝枫籽粕剩余物为原料，通过碱性蛋白酶酶解方式获得酶解多肽，在单因素实验的基础上，采用响应面优化法对酶解工艺进行优化，获得了最优制备工艺条件。在最优制备工艺条件下元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽得率与理论值接近，响应面模型准确可靠，具有实际应用价值。
通过对元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽氨基酸成分分析，酶解多肽中所含八种必需氨基酸的含量远高于国际粮农组织所建议成人所需必需氨基酸的含量。除了不含有谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn），酶解多肽含有其他全部十二种非必需氨基酸。经过碱性蛋白酶酶解处理后，氨基酸增量最大的为脯氨酸（Pro），其次是谷氨酸（Glu）、苏氨酸（Thr）和亮氨酸（Leu），这些都表明元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽具有较高的营养价值。另外，元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽具有一定的吸水性和吸油性，可作为一种潜在的功能成分应用于食品中。
元宝枫籽油已经列入新资源食品，目前关于元宝枫的开发研究主要集中在元宝枫籽油方面，而对于元宝枫籽油加工剩余物方面的研究甚少，元宝枫籽粕的开发利用研究迫在眉睫。本研究将为元宝枫籽粕开发应用提供数据和理论支撑，有助于发现元宝枫籽粕新的潜在应用，为元宝枫籽仁的高值化利用奠定了基础。元宝枫籽仁蛋白属于全价蛋白，不含淀粉，可针对特殊人群开发成食品，用于糖尿病人、营养不良、蛋白质缺乏症和胃肠道疾病治疗。未来还需对元宝枫籽粕酶解多肽体外、体内生理活性以及作用机制进行深入的研究，开发一些功能性产品。最终实现元宝枫籽粕剩余物的综合利用率，提高资源的利用效率。
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图 2 各因素交互作用对多肽得率影响的响应面图
Figure 2. Response surface diagram of the interaction of various factors on the yield of peptides
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图 5 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽的乳化性和乳化稳定性
Figure 5. Emulsifying property and emulsifying stability of polypeptides hydrolyzed by alkaline protease from Acer truncatum seed meal
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图 6 元宝枫籽粕碱性蛋白酶酶解多肽起泡性和起泡稳定性
Figure 6. Foaming property and foaming stability of polypeptides hydrolyzed by alkaline protease from Acer truncatum seed meal
表 1 响应面试验因素与水平
Table 1 Response surface test factors and levels
因素 水平 −1 0 1 A酶解体系pH 8 10 12 B加酶量（%） 2 3 4 C酶解时间（h） 2 3 4 D酶解温度（℃） 40 55 70 
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表 2 响应面试验设计及试验结果
Table 2 Response surface test design and test results
编号 A B C D Y多肽得率（%） 1 −1 −1 0 0 28.13 2 1 −1 0 0 32.07 3 −1 1 0 0 33.66 4 1 1 0 0 36.75 5 0 0 −1 −1 33.35 6 0 0 1 −1 36.85 7 0 0 −1 1 31.21 8 0 0 1 1 37.46 9 −1 0 0 −1 34.79 10 1 0 0 −1 37.48 11 −1 0 0 1 32.94 12 1 0 0 1 36.44 13 0 −1 −1 0 27.07 14 0 1 −1 0 30.85 15 0 −1 1 0 31.67 16 0 1 1 0 36.03 17 −1 0 −1 0 29.44 18 1 0 −1 0 32.68 19 −1 0 1 0 35.42 20 1 0 1 0 36.87 21 0 −1 0 −1 31.06 22 0 1 0 −1 35.61 23 0 −1 0 1 30.11 24 0 1 0 1 34.14 25 0 0 0 0 39.95 26 0 0 0 0 39.16 27 0 0 0 0 39.28 28 0 0 0 0 40.22 29 0 0 0 0 39.78
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表 3 响应面回归模型及方差分析结果
Table 3 Response surface regression model and analysis of variance results
方差来源 离差平方和 自由度 均方和 F值 P值 显著性 模型 371.98 14 26.57 107.95 <0.0001 ** pH（A） 26.73 1 26.73 108.60 <0.0001 ** 加酶量（B） 60.44 1 60.44 245.53 <0.0001 ** 酶解时间（C） 73.51 1 73.51 298.64 <0.0001 ** 酶解温度（D） 3.90 1 3.90 15.84 0.0014 ** AB 0.18 1 0.18 0.73 0.4061 AC 0.80 1 0.80 3.25 0.0928 AD 0.16 1 0.16 0.67 0.4280 BC 0.084 1 0.084 0.34 0.5682 BD 0.068 1 0.068 0.27 0.6084 CD 1.89 1 1.89 7.68 0.0150 * A2 38.15 1 38.15 155.00 <0.0001 ** B2 153.54 1 153.54 623.78 <0.0001 ** C2 74.83 1 74.83 304.01 <0.0001 ** D2 21.70 1 21.70 88.16 <0.0001 ** 残差 3.45 14 0.25 失拟项 2.64 10 0.26 1.31 0.4267 误差项 0.80 4 0.20 总和 375.43 28 注：*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）。
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表 4 回归方程的可信度分析
Table 4 Reliability analysis of regression equation
类别 指标 标准误差（Std.Dev） 0.50 R2 0.9908 R2Adj 0.9816 预测复R2 0.9561 精确度（%） 1.44 平均值 34.50 信噪比 35.974
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