Non-targeted Metabolomics Analysis of the Effects of Arabinogalactan on the Metabolites of Akkermansia muciniphila
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摘要: 众多植物多糖中，阿拉伯半乳聚糖对嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）模式菌株（DSM 22959）的促生长效果最佳。为进一步探究阿拉伯半乳聚糖对Akk代谢物的影响，本研究将阿拉伯半乳聚糖作为部分碳源对Akk进行体外发酵培养，确定了阿拉伯半乳聚糖的补充量以便于Akk发酵液样本的后续分析，采用高分辨非靶向代谢组学技术对Akk发酵液样本中的差异代谢物进行了检测及分析。研究发现，菌株发酵液中呈显著变化（VIP> 1，P<0.05）的差异代谢物共85种，差异代谢通路共32条。结果表明，阿拉伯半乳聚糖可通过影响新陈代谢通路、氨基酸生物合成通路、2-氧代羧酸代谢通路、ABC转运蛋白通路等代谢途径，促使Akk产生更多具有特殊功效的代谢产物如次黄嘌呤、罗汉松酯酚、丙酸等，分别具有减肥、抗癌及降血压的潜能。本研究结果为未来将阿拉伯半乳聚糖作为Akk的益生元或与Akk联合作为合生元提供了理论依据。Abstract: Among many plant polysaccharides, arabinogalactan had the best growth-promoting effect on Akkermansia muciniphila (Akk) model strain (DSM 22959). In order to further explore the influence of arabinogalactan on Akk metabolites, arabinogalactan was used as part of the carbon source to ferment Akk in vitro for the first time, and determined the supplementary amount of arabinogalactan to facilitate the Akk fermentation broth. In the subsequent analysis of the samples, high-resolution non-targeted metabolomics technology was used to detect and analyze the differential metabolites in the Akk fermentation broth samples. The results showed that there were 85 different metabolites (VIP>1, P<0.05) and 32 different metabolic pathways. This study confirmed that the arabinogalactan could affect metabolic pathways, biosynthesis of amino acids, 2-oxocarboxylic acid metabolism, ABC transporters and other metabolic pathways, promoting Akk to produce more metabolites with special effects, such as hypoxanthine, mohanone phenol, propionic acid, etc., which had potential of weight loss, anti-cancer and blood pressure lowering, respectively. The results of this study will provide a theoretical basis for the use of arabinogalactan as a prebiotics of Akk or its biogenesis in the future.
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摄入多糖类成分可调节动物肠道菌群从而增强机体免疫[1]，进而靶向干预疾病[2]，其中，植物多糖作为天然食物和中药的主要成分，受到研究者的广泛关注[3]。区别于其它植物多糖，阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan）是一种从落叶松树树干中提取，具有多分支结构的水溶性多糖[4]，其主链为半乳聚糖，侧链主要由阿拉伯糖组成[5]。经动物试验证明[6]，阿拉伯半乳聚糖无急性毒性与遗传毒性，现已广泛应用于医药及食品领域。此外，阿拉伯半乳聚糖亦可显著提高肠道内有益菌的丰度，对双歧杆菌的增益效果显著[7]。其可通过肠道菌群发酵，产生以丁酸为主的短链脂肪酸[8]，增强巨噬细胞抗微生物活性[9]，并促进NO、IL-6、TNF-α的分泌[10]，起到对疾病的预防及调控的作用。此外，阿拉伯半乳聚糖与乳酸菌共培养可提高肠道耐受性[11]，也可提升犊牛体外抗菌性能[12]。这些发现将为阿拉伯半乳聚糖作为益生元与肠道菌共同培养的可行性提供了有力依据。
传统一代益生菌常源于发酵食品，多以乳酸菌为主，而二代益生菌菌株来源更广泛，称为活体生物治疗药品[13]。嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）作为目前备受瞩目的二代益生菌之一，是典型的肠道微生物，由于其可有效缓解早衰症[14]被称为长寿菌[15]。Akk作为肠腔与宿主细胞间黏膜界面的关键微生物[16]，与酒精性脂肪肝（AHS）[17]、溃疡性结肠炎（UC）[18]、炎症性肠病（IBD）[19]、高血压[20]等疾病密切相关。一些临床试验已证实了Akk在代谢性疾病中的安全性及治疗价值[21]，美国一家上市公司现已将其作为特医益生菌产品用于糖尿病的治疗[22]。现有研究证实，在各类代谢疾病中肠道菌群及其代谢物具有关键性作用[23]，Akk的特殊功效性或许与其在肠道中的代谢物有关。在黏蛋白或胰蛋白酶消化物的存在下，Akk可发酵半乳糖、岩藻糖、葡萄糖和N-乙酰基己糖胺[24]和阿拉伯糖[25]，但其发酵后的代谢产物以及哪些代谢产物与疾病调控相关均未见报道。本团队在前期研究中，筛选了大量的植物多糖作为补充碳源对Akk进行体外发酵培养，通过对比分析发现，阿拉伯半乳聚糖对Akk有明显的促生长作用，这或许与阿拉伯半乳聚糖的组成有关。
