Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Phenylethanoside from Cistanche tubulosa and Its Antioxidant Activities
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摘要: 为优化超声辅助提取新疆管花肉苁蓉中苯乙醇苷的工艺，在单因素实验的基础上，取提取温度、乙醇浓度、料液比进行响应面优化，得到肉苁蓉苯乙醇苷的最佳提取工艺为：超声温度40 ℃，料液比1:41.7 g/mL、乙醇浓度51%，在该条件下苯乙醇苷得率为(14.36±0.12) mg/g。提取物主要由松果菊苷和毛蕊花糖苷构成，含量分别为(12.96±0.33) mg/g和(1.19±0.09) mg/g。苯乙醇苷提取物对羟基自由基和DPPH自由基具有较强的清除能力，其半抑制浓度（IC50）分别为60.196 mg/mL和0.875 mg/mL。本研究为新疆管花肉苁蓉苯乙醇苷的提取提供了基础数据。Abstract: In order to optimize the ultrasonic-assisted extraction process of phenylethanol glycosides from Cistanche tubulosa (Ct) in Xinjiang, box-behnken design was used to optimize the extraction conditions based on single factor experiments. Optimal conditions were the temperature of 40 ℃, the solid-liquid ratio of 1:41.7 g/mL and the ethanol concentration of 51%. The extraction yield under the optimal conditions was (14.36±0.12) mg/g. The extracts were mainly composed of echinacoside and verbascoside, the contents of which were (12.96±0.33) mg/g and (1.19±0.09) mg/g, respectively. The phenylethanoside extracts showed strong scavenging ability to hydroxyl radical and DPPH free radical, and the semi-inhibitory concentration (IC50) values were 60.196 mg/mL and 0.875 mg/mL, respectively. This study provides basic data for the extraction of phenylethanoside from Cistanche tubulosa in Xinjiang.
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肉苁蓉（Cistanche tubulosa （Schrenk）. R. Wight）也称寸芸、大芸、苁蓉、地精等，列当科寄生植物[1]，主要分布在我国内蒙古、甘肃、新疆等干旱或半干旱地区。肉苁蓉始载于《神农本草经》，有良好的药用价值和滋补作用，被誉为“沙漠人参”，肉苁蓉性温，具有补肾益阳、润肠通便的功效，可用于治疗由于精血不足而引起的肾虚、月经不畅、女性不孕、尿频等[2]。现代药理学研究发现，肉苁蓉具有抗疲劳[3]、协调内分泌[4]、延缓衰老[3]、降低肝损伤[5]、增强机体免疫力[6]、抗炎[7]、抗肿瘤[8]、防治脑缺血[9]等作用。其药理活性主要源于其中所含的多种生物活性物质，包括多糖、苯乙醇苷类、黄酮、多酚类、萜类、生物碱等[10-12]。
苯乙醇苷（Phenylethanoid glycosides，PhGs）是肉苁蓉的主要活性成分之一[13]，主要成分为松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和肉苁蓉苷A等[14-15]。研究发现，苯乙醇苷类化合物是肉苁蓉发挥延缓衰老、提高兴奋性、补肾益气[4]、提高记忆力[16]、修复慢性肝损伤[17]、预防老年性痴呆[18]等生理活性的主要物质。苯乙醇苷的提取方式主要有热水回流法[19]、浸渍法[20]、微波辅助提取[21]和超声辅助提取[22]等。对苯乙醇苷的提取，传统有机溶剂提取研究较多，但存在耗时、提取效率低等问题；微波辅助提取相较于传统有机溶剂提取有更好的提取效果，但微波提取条件要求更高，不宜推广应用；超声波辅助提取所需控制的提取条件要求较低，安全性较好且提取效率高，有广泛的适用性，因此，本文选择超声波辅助提取技术。
