Optimization of Fermentation Extraction of Dietary Fiber from Bagasse by Response Surface Methodology and Its Structural Characteristics
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摘要: 本研究以甘蔗渣作为原料，采用枯草芽孢杆菌发酵法制备蔗渣膳食纤维，通过单因素实验及响应面试验优化可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）制备工艺，并对发酵前和发酵后膳食纤维的理化性质、结构及体外抗氧化活性进行了对比研究。结果表明，最佳制备工艺为接种量10%、pH为7、发酵时间71 h，此条件下可溶性膳食纤维提取率为17.95%±0.06%。理化性质的研究表明，发酵后的膳食纤维较发酵前样品持水力、持油力及膨胀力都有所增大且结果差异显著（P<0.05）；观察其超微结构发现，经过发酵处理后膳食纤维粒径变小，呈现片层状态；红外图谱表明发酵后膳食纤维吸收峰强度增大，整体峰型及位置未发生改变；X-射线衍射图谱表明发酵处理后衍射峰强度减弱，结晶结构未发生变化。发酵后的膳食纤维DPPH自由基清除能率、还原力、羟自由基清除率相较于未发酵原料（dietary fiber，DF）最高分别提高了32.9%、0.70、50.55%（P<0.05）。发酵法制备蔗渣膳食纤维可以改善其理化性质及结构，有效提高其抗氧化性。本实验为有效利用甘蔗原料，为副产物的加工利用以及避免资源浪费提供了理论依据。Abstract: In this paper, bagasse was fermented to produce dietary fiber by Bacillus subtilis. The extraction process of soluble dietary fiber (SDF) was optimized by single factor test and response surface methodology. The physicochemical properties, structure and antioxidant activity in vitro of dietary fiber before and after fermentation were compared and analyzed. The results showed that the optimal extraction conditions were inoculum amount 10%, pH7 and fermentation time 71 h. Under these conditions, the extraction yield of soluble dietary fiber was 17.95%±0.06%. The analysis of physicochemical showed that the water-holding capacity, oil-holding capacity and swelling force of fermented dietary fiber (F-DF) were significantly increased compared with DF (P<0.05). The ultrastructure showed that the particle size of dietary fiber decreased and showed a lamellar state after fermentation. Fourier infrared spectrum showed that the intensity of dietary fiber absorption peak increased and the overall peak type and position did not change after fermentation. The X-ray diffraction pattern showed that the diffraction peak intensity decreased and the crystal structure did not change after fermentation. Compared with dietary fiber, the DPPH free radical scavenging energy, reducing power and hydroxyl radical scavenging rate of fermented dietary fiber were the highest, which were increased by 32.9%, 0.70 and 50.55% (P<0.05), respectively. The preparation of bagasse dietary fiber by fermentation could improve its physical and chemical properties and structure, and effectively improve its antioxidant activity. Therefore, this experiment provides a theoretical basis for the effective use of sugarcane raw materials, the processing and utilization of by-products and the avoidance of resource waste.