本研究为进一步分析阿拉伯半乳聚糖对Akk代谢物的影响，将阿拉伯半乳聚糖作为Akk菌的部分碳源进行体外发酵培养，确定了阿拉伯半乳聚糖的补充量以便于Akk发酵液样本的后续分析，通过高分辨非靶向代谢组学技术，利用液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）对Akk发酵液样本进行分析，筛选出Akk发酵阿拉伯半乳聚糖后呈显著变化的差异代谢物，结合KEGG通路探讨Akk代谢途径及代谢物富集情况，分析发酵液中Akk代谢物的变化并对部分代谢物的特殊功效进行讨论。旨在为未来将阿拉伯半乳聚糖作为Akk菌的益生元或与Akk作为合生元，以预防、调控各类疾病，以及阿拉伯半乳聚糖的功能性开发与应用提供重要的科学理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
Akkermansia muciniphila（DSM 22959） 北京北纳创联生物技术研究院；阿拉伯半乳聚糖（80%） 俄罗斯阿美提斯股份公司；液体硫乙醇酸盐培养基、脑心浸液肉汤培养基（BHI） 青岛高科园海博生物技术有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）等试剂 天津天力化学试剂有限公司；硫胺素（≥98%）等试剂 北京奥博星生物技术有限公司；1499230-935乙腈（分析纯）、70221乙酸铵（≥98%） 德国默克公司。
SPL-80生化培养箱 天津莱玻特瑞仪器设备有限公司；LC-85C隔膜式抽气泵 上海力辰邦西仪器科技有限公司；GI54DWS高压灭菌器 美国致微公司；UV752N紫外分光光度仪 上海仪电分析仪器有限公司；5430R低温高速离心机 德国艾本德公司；AB Triple TOF 6600质谱仪 美国爱博才思公司；Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪 美国安捷伦科技公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种活化与传代
将200 μg嗜黏蛋白阿克曼菌冻干菌粉接种于10 mL硫乙醇酸盐液体培养基（厌氧除氧24 h），菌种复活后，按4.5%（浓度约为1.0×107 CFU/mL）接菌量[26]传代，放入厌氧罐（101 kPa、90% N2、10% CO2）中，于37 ℃生化培养箱中厌氧条件下培养至对数生长期，连续传代三次备用，全程无菌操作。
1.2.2 培养基的配制
培养基配方参考专利[26]，各成分不分先后加于蒸馏水，使各组成成分充分溶解，搅拌均匀后，于121 ℃，15 min灭菌处理，冷却后放于4 ℃冰箱内保存。后续试验中，阿拉伯半乳糖作为补充碳源按比例进行添加。
1.2.3 培养基中阿拉伯半乳聚糖补充量的确定
Akk为典型肠道厌氧菌培养条件苛刻，常通过测定Akk菌液密度即测定菌液OD600 nm处的吸光度，以比较不同培养基中Akk的生长效果[27]。本团队在前期研究中发现，Akk活菌平板计数测定时，7 d培养尚无明显菌落，15 d后，出现比针尖细小白色菌落，肉眼极难观察，亦证实已有的文献报道中该菌培养均不采用平板计数法的缘由。由此，本试验确定利用测定菌液密度的方法来探究Akk的生长状况。除此之外，本团队前期研究已证明：阿拉伯半乳聚糖对Akk有着显著的促生长作用，本试验的重点为阿拉伯半乳聚糖对Akk代谢物的影响，为得到较为适合的Akk发酵液样本，因此对阿拉伯半乳聚糖的补充量进行确定。
培养基中阿拉伯半乳聚糖的补充量分别为0、3、5、7 g/L，用1 mol/L盐酸调整培养基pH至6.50±0.05，121 ℃灭菌15 min备用[28]。将对数生长期的三代菌液厌氧培养（37 ℃，28 h）后，每4 h用紫外分光光度计测一次菌液OD600 nm处的吸光度，绘制生长曲线比较Akk的生长效果，以确定阿拉伯半乳聚糖补充量，每组试验重复三次。
1.2.4 嗜黏蛋白阿克曼菌发酵液的制备
将阿拉伯半乳聚糖以最适补充量加于培养基中，记为试验培养基，培养条件同1.2.3，培养至稳定期。取稳定期菌液，1000 r/min下，4 ℃离心3 min，取上清液[29]，于−80 ℃冰箱内保存，作为样本备用，每组试验重复6次。
1.2.5 发酵液样本提取
发酵液样本在4 ℃环境下缓慢解冻后，取适量样本加入预冷甲醇/乙腈/水溶液（2:2:1，v/v），涡旋混合，低温超声30 min，−20 ℃静置10 min，14000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清真空干燥，质谱分析时加入100 µL乙腈水溶液（乙腈:水=1:1，v/v）复溶，涡旋，14000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清液进样分析[30]。
1.2.6 液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）
1.2.6.1 色谱分析条件
所得样本采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统进行分析，利用HILIC色谱柱进行分离，柱温25 ℃，流速0.5 mL/min，进样2 µL进行梯度洗脱。流动相A：水+25 mmol/L乙酸铵+25 mmol/L氨水，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，B从95%线性变化至65%；7～8 min，B从65%线性变化至40%；8～9 min，B维持在40%；9～9.1 min，B从40%线性变化至95%；9.1～12 min，B维持在95%；整个分析过程中样本置于4 ℃自动进样器中[31]。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。
1.2.6.2 质谱分析条件