本文以新疆管花肉苁蓉为研究对象，采用响应面法优化超声波辅助提取其苯乙醇苷类化合物的最佳工艺，进一步采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromtography，HPLC）对提取物中的苯乙醇苷类化合物进行定性定量分析，并研究了提取物对羟基自由基和DPPH自由基清除能力，为新疆管花肉苁蓉的精深加工提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
管花肉苁蓉 于2020年4月15日采自新疆和田洛浦县，采集大小均匀（直径5 cm左右，长度20 cm左右），无病虫害及机械损伤的样品，样品经切分并冷冻干燥，粉碎后过60目筛，并于−18 ℃密封、避光保存备用；甲醇、乙腈、甲酸 均为色谱纯，德国Merck公司；松果菊苷、毛蕊花糖苷（含量≥98%，标准品）、抗坏血酸（VC，含量≥98%）、二苯基苦味酰基苯肼基自由基（DPPH•，含量≥98%）等试剂 北京索莱宝科技有限公司；如无特殊说明以上试剂均为分析纯。
KQ-50DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；LGJ-25C型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；FW100型高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；D-SY96S型全波长酶标仪 山东竞道广电科技有限公司；BK-FD10P型高速冷冻离心机 广州吉迪仪器有限公司；752S型紫外分光光度计 上海棱光仪器有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪 日本岛津公司；PDA二极管阵列检测器 日本岛津公司。
1.2 实验方法
1.2.1 检测方法的建立
取松果菊苷标准品20 mg，用甲醇定容至25.00 mL，得到苯乙醇苷储备液（0.8 mg/mL），4 ℃保存备用。取松果菊苷储备液，将其稀释10倍，在波长200～800 nm范围内用紫外－分光光度计进行全波长的扫描 [23-24]，得到波长为后续实验测定波长。
分别吸取不同浓度的松果菊苷标准储备液（0.25、0.50、1.00、2.00、2.50和3.0 0 mL）置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容并混匀，得到不同浓度的标准品溶液（0.04、0.08、0.16、0.32、0.40和0.48 mg/mL）。以甲醇为空白，330 nm测得吸光度为y值，浓度为x值，建立标准曲线[25]。
1.2.2 苯乙醇苷提取及得率计算
称取5.00 g肉苁蓉粉末，加200 mL 50%乙醇水溶液于锥形瓶中。浸泡约20 min后40 ℃超声提取30 min，提取液4000 r/min离心10 min后取25 mL上清液，旋蒸至近干，甲醇复溶后定容至25 mL。
苯乙醇苷得率得测定，取1.00 mL样品提取液按照1.2.1的方法，对样品溶液吸光度进行测定，然后根据标准曲线计算出总苯乙醇苷的得率。总苯乙醇苷的得率计算公式[26]。
W(mg/g)=C×Vm (1) 式中：W表示总苯乙醇苷的得率，mg/g；C表示计算通过标准曲线计出的溶液质量浓度，mg/mL；V表示溶液的体积，mL；m表示肉苁蓉取样量，g.
1.2.3 超声辅助提取肉苁蓉苯乙醇苷工艺优化
1.2.3.1 单因素实验
分别研究超声温度（30、35、40、45、50 ℃）、料液比（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL）、乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%）、超声时间（20、30、40、50 、60 min）等条件对肉苁蓉中苯乙醇苷得率的影响。在除了单独研究的自变量因素外，其他条件设为固定值：乙醇浓度50%，料液比1:40 g/mL，超声温度40 ℃，超声时间30 min。
1.2.3.2 Box-Behnken 试验设计
在单因素实验的基础上，选择超声温度（A）、料液比（B）、乙醇浓度（C）为自变量，苯乙醇苷得率（mg/g）为响应值（Y）进行响应面优化试验，试验设计的因素和水平如表1所示。
表 1 响应面试验的因素与水平设计Table 1. Factors and levels design of response surface test因素 水平 −1 0 1 A 超声温度（℃） 35 40 45 B 料液比（g/mL） 1:30 1:40 1:50 C 乙醇浓度（%） 40 50 60 1.2.4 HPLC法测定苯乙醇苷类化合物
精密称取松果菊苷、毛蕊花糖苷标准品各20 mg，加甲醇定容至25.00 mL得到混合对照品储备液。分别吸取储备液0.25、0.50、1.00、2.00、2.50和3.00 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容并混匀，得到不同浓度的标准品溶液（0.04、0.08、0.16、0.32、0.40和0.48 mg/mL），用0.45 μm滤膜过滤即得，4 ℃保存，备用。
通过响应面优化试验得到苯乙醇苷最佳提取工艺并在此条件下进行提取，将提取液离心后取25 mL上清液，旋蒸至近干，25 mL甲醇复溶，用0.45 μm滤膜过滤即得，4 ℃保存，备用。