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甘蔗渣通常是甘蔗制糖过程中被压榨处理后剩余的残渣，是甘蔗加工过程中的副产物[1]，我国每年有大量的甘蔗渣被废弃，应该对其进行充分的处理和加工，避免造成资源浪费[2]。由于甘蔗渣中纤维素、半纤维素和木质素成分居多[3]，因此甘蔗渣中膳食纤维含量较高。膳食纤维对人体的健康起着重要的作用，既可促进健康又可预防疾病[4]。根据其溶解性的不同，将膳食纤维分为可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维。相比于不可溶膳食纤维，可溶性膳食纤维能量低，吸水性强，可以使人产生饱腹感，可以控制肥胖、调节血糖，减少高血压等疾病[4-6]。因此学者致力于利用各种方法来提高可溶性膳食纤维的含量。
目前常用的膳食纤维的制备方法有化学法[7]、物理法[8]、酶法[9]和微生物发酵法[10]等。微生物发酵法作为一种新型的制备方法，相比酶制剂制备成本较低，操作简便且安全性较高[11]。对于微生物法制备膳食纤维的报道常见的是利用保加利亚乳杆菌[12]、嗜热链球菌[13]、乳酸菌[14]、黑曲霉[15]、绿色木霉[16]、红曲霉[10]等。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是酸奶生产所用常规菌种，对于温度、氧气等发酵条件要求严苛；黑曲霉等丝状真菌发酵时间较长、发酵条件需氧且固态发酵时容易产生孢子，形态不佳导致其应用比较受限。相较而言，枯草芽孢杆菌发酵时间较短，培养条件粗放，生长温度范围较宽，且菌体自身能合成消化性酶类，如蛋白酶、纤维素酶等，还能够直接分泌到培养基中发挥作用。闵钟熳等[17]利用枯草芽孢杆菌为发酵菌种，制备米糠粕中可溶性膳食纤维，提取率为12.88%。对于甘蔗渣中膳食纤维制备报道较少，林杰等[18]利用酶法制备蔗渣膳食纤维，利用发酵法制备蔗渣中膳食纤维对于蔗渣利用具有重要意义。
本研究以枯草芽孢杆菌为发酵菌种，利用微生物发酵法从蔗渣中制备可溶性膳食纤维，利用响应面法对工艺流程进行优化，提高可溶性膳食纤维的提取率，通过对比持水性、持油性及膨胀力，分析发酵后理化性质的改变；利用扫描电镜、红外光谱及X-射线分析发酵处理前后膳食纤维的结构变化，并对其抗氧化活性进行研究。本研究旨在提高蔗渣中可溶性膳食纤维的含量，改善其膳食纤维理化性质及结构特性，从而提高蔗渣资源的利用率，减少资源浪费。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜甘蔗渣 广西南宁甘蔗榨汁后副产物；枯草芽孢杆菌B01 东北林业大学林学院食品微生物实验室保存；其他试剂均为分析纯；斜面培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，琼脂20.0 g/L，pH7.4；种子培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，pH7.4；蔗渣发酵培养基：蔗渣粉20.0 g/L，磷酸氢二钾2.5 g/L，磷酸氢二钠2.5 g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，pH7.2±0.2。
THZ-98A振荡培养箱 上海一恒公司；STIK高压灭菌器 美国STIK公司；JSM-7500F扫描电镜 日本JEOL公司；Spectrum 400傅里叶红外光谱 美国Thermo Nicolet公司；X,Pert3 PowedrX射线衍射仪 荷兰马尔文帕纳科仪器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 蔗渣预处理
利用粉碎机粉碎蔗渣，50 ℃烘干后过80目筛备用。
1.2.2 发酵法蔗渣膳食纤维制备工艺
配制蔗渣发酵培养基50 mL，121 ℃灭菌20 min，待冷却后，按照一定的比例接种枯草芽孢杆菌B01，在37 ℃、120 r/min条件下摇床培养，发酵结束后，4000 r/min离心10 min，沉淀即为不可溶膳食纤维（IDF），上清液加入4倍体积95%乙醇过夜醇沉后在4000 r/min条件下离心10 min，干燥所得沉淀即为可溶性膳食纤维（SDF），收集称重。
膳食纤维提取率公式：
可溶性膳食纤维(SDF)=m1m×100 不可溶性膳食纤维(IDF)=m2m×100 总膳食纤维(DF)=m1+m2m×100 式中：m表示蔗渣原料的质量，g；m1表示可溶性膳食纤维质量，g；m2表示不可溶性膳食纤维质量，g。