采用AB Triple TOF 6600质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集。电喷雾离子源条件如下：雾化气压为60 kV，辅助气压为60 kV，帘气为30 arb，发射源温度为600 ℃，喷雾电压±5500 V（正负两种模式）；飞行时间质谱扫描范围60～1000 m/z，产物离子扫描范围25～1000 m/z，飞行时间质谱扫描累积时间0.20 s/spectra，产物离子扫描累积时间0.05 s/spectra；二级质谱采用数据相关采集获得，并且采用高灵敏度模式，去簇电压设为±60 V（正负两种模式），碰撞电压设为（35±15）eV[32]。
1.3 数据处理
培养试验数据均为三次独立重复试验的平均值，采用SPSS 26.0对数据进行统计分析，P˂0.05为差异显著，并结合Origin 2018 9.5版软件来制图。代谢组学数据经预处理后[30]，结合主成分分析法（PCA）及正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）进行多维统计分析。数据通过SPSS 26.0进行独立样本t检验分析，P<0.05为差异显著性判断标准，并对筛选到的显著性差异代谢物（OPLS-DA VIP>1和P<0.05，且有定性名称）进行生物信息学分析。分析平台由上海中科新生命生物科技有限公司提供。
2. 结果与分析
2.1 培养基中阿拉伯半乳聚糖补充量的确定
培养基中阿拉伯半乳聚糖补充量筛选的结果如图1所示。
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图 1 不同浓度阿拉伯半乳聚糖下Akk生长曲线Figure 1. Growth curve of Akk at different concentrations of arabinogalactan由图1可知，阿拉伯半乳聚糖的补充量影响了Akk的生长效果。阿拉伯半乳聚糖补充量为0时的Akk发酵液作为空白组样本，空白组曲线于32 h进入稳定期达到最大OD600 nm值（0.400±0.023），Akk菌增殖数与死亡数渐趋平衡，40 h后进入衰亡期，Akk菌体开始衰变甚至自溶，吸光度降低，曲线下降。加入阿拉伯半乳聚糖后，曲线到达稳定期的时间均后移，补充量为3 g/L时曲线最大OD600 nm值（0.386±0.003），低于空白组，对Akk的生长促进效果不明显；补充量为7 g/L时曲线达到的最大OD600 nm值（0.379±0.001），低于空白组，促进效果也不明显；阿拉伯半乳聚糖补充量为5 g/L时曲线达到的最大OD600 nm值（0.565±0.333）明显高于空白组，对Akk有明显的促生长效果。因此，后续试验选用阿拉伯半乳聚糖补充量为5 g/L的Akk发酵液作为试验组样本，以分析阿拉伯半乳聚糖对Akk代谢物的影响。
2.2 多维统计分析法分析样本中代谢物
国内外对于微生物代谢组学的研究中，常采用主成分分析法（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析法（Orthogonal partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA）对样本中的差异代谢物进行研究[27,30]。本试验通过PCA法对空白组与试验组的Akk发酵液样本进行分析，以掌握发酵液中代谢物的整体情况，并通过构建OPLS-DA模型以筛选出与分组相关的差异物质，为后续进一步筛选发酵液中具有显著性差异的代谢物进行铺垫。
2.2.1 PCA分析
采用PCA法对试验组与空白组样本进行分析，并将鉴定到的所有代谢物重新线性组合得到PCA模型，以分析Akk发酵液中代谢物的整体情况。Akk代谢物PCA得分结果见图2与图3。如图所示，t[1]和t[2]分别代表该模型的两种主成分，相同形状的6个点表示组内的6组生物学重复，图中所有点均分布于95%置信区间内，每组样本的数据点基本都能很好地集中在一起。此外，正离子模式PCA模型参数R2X=0.514，说明该模型的解释率为51.4%；负离子模式PCA模型参数R2X=0.632，说明该模型的解释率为63.2%，结果表明该PCA模型稳定可靠，样本生物学重复性好，可用于后续分析。
2.2.2 OPLS-DA分析
采用OPLS-DA分析法进一步提高模型解析能力及有效性，并得到OPLS-DA模型。利用该模型所得变量权重值（Variable Importance for the Projection，VIP），衡量试验中各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，以筛选出与分组相关的差异物质。图4和图5为Akk代谢物OPLS-DA得分图，图中两组样本的6个重复数据点检测结果基本都能很好的集中在一起，与PCA模型的分析结果大体一致。
为防止建模过程中模型过拟合，通过置换检验法对模型进一步检验，以保证模型有效性。图6和图7为OPLS-DA模型的置换检验图。由图可知，随着置换保留度逐渐降低，R2和Q2均逐渐下降，证明模型稳健性良好。两组样本代谢物正离子模式模型参数中R2X＝0.478，说明该模型对自变量X的解释程度为47.8%；R2Y＝0.988，表示对分类变量Y的解释程度为98.8%；Q2＝0.88，说明该模型对样本变量的预测程度为88%。负离子模式模型对自变量X的解释程度为59.5%；对分类变量Y的解释程度为99.9%；对样本变量的预测程度为98.5%，结果显示OPLS-DA模型稳定性良好且预测能力较强。由于两组样本均比较稳定，且主成分区分很明显，证明两组样本中的代谢物存在明显的组间差异。
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图 6 正离子模式OPLS-DA置换检验注：椭圆形表示R2，矩形表示Q2，虚线表示R2和Q2的回归线。右上角R2和Q2表示置换保留度等于1，即原模型的R2和Q2值；图7同。Figure 6. OPLS-DA replacement test in positive ion mode2.3 Akk发酵阿拉伯半乳聚糖差异代谢物筛选
通过OPLS-DA模型得到变量权重值VIP，VIP > 1的代谢物在模型解释中具有显著贡献。试验选取VIP > 1的差异代谢物，结合显著性分析P<0.05，作为筛选标准，观察两组发酵液样本所得显著性差异代谢物整体情况，对代谢物进行筛选。共筛选出显著性差异代谢物85种，其中，正离子模式中得到54种差异代谢物，负离子模式中得到31种差异代谢物，由于筛选到的代谢物过多，而文章篇幅有限，本文选取差异倍数大于2的代谢物进行展示，结果如表1和表2所示。