1.2.3 发酵法制备可溶性膳食纤维的单因素实验
1.2.3.1 发酵时间对SDF提取率的影响
配制七组50 mL蔗渣发酵培养基，每组三个平行样，调节pH为7，121 ℃、20 min灭菌冷却后，按照6%的接种量接入已活化的枯草芽孢杆菌，在37 ℃发酵温度下分别摇瓶发酵24、36、48、60、72、84、96 h，计算SDF的提取率。
1.2.3.2 接种量对SDF提取率的影响
配制七组50 mL蔗渣发酵培养基，每组三个平行样，调节pH为7，121 ℃、20 min灭菌冷却后，分别按照2%、4%、6%、8%、10%、12%和14%的接种量接入已活化的枯草芽孢杆菌，在37 ℃发酵温度下摇瓶发酵48 h后，计算SDF的提取率。
1.2.3.3 培养基pH对SDF提取率的影响
配制六组50 mL蔗渣发酵培养基，每组三个平行样，分别调节pH为4、5、6、7、8和9。121 ℃、20 min灭菌冷却后，按照6%的接种量接入已活化的枯草芽孢杆菌，在37 ℃发酵温度下摇瓶发酵48 h后，计算SDF的提取率。
1.2.4 响应面法优化可溶性膳食纤维制备工艺
以单因素实验结果为基础，根据响应面试验Box-Behnken设计原理[19]，以发酵时间、接种量及培养基pH作为响应因素，以可溶性膳食纤维（SDF）的提取率作为响应值，设计三因素三水平的分析实验，每组实验设置三个平行样，取平均值，对数据进行回归分析及显著性检验，确定最佳工艺。试验因素水平如表1所示。
表 1 响应面试验因素水平Table 1. Factors and levels of response surface experiment因素 水平 −1 0 1 A：发酵时间（h） 60 72 84 B：接种量（%） 8 10 12 C：pH 6 7 8 1.2.5 持水力、持油力及膨胀力的测定
对发酵前及发酵后的膳食纤维进行持水力、持油力及膨胀率的测定。
1.2.5.1 持水力
参照文献[20]的方法，取50 mL离心管称重记为m1，准确称取1 g膳食纤维（记为m2）加入离心管，室温下加入25 mL蒸馏水，不断搅拌30 min后离心，去上清液后用滤纸滤干，称取其质量记为m3。
持水力(g/g)=m3−m2−m1m2 1.2.5.2 持油力
参照文献[20]的方法，取50 mL离心管称重记为m1，准确称取1 g膳食纤维（记为m2）加入离心管，室温下加入25 mL油，不断搅拌30 min后离心，去上清液后用滤纸吸干油分，称取其质量记为m3。
持油力(g/g)=m3−m2−m1m2 1.2.5.3 膨胀力
参照文献[20]的方法，将0.5 g膳食纤维（记为m）置于10 mL量筒中，体积记为V1，室温下加入5 mL蒸馏水放置24 h，体积记为V2。
膨胀力(mL/g)=V2−V1m 1.2.6 膳食纤维的结构测定
1.2.6.1 电镜检测
参照文献[21]将发酵前和发酵后的膳食纤维样品放置于烘箱中，干燥至质量恒定，利用扫描电镜观察其超微结构，进行分析比较。
1.2.6.2 红外光谱分析
参照文献[21]分别取两种微量样品研磨压片后，在4000~400 cm−1范围内进行红外测定，并对比分析结果。
1.2.6.3 X-射线衍射分析
参照文献[22]通过X-射线衍射仪测定发酵前和发酵后膳食纤维的晶体结构，取适量样品，磨细后放入样品槽，用表面光滑的玻璃板压实表面，将样品槽插入仪器测定，对其进行定性定量分析。
1.2.7 抗氧化活性测定
1.2.7.1 DPPH自由基清除力的测定
参照涂宗财等[23]的方法并稍做改动，将发酵前后膳食纤维配制成不同浓度梯度的溶液，实验组：取1 mL样品与1 mL 0.1 mmol/L的DPPH-乙醇混合溶液，反应30 min，在517 nm处测定各浓度膳食纤维溶液的吸光度值，记为A1；对照组：以乙醇代替DPPH与样品反应测得吸光度值记为A2；空白组：用蒸馏水代替样品在同等条件下测定吸光度值，标记为A0；阳性对照组：相同浓度的VC溶液，计算DPPH自由基清除能力公式如下：
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 1.2.7.2 还原力的测定
参照铁氰化钾法[24]，将发酵前后膳食纤维配制成不同浓度梯度的溶液，然后依次加入2.5 mL 0.2 mol/L的PBS缓冲液和2.5 mL 1%的KFe（CN）6溶液，轻轻摇匀后将混合溶液在50 ℃条件下恒温反应20 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，6000 r/min离心10 min后吸取上清液2.5 mL，再依次加入2.5 mL去离子水、1.0 mL浓度为0.1%的FeC13。以双蒸水为参照用紫外分光光度计在700 nm处测定吸光值，并用VC作为阳性参照。
1.2.7.3 羟基自由基清除力的测定
参照文献[25]的方法，将发酵前后膳食纤维配制成不同浓度梯度的溶液，实验组：取1 mL样品依次加入1.0 mL 9 mmol/L 的硫酸亚铁溶液、1.0 mL 9 mmol/L 的水杨酸溶液和0.5 mL 0.1%的过氧化氢溶液后摇匀，在37 ℃下反应30 min后在510 nm波长条件下测定吸光度值，记为A1；对照组：以蒸馏水代替硫酸亚铁溶液、过氧化氢溶液和水杨酸与样品反应，相同条件下所测得的吸光度值记为A2；空白组：用蒸馏水代替样品溶液，测定同样的条件下的吸光度值记为A0；阳性对照组：相同浓度的VC溶液，计算羟基自由基清除率公式如下：
羟基自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 1.3 数据处理
所有实验数据均平行测定3次，基础数据采用Excel处理，响应面试验由Design Expert 8.0.6进行设计分析，作图采用Origin2021b软件。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 发酵时间对SDF提取率的影响
图1结果显示，在发酵初期，随着时间的增长，蔗渣SDF的提取率也逐渐上升，发酵时间在72 h的时候，SDF提取率达到最大，之后就呈现下降趋势，这与闵钟熳等[15]研究结果相似。这是由于随着时间的增长，菌体也在逐渐增长和繁殖，分泌的降解酶也逐渐增多，对底物逐渐进行分解利用，积累的SDF也逐渐增多，而在72 h之后，SDF提取率开始下降，可能是细菌生长到达了发酵后期，菌体逐渐开始死亡，所以发酵效率开始逐渐降低，也可能由于发酵后期底物中的营养物质不足以提供菌体生长繁殖，导致SDF积累减少，所以，最适发酵时间为72 h。
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图 1 发酵时间对蔗渣SDF提取率的影响Figure 1. Effect of fermentation time on extraction rate of bagasse soluble dietary fiber2.1.2 接种量对SDF提取率的影响
由图2可知在接种量为2%~10%之间，随着接种量的增大，SDF的提取率也在逐渐增大，接种量达到10%时，SDF提取率达到了最大值，接种量大于10%后，SDF提取率开始下降。许睿娉[26]研究发现在装液量为50 mL时，枯草芽孢杆菌最佳接种量为10%；随着接种量的增大，菌体生长繁殖逐渐旺盛，对底物充分利用，分泌的酶量也逐渐增多，将会促进SDF的积累，在接种量达到10%时，SDF提取率达到了最大值，提高接种量到12%的时候，SDF提取率开始下降，可能是由于菌体生长繁殖过于旺盛，底物营养物质供应不足以促使分解，开始逐渐消耗积累的膳食纤维，造成SDF的含量下降，所以最适接种量为10%。
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图 2 接种量对蔗渣SDF提取率的影响Figure 2. Effect of inoculation amount on extraction rate of bagasse soluble dietary fiber2.1.3 pH对SDF提取率的影响
由图3可知培养基pH在7时，蔗渣SDF提取率达到了最大值，这与闵钟熳等[17]研究发现利用枯草芽孢杆菌制备米糠粕中膳食纤维时，最佳发酵pH为7的结果一致，在pH偏酸性或者碱性时，SDF提取率均较低，这可能是由于菌体的最适pH为7，微生物在生长繁殖时都有一定最适的pH范围，查阅资料[27]可知大多数细菌生长的最适范围在6.3～7.5。且芽孢杆菌芽孢形成最适pH为6.5～7.8，而且当pH在最适范围内时其芽孢的形成量比较恒定。所以此时菌体生长最好，分解效率也最高，所以最佳pH为7。
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图 3 pH对蔗渣SDF提取率的影响Figure 3. Effect of pH on extraction rate of bagasse soluble dietary fiber2.2 响应面试验结果
2.2.1 试验设计与结果
以单因素实验结果为基础，根据响应面试验Box-Behnken设计原理，以发酵时间、接种量及培养基pH作为响应因素，以可溶性膳食纤维的提取率（SDF）作为响应值，设计三因素三水平的分析实验，对数据进行回归分析及显著性检验，确定最佳工艺，结果见表2。
表 2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2. Experimental scheme and results of Box-Behnken design试验号 A：发酵时间（h） B：接种量（%） C：pH SDF提取率（%） 1 72 12 6 12.49 2 84 12 7 13.15 3 60 8 7 12.03 4 72 8 6 10.25 5 72 12 8 10.03 6 60 10 8 10.21 7 72 10 7 18.25 8 72 10 7 19.11 9 84 8 7 12.11 10 72 8 8 12.01 11 60 12 7 13.91 12 84 10 6 10.79 13 60 10 6 12.77 14 72 10 7 17.96 15 84 10 8 11.37 16 72 10 7 17.15 17 72 10 7 17.12 2.2.2 回归方程与方差分析