表 1 正离子模式Akk发酵阿拉伯半乳聚糖所产显著性差异代谢物Table 1. Significantly different metabolites produced by arabinogalactan fermented by Akk in positive ion mode序号 代谢物名称 变量权重值 差异倍数 P值 1 N-Acetyl-L-methionine乙酰蛋氨酸 1.48023 7.49 0 2 Tyr-Glu酪/谷氨酸 1.03825 4.91 0 3 DL-2-Aminoadipic acid氨基己二酸水合物 1.66781 6.95 0 4 Hypoxanthine次黄嘌呤 2.60105 11.11 0 5 Matairesinol罗汉松脂酚 2.30231 9.14 0 6 L-Methionine蛋氨酸 1.43811 2.83 0 7 L-Phenylalanine苯丙氨酸 3.55107 2.63 0 8 Phe-Asp苯丙/天冬氨酸 1.37337 8.17 0.00001 9 Cytosine胞嘧啶 1.19937 2.23 0.00014 10 L-Leucine亮氨酸 2.9279 3.29 0.00017 11 2-Methylbutyroylcarnitine甲基丁酰卡尼汀 1.21786 2.56 0.0002 12 Cyclopentolate环戊醇胺酯 1.0354 2.2 0.00076 13 Ile-Pro异亮/脯氨酸 3.46878 2.11 0.00357 14 Arg-Glu精/谷氨酸 1.11214 2.35 0.00931 表 2 负离子模式Akk发酵阿拉伯半乳聚糖所产显著性差异代谢物Table 2. Significantly different metabolites produced by arabinogalactan fermented by Akk in negative ion mode序号 代谢物名称 变量权重值 差异倍数 P值 1 L-Methionine蛋氨酸 1.56306 6.45 0 2 Acetyl-DL-Leucine乙酰亮氨酸 15.58218 9.35 0 3 Propionic acid丙酸 3.48657 13.80 0 4 Trans-cinnamate反肉桂酸 1.37764 3.43 0 5 2-Isopropylmalic acid异丙基苹果酸 2.25704 9.50 0 6 Caffeic Acid咖啡酸 2.7964 3.31 0 7 L-Phenylalanine苯丙氨酸 4.91969 11.16 0.00001 8 p-Cresol对甲酚 1.32386 2.82 0.0003 由于表格无法展示出不同发酵液样本中代谢物差异倍数的变化，我们将筛选出的所有显著性差异代谢物进行整合，采用柱状图进行直观比较，Akk发酵阿拉伯半乳聚糖所产差异代谢物的鉴定结果见图8和图9。由图可知，Akk发酵液样本中代谢物差异倍数的变化，红色代表上调即Akk发酵阿拉伯半乳聚糖后呈明显增加趋势的差异代谢物，绿色代表下调即在阿拉伯半乳聚糖的存在下这些代谢物的增长受到了抑制。本文的侧重点在于探讨阿拉伯半乳聚糖能否作为益生元或与Akk作为合生元共同预防调控某些疾病，因此，在阿拉伯半乳聚糖存在下呈增长趋势的差异代谢物是本文的重点研究对象。
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图 8 正离子模式显著性差异代谢物表达差异倍数分析Figure 8. Differential multiple analysis of significant differential metabolite expression in positive ion mode![]()
图 9 负离子模式显著性差异代谢物表达差异倍数分析Figure 9. Differential multiple analysis of significant differential metabolite expression in negative ion mode分析发现，与空白组相比，Akk发酵阿拉伯半乳聚糖后正离子模式中显著上调代谢物共23种，分别为：次黄嘌呤、罗汉松脂酚、苯丙/天冬氨酸、乙酰蛋氨酸、氨基己二酸水合物、酪/谷氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、甲基丁酰卡尼汀、精/谷氨酸、胞嘧啶、环戊醇胺酯、异亮/脯氨酸、异亮/谷氨酸、苏/苯丙氨酸、肌苷、异亮/苏氨酸、γ-谷氨酰L蛋氨酸、腺嘌呤、亮/苏氨酸、精/缬氨酸、谷/赖氨酸；负离子模式中显著上调代谢物共19种，分别为：丙酸、苯丙氨酸、异丙基苹果酸、乙酰亮氨酸、甲硫氨酸、反肉桂酸、咖啡酸、对甲酚、甲基延胡索酸、顺乌头酸、人参皂苷Rc、酮酸、苯乳酸、酮异己酸、3-O-甲基腺苷、甘油三磷酸乙醇胺、甘氨酸、甘露糖、蔗糖。这些在正负离子模式中呈显著上调趋势的代谢产物，代表了Akk发酵阿拉伯半乳聚糖后刺激了这些代谢物的增长，后续将对这些代谢物进行着重分析。
2.4 Akk发酵阿拉伯半乳聚糖差异代谢物聚类分析
本试验为进一步探究差异代谢物之间的联系，通过层次聚类分析法对两组样本中显著性差异代谢物（VIP>1，P<0.05）进行整体分析，结果如图10和图11所示。由图可知，同种代谢物在试验组与空白组中的显著程度明显不同，基本呈相反趋势。在试验组中，某些代谢物分为了多种不同的小簇联系在一起，而小簇之间也有着一定的关联。这代表了这些代谢物间的表达模式有着一定的联系，可能共同参与了同一代谢通路，这为分析Akk发酵阿拉伯半乳聚糖所产代谢物间的联系及它们所经历的代谢通路提供了方向。
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图 10 正离子模式显著性差异代谢物层次聚类热图Figure 10. Hierarchical clustering heat map of significantly different metabolites in positive ion mode![]()