对回归模型进行方差分析（表3），可知P值<0.0001，表明回归方程达到了极显著水平，模型显著回归。模型失拟项P值为0.6869，大于0.05，表示失拟项不显著，实验误差较小，拟合度高。显著性检验表明二次项C2表现极为显著，而二次项A2、B2和交互项BC表现显著，说明这些因素对蔗渣SDF提取率的影响较大。由F值的大小可知影响因素影响大小顺序：接种量>pH>发酵时间。回归模型R2=0.9749，大于90%，代表其相关性较好；R2adj=0.9427说明有94.27%的SDF提取率变异分布在3个相关因素中。此模型回归方程为：Y=17.92−0.19A+0.40B−0.34C−0.21AB+0.79AC−1.05BC−2.51A2−2.60B2−4.12C2。分析结果表明利用响应面法设计所得的回归模型适用于蔗渣SDF制备实验。
表 3 回归模型的方差分析和显著性检验Table 3. Analysis of variance and significance test of regression model来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 149.88 9 16.65 30.27 <0.0001 A发酵时间 0.28 1 0.28 0.51 <0.0001 B接种量 1.26 1 1.26 2.30 0.1734 C pH 0.90 1 0.90 1.63 0.2422 AB 0.18 1 0.18 0.32 0.5889 AC 2.46 1 2.46 4.48 0.0721 BC 4.45 1 4.45 8.09 0.0249 A2 26.61 1 26.61 48.37 0.0002 B2 28.55 1 28.55 51.89 0.0002 C2 71.44 1 71.44 129.84 <0.0001 残差 3.85 7 0.55 失拟 1.09 3 0.36 0.53 0.6869 误差 2.76 4 0.69 总和 153.73 16 R2=0.9749 2.2.3 响应面图分析
表3显示，PAB>PAC>PBC，比较P值可知发酵时间与接种量的交互作用对蔗渣膳食纤维制备量干扰最小，而接种量与pH的交互作用对蔗渣膳食纤维制备量干扰最大。根据发酵时间、接种量、pH三个因素交互作用与响应值的关系得出三维响应面和等高线，结果见图4。响应面坡度越陡、等高线越接近椭圆且越稀疏，代表两两因素交互作用对响应值的影响越显著，响应值的改变越敏感；可以看出，BC曲面拱形明显更陡峭，等高线为椭圆形且相对稀疏，其次是AC，这说明接种量与pH交互作用最显著，其次显著的是发酵时间和pH的交互作用，而AB曲面拱形不明显，等高线形状较圆润且相对密集，说明发酵时间和接种量之间的交互作用不显著，这与方差分析结果一致。通过Design Expert 8.0.6软件分析模型确定微生物发酵制备蔗渣膳食纤维最优工艺条件为：接种量10.18%、pH为6.94、发酵时间71.4 h，理论值为18.732%，为方便实际生产，对各因素进行了调整：接种量10%、pH为7、发酵时间71 h，在此条件下蔗渣SDF提取率为17.95%，与理论值相差0.782%，表明实测值和理论值拟合度较高。
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图 4 各因素交互作用对SDF提取率影响的响应面图Figure 4. Response surface plots of the effects of factors on the extraction rate of soluble dietary fiber2.3 理化性质的测定
发酵前（DF）和发酵后膳食纤维（F-DF）的持水力、持油力及膨胀力如表4所示：
表 4 发酵前和发酵后膳食纤维的理化性质Table 4. Physicochemical properties of dietary fiber before and after fermentation样品 持水力（g/g） 持油力（g/g） 膨胀力（mg/L） DF 3.75±0.04a 3.19±0.02a 3.07±0.03a F-DF 5.10±0.09b 6.93±0.13b 5.34±0.11b 注：同列不同字母表示差异显著P<0.05）。 由表可知，发酵后的膳食纤维持水力、持油力及膨胀力均优于未发酵原料，说明在经过发酵处理后，蔗渣的理化性质发生了变化，在持水、持油及膨胀性方面都有所提升。李杨等[28]提出持水性更高可能是由于可溶性膳食纤维质量分数较高，所以得出经过发酵处理后，蔗渣致密的结构遭到破坏，网状结构疏松，产生更多的可溶性膳食纤维，所以持水性更强，同时也有利于水油分子进入，改善其膨胀性。
2.4 结构分析
2.4.1 微观结构测定
图5是发酵前（DF）及发酵后膳食纤维（F-DF）放大500倍的微观结构图。从图中可以看出经过发酵处理的膳食纤维与原料的表观并未发生太大的变化，发酵前原料表面光滑，结构致密，呈现大块状。经过发酵处理后，膳食纤维颗粒变小，表面出现裂纹，有球状颗粒物附着且结构较疏松，可能是由于细菌分泌的降解酶对纤维素进行了降解[15]。且发酵后膳食纤维棱角明显，呈现片层状态，纤维素降解酶将膳食纤维分解成块状及片层状，这说明发酵处理都对蔗渣原料进行了不同程度的降解，并对其微观结构进行了改善。
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图 5 发酵前和发酵后膳食纤维扫描电子显微镜图Figure 5. Scanning electron microscopy of dietary fiber before and after fermentation2.4.2 红外光谱
图6为发酵前和发酵后膳食纤维的傅里叶红外光谱分析图，图中3429 cm−1出现的吸收峰是由于纤维素和半纤维素O-H伸缩振动，代表分子间氢键形成[29]，发酵后膳食纤维F-DF在此处吸收峰的强度比发酵前原料DF更强，说明经过发酵处理F-DF发生糖苷键断裂，促使合成氢键的羟基增多，导致其内部缔合的氢键较多[1]；1603 cm−1处出现的峰可能是多糖分子中羰基的吸收峰，由C=O键伸缩振动引起，表明其中存在糖醛酸[30]，此处F-DF吸收峰强度增大，代表经过发酵及酶处理，样品中糖醛酸增多；1354 cm−1处的吸收峰是由于纤维素与半纤维素结构的O-H或C-O基团的伸缩振动，而1054 cm−1处的吸收峰可能源于纤维素和半纤维素C-O的伸缩振动[31]，两种纤维素吸收峰在此处稍减弱，表明经过发酵处理样品中纤维素和半纤维素减少；551 cm−1处的吸收峰可能是β-C-H的振动特征峰[32]。说明经过处理之后纤维素和半纤维素发生降解，晶体结构被破坏导致结晶度减小，且发酵处理对于纤维素及半纤维素降解更加彻底。
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图 6 发酵前和发酵后膳食纤维傅里叶红外光谱图Figure 6. Fourier transform infrared spectra of dietary fiber before and after fermentation2.4.3 X-射线结构分析
对发酵前和发酵后膳食纤维进行X-射线衍射分析，如图7所示，衍射角2θ在15°~25°的范围内均出现了衍射峰，符合I型纤维素曲线的特征，图中经过发酵处理的样品衍射峰出现的位置和峰形都未发生改变，说明经过发酵处理并没有改变膳食纤维的的结晶构型，而经过发酵处理后的膳食纤维衍射峰强度减弱，说明经过发酵处理之后纤维素和半纤维素发生降解，晶体结构被破坏导致结晶度减小，且发酵处理对于纤维素及半纤维素降解更加彻底。
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图 7 发酵前和发酵后膳食纤维X-射线衍射光谱Figure 7. X-ray diffraction pattern of dietary fiber before and after fermentation2.5 抗氧化实验结果
2.5.1 DPPH自由基清除力
图8中分别描述了发酵前及发酵后膳食纤维的DPPH自由基清除能力，以VC作为对照。整体来看DPPH自由基清除力VC>F-DF>DF，VC的DPPH自由基清除力一直处于平稳状态，发酵前（DF）和发酵后（F-DF）膳食纤维DPPH自由基清除力均随质量浓度的增大而增大，且发酵后膳食纤维的DPPH自由基清除力逐渐接近VC，在质量浓度为6 mg/mL时DPPH自由基清除率达到了82.91%，与VC相差较小。张志旭等[33]研究发现苦瓜膳食纤维在质量浓度为5 mg/mL时DPPH自由基清除率也达到了80%左右。结果证明在质量浓度为6 mg/mL时F-DF有良好的DPPH自由基清除能力，与未发酵原料DF相比，经过发酵法所得的膳食纤维的DPPH自由基清除率提高了32.9%，可能是经过发酵处理，菌体分泌降解酶，作用后使膳食纤维中还原糖含量增多[34]，使得其DPPH自由基清除能力增强，表现出更优的清除能力。
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图 8 发酵前和发酵后膳食纤维DPPH自由基清除能力Figure 8. DPPH radical scavenging ability of dietary fiber before and after fermentation2.5.2 还原力
图9表示发酵前及发酵后膳食纤维的还原力，以VC作为对照。随着质量浓度的增高，VC、F-DF、DF均呈现递增趋势，且VC表现出较强的还原力，F-DF次之。经过发酵处理的膳食纤维还原力更接近VC，在质量浓度为6 mg/mL时还原力达到了0.89，相较于未发酵膳食纤维DF还原力提高了0.70。贾玮等[35]研究发现木瓜果皮中膳食纤维还原力为0.43±0.01，与其相比，发酵后的蔗渣膳食纤维还原力更高，可能是经过发酵处理使样品中可溶性膳食纤维积累量增多，使其表现出良好的还原性。
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图 9 发酵前和发酵后膳食纤维还原力Figure 9. Reducing force of dietary fiber before and after fermentation2.5.3 羟基自由基清除力