图 11 负离子模式显著性差异代谢物层次聚类热图Figure 11. Hierarchical clustering heat map of significantly different metabolites in negative ion mode目前，对Akk菌的全代谢产物研究尚未见报道，尤其在Akk对糖利用与代谢方面尚属空白，国内仅有研究分析了Akk产短链脂肪酸的情况[33]，而国外最新研究也仅阐释了Akk对黏蛋白的代谢情况[27]。结合2.3的分析结果，本研究发现Akk发酵阿拉伯半乳聚糖后显著性增加的部分代谢物在调控人体疾病方面具有一定的正面效应。次黄嘌呤在正离子模式中上调差异倍数最大，它可降低肥胖小鼠的脂肪质量[34]，具有一定的减肥功效。罗汉松脂酚正离子模式中上调差异倍数仅次于次黄嘌呤，可降低乳腺癌和前列腺癌细胞活性[35]，具有抗癌潜力。负离子模式中上调差异倍数最大的丙酸可以降血压，对高血压引起的心血管损伤起保护作用[36]。除此之外，其他呈上调趋势的差异代谢物如：咖啡酸可以减弱小鼠溃疡性结肠炎，显著减轻黏膜炎症[37]；肌苷可通过PPARγ通路，作用于结肠上皮细胞，进而保护结肠[38]；人参皂苷Rc具有强大的抗炎和抗氧化活性，可用于糖尿病血管并发症的治疗[39]。这些由Akk发酵阿拉伯半乳聚糖后呈显著性增加的差异代谢物的发现，或许与Akk能在某些疾病中发挥正面效应有着千丝万缕的联系，该发现为未来研究Akk能否与阿拉伯半乳聚糖共同调控肠道免疫提供了新的思路。另外，某些代谢物会增加对机体的负面影响，如负离子模式下上调差异倍数第二大的苯丙氨酸，作为人体必需氨基酸，过量的苯丙氨酸可能会加重由T细胞介导的神经炎症[40]，因此，有研究提出补充灭活的Akk相对于活菌可以更好地显著改善肥胖人群的代谢指标[41]。综合以上这些因素，这些由Akk发酵阿拉伯半乳聚糖后增加的代谢物的发现，或许能为未来进一步研究Akk合生元的应用价值提供新的方向。
2.5 差异代谢物KEGG通路注释与分析
2.5.1 差异代谢物KEGG通路注释结果
KEGG是常用于通路研究的数据库之一，为阐明不同差异代谢物与各代谢途径之间的关系，对正负离子模式筛选到的差异代谢物合并后，通过KEGG通路进行分析。共筛选得到代谢通路73条，其中，P < 0.05的代谢通路有32条，KEGG通路注释结果如表3所示。
表 3 显著性差异代谢物KEGG通路注释结果Table 3. KEGG pathway annotation of significantly different metabolites序号 代谢通路ID 代谢通路名称 代谢物数量 P值 富集因子 1 ko01230 Biosynthesis of amino acids氨基酸生物合成 8 5.1567×10−6 0.0625 2 ko01210 2-Oxocarboxylic acid metabolism 2-氧代羧酸代谢 8 7.2443×10−6 0.0597 3 ko02010 ABC transporters ABC转运蛋白通路 8 8.5393×10−6 0.0584 4 ko00052 Galactose metabolism半乳糖代谢 5 2.4896×10−5 0.1087 5 ko04974 Protein digestion and absorption蛋白质消化吸收 5 2.7698×10−5 0.1064 6 ko01100 Metabolic pathways新陈代谢通路 35 4.8269×10−5 0.0127 7 ko00620 Pyruvate metabolism丙酮酸代谢 4 8.7262×10−5 0.1290 8 ko00290 Valine, leucine and isoleucine biosynthesis
缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成3 0.0007 0.1304 9 ko00051 Fructose and mannose metabolism果糖甘露糖代谢 4 0.0008 0.0741 10 ko00230 Purine metabolism嘌呤代谢 5 0.0008 0.0526 11 ko02060 Phosphotransferase system （PTS）磷酸糖转移酶系统 4 0.0009 0.0702 12 ko04973 Carbohydrate digestion and absorption碳水化合物消化吸收 3 0.0011 0.1111 13 ko04978 Mineral absorption矿质养分吸收 3 0.0014 0.1034 14 ko04022 cGMP-PKG signaling pathway cGMP-PKG信号通路 2 0.0026 0.2000 15 ko00966 Glucosinolate biosynthesis芥子油苷生物合成 4 0.0029 0.0519 16 ko04066 HIF-1 signaling pathway低氧诱导因子-1信号通路 2 0.0059 0.1333 17 ko00640 Propanoate metabolism丙酸代谢 3 0.0060 0.0625 18 ko00970 Aminoacyl-tRNA biosynthesis氨酰基-tRNA生物合成 3 0.0075 0.0577 19 ko00360 Phenylalanine metabolism苯丙氨酸代谢 3 0.0111 0.0500 20 ko00940 Phenylpropanoid biosynthesis苯基丙酸生物合成 3 0.0156 0.0441 21 ko00960 Tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis
莨菪碱、哌啶和吡啶生物碱的生物合成3 0.0156 0.0441 22 ko04024 cAMP signaling pathway cAMP信号通路 2 0.0159 0.0800 23 ko00010 Glycolysis/Gluconeogenesis糖酵解/糖代谢合成 2 0.0240 0.0645 24 ko00998 Biosynthesis of various secondary metabolites - part 2
各种次级代谢物的生物合成-第2部分3 0.0248 0.0370 25 ko04742 Taste transduction味觉传导 2 0.0254 0.0625 26 ko00400 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis
苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成2 0.0285 0.0588 27 ko00660 C5-Branched dibasic acid metabolism C5-支链二元酸代谢 2 0.0285 0.0588 28 ko00300 Lysine biosynthesis赖氨酸生物合成 2 0.0301 0.0571 29 ko04150 mTOR signaling pathway mTOR信号通路 1 0.0308 0.2500 30 ko04142 Lysosome溶酶体降解 1 0.0308 0.2500 31 ko04977 Vitamin digestion and absorption维生素消化吸收 2 0.0367 0.0513 32 ko00280 Valine, leucine and isoleucine degradation
缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解2 0.0420 0.0476 2.5.2 差异代谢物KEGG通路富集分析
为更加直观地观察各代谢通路间的差异显著性及代谢物的富集情况，本试验将正负离子模式下两组样本中的差异代谢物合并，通过KEGG通路进行富集分析。本试验根据P值选择了显著性最高的前20条代谢通路，富集分析的结果以气泡图形式进行展示，如图12所示。
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图 12 KEGG富集通路图（气泡图）注：气泡代表代谢通路，其所在横坐标及大小表示该通路在拓扑分析中的富集因子大小，气泡越大富集因子越大；气泡所在纵坐标和颜色表示富集分析的P值（取负常用对数，即-log10 P-value），P值越小，则该代谢通路的差异性越显著。Figure 12. KEGG enrichment pathway diagram （bubble diagram）由图12可知，图中每一个气泡均代表一条代谢通路，气泡颜色的深浅代表了通路差异性的显著程度，气泡直径的大小反映了该通路富集代谢物的多少。图中13条代谢通路P值在2至3之间，气泡直径较小，证明这些通路差异显著性较低且富集代谢物较少，其代表性较差；而图中气泡颜色较深的丙酮酸代谢通路、半乳糖代谢通路及蛋白质消化吸收这3种通路，虽然富集的代谢物较少，但差异显著性较高，证明了Akk生长过程中经历了这3种代谢通路。图中气泡直径最大的为新陈代谢通路，该通路富集代谢物最多，而氨基酸生物合成通路、2-氧代羧酸代谢通路及ABC转运蛋白通路气泡颜色最深显著性最高，证明这4条通路的代表性最高，大部分差异代谢物途经了这4条通路。
2.5.3 KEGG通路中差异代谢物聚类分析
为进一步观察2.5.2中涵盖差异代谢物最多的4条KEGG代谢通路上差异代谢物的表达情况，以聚类热图的形式对这4条通路上对应的差异代谢物进行展示，如图13~图16所示。
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图 14 2-氧代羧酸代谢通路差异代谢物聚类热图Figure 14. Clustering heat map of differential metabolites in 2-Oxocarboxylic acid metabolism pathway![]()
图 15 ABC转运蛋白通路差异代谢物聚类热图Figure 15. Clustering heat map of differential metabolites in ABC transporters pathway![]()
图 16 新陈代谢通路差异代谢物聚类热图Figure 16. Clustering heat map of differential metabolites in metabolic pathwayKEGG的各个通路并非完全独立，存在着普遍的联系，不同代谢通路会涉及相同的代谢物，只是侧重点不同。由图13~图16可知，在氨基酸生物合成通路中显著上调的特征差异代谢物有：酮异己酸、酮酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异丙基苹果酸、氨基己二酸水合物及甲硫氨酸；2-氧代羧酸代谢通路中显著上调的特征差异代谢物有：酮异己酸、酮酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异丙基苹果酸、甲硫氨酸、顺乌头酸及氨基己二酸水合物；ABC转运蛋白通路中显著上调的特征差异代谢物有：蔗糖、亮氨酸、甘露糖、肌苷、苯丙氨酸；新陈代谢通路显著上调的特征差异代谢物有：酮异己酸、酮酸、腺嘌呤、蔗糖、对甲苯酚、咖啡酸、甘露糖、胞嘧啶、亮氨酸、肌苷、苯丙氨酸、罗汉松酯酚、反肉桂酸、氨基己二酸水合物、顺乌头酸、甲基延胡索酸、次黄嘌呤、甲硫氨酸、异丙基苹果酸、丙酸。
新陈代谢通路上富集的差异代谢物包含了氨基酸生物合成通路、2-氧代羧酸代谢通路和ABC转运蛋白通路富集的所有代谢物。其中氨基酸生物合成通路、2-氧代羧酸代谢通路和新陈代谢通路作为KEGG通路中隶属于新陈代谢模块的全览图，与诸多代谢通路密切相关。ABC转运蛋白通路不同于以上3条通路归属于跨膜运输通路，但该通路上富集的代谢物也途经了新陈代谢通路。除以上4条富集代谢物较多的通路外，由表3可知，如：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路及生物合成通路、赖氨酸生物合成通路、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路等，它们与氨基酸的代谢密切相关；半乳糖代谢通路和果糖甘露糖代谢通路与培养基中蛋白质的降解有关[27]。此外，还有磷酸糖转移酶系统（PTS）参与了能量代谢。这些通路间的联系结合代谢物在不同通路上富集的情况，或许能为未来研究Akk的代谢机制提供新的思路。
3. 结论
本研究首次将阿拉伯半乳聚糖作为促Akk增殖碳源进行体外发酵培养，为得到适合的发酵液样本以分析阿拉伯半乳聚糖对Akk代谢物的影响，确定了阿拉伯半乳聚糖的添加量。基于非靶向代谢组学技术对Akk菌的代谢组进行了全面分析，鉴定并筛选出了与空白组培养基发酵液相比具有显著差异的Akk代谢物，并将Akk发酵阿拉伯半乳聚糖后发酵液中显著上调的代谢物作为研究重点，结果表明，这些代谢物中部分具有可正向调控某些疾病的功效，这一发现为未来将阿拉伯半乳聚糖作为Akk菌的益生元或与Akk作为合生元，以预防、调控各类疾病提供了重要的理论依据，也为开发阿拉伯半乳聚糖的更多功能性提供了研发思路。最后，结合KEGG通路探讨了Akk代谢途径间的联系及代谢物在通路中的富集情况，为未来研究Akk的代谢机制提供了新的方向。