图10表示发酵前及发酵后膳食纤维的羟基自由基清除能力，以VC作为对照。VC表现出很强的羟基自由基清除能力，一直趋于一个稳定的状态，接近100%，F-DF和DF的羟基清除力随着质量浓度的增大而增大，且F-DF羟基清除力整体大于DF，并逐渐趋向于VC，在质量浓度为9 mg/mL时F-DF羟基清除力达到了78.53%，相较于未发酵膳食纤维DF羟基清除率提高了50.55%。证明经过发酵处理的膳食纤维具有良好的羟基自由基清除能力。
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图 10 发酵前和发酵后膳食纤维羟基自由基清除能力Figure 10. Hydroxyl radical scavenging ability of dietary fiber before and after fermentation3. 结论
本试验以甘蔗渣作为原料，枯草芽孢杆菌作为发酵菌种，利用微生物发酵法进行可溶性膳食纤维的制备，以单因素实验结果为基础，利用Box-Behnken设计响应面实验分析得到最佳制备工艺为：接种量10.18%、pH为6.94、发酵时间71.4 h，在该条件下重复实验进行验证，对各因素进行调整为接种量10%、pH为7、发酵时间71 h，在此条件下蔗渣SDF提取率为17.95%，与理论值相差0.782%，表明实测值和理论值拟合度较高。利用持水力、持油力及膨胀力作为指标，分析发酵前后膳食纤维理化性质的变化，发现经过发酵处理理化性质改善；对经过发酵前后膳食纤维进行扫描电镜、红外光谱及X-射线衍射分析，超微结构显示发酵后的膳食纤维疏松多孔，呈现片层状，表明发酵处理对蔗渣原料进行了降解，使其变得疏松柔软；红外图谱结果表明发酵所得膳食纤维与原料相比，发酵后膳食纤维的吸收峰强度增大，经过降解糖醛酸增多。X-射线衍射图谱表明发酵后膳食纤维符合I型纤维素曲线的特征，但相比原料衍射峰强度减弱，即经过发酵处理，原料中纤维素发生降解，纤维的结晶区域被破坏。体外抗氧化实验表明，在质量浓度为6 mg/mL时，发酵后膳食纤维表现出较强的DPPH自由基清除力、相对还原力分别达到了82.91%、0.89，在质量浓度为9 mg/mL时羟基自由基清除力达到了78.53%，接近于VC，表明经过发酵处理可以可以改善膳食纤维理化性质及结构，有效提高膳食纤维的体外抗氧化活性。
本试验利用枯草芽孢杆菌发酵制备膳食纤维，SDF提取率略高于保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌发酵制备的SDF，可能是由于枯草芽孢杆菌可以直接分泌大量纤维素酶等消化酶类作用于蔗渣；相较于黑曲霉等丝状真菌制备膳食纤维，虽然枯草芽孢杆菌制备膳食纤维发酵时间更短，且在发酵过程中会产生多种物质抑制病原微生物，但枯草芽孢杆菌SDF提取率略低于黑曲霉发酵SDF提取率，这是由于丝状真菌中纤维素酶含量较高，这也正是本实验的不足之处，因此，还有待进一步深入寻找能够高效降解纤维素且发酵时间较短且过程简易的菌株。经过枯草芽孢杆菌制备的膳食纤维粒径变小蔗渣膳食纤维理化性质及结构特性都有所改善，可溶性膳食纤维含量增多，持水膨胀性变强，可以增加饱腹感；结构疏松，入口更加柔软，促进肠道蠕动，使其成为优质膳食纤维的制备原料，提高了蔗渣在食品工业中的利用率，为蔗渣的有效利用提供了依据，减少了资源浪费。
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图 1 发酵时间对蔗渣SDF提取率的影响
Figure 1. Effect of fermentation time on extraction rate of bagasse soluble dietary fiber
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图 2 接种量对蔗渣SDF提取率的影响
Figure 2. Effect of inoculation amount on extraction rate of bagasse soluble dietary fiber
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图 3 pH对蔗渣SDF提取率的影响
Figure 3. Effect of pH on extraction rate of bagasse soluble dietary fiber
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图 4 各因素交互作用对SDF提取率影响的响应面图
Figure 4. Response surface plots of the effects of factors on the extraction rate of soluble dietary fiber
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图 5 发酵前和发酵后膳食纤维扫描电子显微镜图
Figure 5. Scanning electron microscopy of dietary fiber before and after fermentation
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图 6 发酵前和发酵后膳食纤维傅里叶红外光谱图
Figure 6. Fourier transform infrared spectra of dietary fiber before and after fermentation
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图 7 发酵前和发酵后膳食纤维X-射线衍射光谱
Figure 7. X-ray diffraction pattern of dietary fiber before and after fermentation
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图 8 发酵前和发酵后膳食纤维DPPH自由基清除能力
Figure 8. DPPH radical scavenging ability of dietary fiber before and after fermentation
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图 9 发酵前和发酵后膳食纤维还原力
Figure 9. Reducing force of dietary fiber before and after fermentation
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图 10 发酵前和发酵后膳食纤维羟基自由基清除能力
Figure 10. Hydroxyl radical scavenging ability of dietary fiber before and after fermentation
表 1 响应面试验因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
因素 水平 −1 0 1 A：发酵时间（h） 60 72 84 B：接种量（%） 8 10 12 C：pH 6 7 8 
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表 2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Experimental scheme and results of Box-Behnken design
试验号 A：发酵时间（h） B：接种量（%） C：pH SDF提取率（%） 1 72 12 6 12.49 2 84 12 7 13.15 3 60 8 7 12.03 4 72 8 6 10.25 5 72 12 8 10.03 6 60 10 8 10.21 7 72 10 7 18.25 8 72 10 7 19.11 9 84 8 7 12.11 10 72 8 8 12.01 11 60 12 7 13.91 12 84 10 6 10.79 13 60 10 6 12.77 14 72 10 7 17.96 15 84 10 8 11.37 16 72 10 7 17.15 17 72 10 7 17.12
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表 3 回归模型的方差分析和显著性检验
Table 3 Analysis of variance and significance test of regression model
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 149.88 9 16.65 30.27 <0.0001 A发酵时间 0.28 1 0.28 0.51 <0.0001 B接种量 1.26 1 1.26 2.30 0.1734 C pH 0.90 1 0.90 1.63 0.2422 AB 0.18 1 0.18 0.32 0.5889 AC 2.46 1 2.46 4.48 0.0721 BC 4.45 1 4.45 8.09 0.0249 A2 26.61 1 26.61 48.37 0.0002 B2 28.55 1 28.55 51.89 0.0002 C2 71.44 1 71.44 129.84 <0.0001 残差 3.85 7 0.55 失拟 1.09 3 0.36 0.53 0.6869 误差 2.76 4 0.69 总和 153.73 16 R2=0.9749
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表 4 发酵前和发酵后膳食纤维的理化性质
Table 4 Physicochemical properties of dietary fiber before and after fermentation
样品 持水力（g/g） 持油力（g/g） 膨胀力（mg/L） DF 3.75±0.04a 3.19±0.02a 3.07±0.03a F-DF 5.10±0.09b 6.93±0.13b 5.34±0.11b 注：同列不同字母表示差异显著P<0.05）。
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