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图 1 不同浓度阿拉伯半乳聚糖下Akk生长曲线
Figure 1. Growth curve of Akk at different concentrations of arabinogalactan
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图 6 正离子模式OPLS-DA置换检验
注：椭圆形表示R2，矩形表示Q2，虚线表示R2和Q2的回归线。右上角R2和Q2表示置换保留度等于1，即原模型的R2和Q2值；图7同。
Figure 6. OPLS-DA replacement test in positive ion mode
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图 8 正离子模式显著性差异代谢物表达差异倍数分析
Figure 8. Differential multiple analysis of significant differential metabolite expression in positive ion mode
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图 9 负离子模式显著性差异代谢物表达差异倍数分析
Figure 9. Differential multiple analysis of significant differential metabolite expression in negative ion mode
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图 10 正离子模式显著性差异代谢物层次聚类热图
Figure 10. Hierarchical clustering heat map of significantly different metabolites in positive ion mode
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图 11 负离子模式显著性差异代谢物层次聚类热图
Figure 11. Hierarchical clustering heat map of significantly different metabolites in negative ion mode
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图 12 KEGG富集通路图（气泡图）
注：气泡代表代谢通路，其所在横坐标及大小表示该通路在拓扑分析中的富集因子大小，气泡越大富集因子越大；气泡所在纵坐标和颜色表示富集分析的P值（取负常用对数，即-log10 P-value），P值越小，则该代谢通路的差异性越显著。
Figure 12. KEGG enrichment pathway diagram （bubble diagram）
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图 14 2-氧代羧酸代谢通路差异代谢物聚类热图
Figure 14. Clustering heat map of differential metabolites in 2-Oxocarboxylic acid metabolism pathway
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图 15 ABC转运蛋白通路差异代谢物聚类热图
Figure 15. Clustering heat map of differential metabolites in ABC transporters pathway
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图 16 新陈代谢通路差异代谢物聚类热图
Figure 16. Clustering heat map of differential metabolites in metabolic pathway
表 1 正离子模式Akk发酵阿拉伯半乳聚糖所产显著性差异代谢物
Table 1 Significantly different metabolites produced by arabinogalactan fermented by Akk in positive ion mode
序号 代谢物名称 变量权重值 差异倍数 P值 1 N-Acetyl-L-methionine乙酰蛋氨酸 1.48023 7.49 0 2 Tyr-Glu酪/谷氨酸 1.03825 4.91 0 3 DL-2-Aminoadipic acid氨基己二酸水合物 1.66781 6.95 0 4 Hypoxanthine次黄嘌呤 2.60105 11.11 0 5 Matairesinol罗汉松脂酚 2.30231 9.14 0 6 L-Methionine蛋氨酸 1.43811 2.83 0 7 L-Phenylalanine苯丙氨酸 3.55107 2.63 0 8 Phe-Asp苯丙/天冬氨酸 1.37337 8.17 0.00001 9 Cytosine胞嘧啶 1.19937 2.23 0.00014 10 L-Leucine亮氨酸 2.9279 3.29 0.00017 11 2-Methylbutyroylcarnitine甲基丁酰卡尼汀 1.21786 2.56 0.0002 12 Cyclopentolate环戊醇胺酯 1.0354 2.2 0.00076 13 Ile-Pro异亮/脯氨酸 3.46878 2.11 0.00357 14 Arg-Glu精/谷氨酸 1.11214 2.35 0.00931 
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表 2 负离子模式Akk发酵阿拉伯半乳聚糖所产显著性差异代谢物
Table 2 Significantly different metabolites produced by arabinogalactan fermented by Akk in negative ion mode
序号 代谢物名称 变量权重值 差异倍数 P值 1 L-Methionine蛋氨酸 1.56306 6.45 0 2 Acetyl-DL-Leucine乙酰亮氨酸 15.58218 9.35 0 3 Propionic acid丙酸 3.48657 13.80 0 4 Trans-cinnamate反肉桂酸 1.37764 3.43 0 5 2-Isopropylmalic acid异丙基苹果酸 2.25704 9.50 0 6 Caffeic Acid咖啡酸 2.7964 3.31 0 7 L-Phenylalanine苯丙氨酸 4.91969 11.16 0.00001 8 p-Cresol对甲酚 1.32386 2.82 0.0003
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表 3 显著性差异代谢物KEGG通路注释结果
Table 3 KEGG pathway annotation of significantly different metabolites
序号 代谢通路ID 代谢通路名称 代谢物数量 P值 富集因子 1 ko01230 Biosynthesis of amino acids氨基酸生物合成 8 5.1567×10−6 0.0625 2 ko01210 2-Oxocarboxylic acid metabolism 2-氧代羧酸代谢 8 7.2443×10−6 0.0597 3 ko02010 ABC transporters ABC转运蛋白通路 8 8.5393×10−6 0.0584 4 ko00052 Galactose metabolism半乳糖代谢 5 2.4896×10−5 0.1087 5 ko04974 Protein digestion and absorption蛋白质消化吸收 5 2.7698×10−5 0.1064 6 ko01100 Metabolic pathways新陈代谢通路 35 4.8269×10−5 0.0127 7 ko00620 Pyruvate metabolism丙酮酸代谢 4 8.7262×10−5 0.1290 8 ko00290 Valine, leucine and isoleucine biosynthesis
缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成3 0.0007 0.1304 9 ko00051 Fructose and mannose metabolism果糖甘露糖代谢 4 0.0008 0.0741 10 ko00230 Purine metabolism嘌呤代谢 5 0.0008 0.0526 11 ko02060 Phosphotransferase system （PTS）磷酸糖转移酶系统 4 0.0009 0.0702 12 ko04973 Carbohydrate digestion and absorption碳水化合物消化吸收 3 0.0011 0.1111 13 ko04978 Mineral absorption矿质养分吸收 3 0.0014 0.1034 14 ko04022 cGMP-PKG signaling pathway cGMP-PKG信号通路 2 0.0026 0.2000 15 ko00966 Glucosinolate biosynthesis芥子油苷生物合成 4 0.0029 0.0519 16 ko04066 HIF-1 signaling pathway低氧诱导因子-1信号通路 2 0.0059 0.1333 17 ko00640 Propanoate metabolism丙酸代谢 3 0.0060 0.0625 18 ko00970 Aminoacyl-tRNA biosynthesis氨酰基-tRNA生物合成 3 0.0075 0.0577 19 ko00360 Phenylalanine metabolism苯丙氨酸代谢 3 0.0111 0.0500 20 ko00940 Phenylpropanoid biosynthesis苯基丙酸生物合成 3 0.0156 0.0441 21 ko00960 Tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis
莨菪碱、哌啶和吡啶生物碱的生物合成3 0.0156 0.0441 22 ko04024 cAMP signaling pathway cAMP信号通路 2 0.0159 0.0800 23 ko00010 Glycolysis/Gluconeogenesis糖酵解/糖代谢合成 2 0.0240 0.0645 24 ko00998 Biosynthesis of various secondary metabolites - part 2
各种次级代谢物的生物合成-第2部分3 0.0248 0.0370 25 ko04742 Taste transduction味觉传导 2 0.0254 0.0625 26 ko00400 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis
苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成2 0.0285 0.0588 27 ko00660 C5-Branched dibasic acid metabolism C5-支链二元酸代谢 2 0.0285 0.0588 28 ko00300 Lysine biosynthesis赖氨酸生物合成 2 0.0301 0.0571 29 ko04150 mTOR signaling pathway mTOR信号通路 1 0.0308 0.2500 30 ko04142 Lysosome溶酶体降解 1 0.0308 0.2500 31 ko04977 Vitamin digestion and absorption维生素消化吸收 2 0.0367 0.0513 32 ko00280 Valine, leucine and isoleucine degradation
缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解2 0.0420 0.0476
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百度学术
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