根据刘伯言[25]的方法，采用恒谱生USHA C18色谱柱（ 250 mm×4.6 mm, 5 μm ），流速0.8 mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：甲酸溶液（0.5%，v/v）；洗脱程序：0～23 min，14%～17%A；24～35 min，17%～20%A；36～45 min，20%A；检测波长：330 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL；采用外标法定量，含量以mg/g DW表示。
1.2.5 苯乙醇苷粗提物体外抗氧化性的测定
1.2.5.1 羟基自由基清除能力的测定
参照Wang等[27]的方法略加修改。分别取50 μL不同浓度（5、15、25、35、45 mg/mL）的肉苁蓉苯乙醇苷提取液加入96孔板中，分别加入50 μL浓度均为6 mmol/L的硫酸亚铁溶液、水杨酸-乙醇和双氧水溶液，混匀后于37 ℃静置30 min。在510 nm处测定其吸光度。以相同浓度的VC溶液为阳性对照。根据公式（2）计算羟基自由基清除率：
羟基自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (2) 式中：A0为蒸馏水代替样液的吸光度；A1为样液的吸光度；A2为蒸馏水代替双氧水的吸光度。
1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的测定
参考Baba等[28]的方法，分别取50 μL不同浓度（0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10 mg/mL）的肉苁蓉苯乙醇苷提取液加入96孔板中，分别加入150 μL浓度为1 mmol/L的DPPH•乙醇溶液，混匀后于37 ℃下避光放置30 min。在517 nm处测定其吸光度；以相同浓度的VC溶液为阳性对照。计算公式（3）：
DPPH自由基清除率(%)=A1−A2A1×100 (3) 式中：
A1为蒸馏水代替样品的吸光度值 ；A2 代表样品的吸光度值。1.3 数据处理
所有实验重复三次，数据以平均值±标准差（SD）表示，利用Design-Expert 13.0统计软件进行响应面优化分析，数据分析处理采用SPSS17.0进行。
2. 结果与分析
2.1 标准曲线的建立
利用紫外-分光光度计对松果菊苷标准品溶液进行全波长的扫描，最终在波长330 nm处获得最大吸收峰（如图1），因此，后续波长的测定选择330 nm。不同浓度的标准品溶液在330 nm处测得吸光度为y值，浓度为x值，建立标准曲线，经过线性回归得到松果菊苷标准曲线为：y=8.9339 x+0.0223（R2=0.9993）。由回归系数可知，松果菊苷在0~0.48 mg/mL范围内线性范围良好。
2.2 单因素实验
2.2.1 超声温度对苯乙醇苷得率的影响
如图2所示，超声温度达到40 ℃前，苯乙醇苷的得率不断增加；当超声温度达到40 ℃，苯乙醇苷的得率达到峰值，为13.87 mg/g；当超声温度大于40 ℃时，苯乙醇苷得率逐渐下降。分析原因为随着温度的不断升高，乙醇溶液的粘性降低，分子的热运动速度逐渐加快[22]，苯乙醇苷的得率也随之增加；而苯乙醇苷成分热稳定较低，高温易导致部分热敏性苯乙醇苷类化合物降解[29]。王丽楠等[30]考察了不同初加工温度对肉苁蓉中苯乙醇苷的影响，研究发现随着温度的升高，苯乙醇苷含量有所下降，这一结果与本实验研究结果相同，故后续响应面优化试验温度范围为35~45 ℃。
2.2.2 料液比对苯乙醇苷得率的影响
如图3所示，料液比达到1:40 g/mL之前，苯乙醇苷的得率不断增加；当料液比达到1:40 g/mL，苯乙醇苷的得率达到峰值13.745 mg/g当料液比大于1:40 g/mL，苯乙醇苷得率逐渐下降。本文实验结果与刘丽莎[31]的研究结果一致，提取过程中干燥的物料吸水，料液比过低吸水不完全，影响提取效率，但料液比过高时，提取效果并不明显，甚至造成了溶剂的浪费，随着料液比的增加，苯乙醇苷的得率不断增大；但随着料液比的不断增加，溶剂用量不断增加，超声波与肉苁蓉粉末的相互作用减弱[32]，因此，后续响应面优化试验料液比范围是1:30~1:50 g/mL。
2.2.3 乙醇浓度对苯乙醇苷得率的影响
如图4所示，在乙醇浓度达到50%之前，苯乙醇苷的得率不断增加；当乙醇浓度达到50%，苯乙醇苷的得率达到峰值，为13.64 mg/g；当乙醇浓度大于50%时，苯乙醇苷的得率逐渐下降。刘伯言[25]利用超声波辅助提取肉苁蓉苯乙醇苷，其优化结果显示在乙醇浓度为52%时得率最高，此结果与本实验结果相符。这是因为不同浓度的乙醇具有不同的极性[33]，浓度过低会导致苯乙醇苷类化合物提取不充分，过高则会溶解出更多物质，影响得率。综合考虑，50%的乙醇浓度得率最佳，故后续响应面优化试验乙醇浓度范围为40%~60%。
2.2.4 超声时间对苯乙醇苷得率的影响
如图5所示，30 min之前随着时间的增加得率明显提高，30~40 min时得率略有升高，但40 min之后得率又稍有下降。这是因为超声时间过长会导致温度升高，对苯乙醇苷的结构造成一定程度地破坏而影响了提取效率。30~40 min时得率虽稍有提高但差距不大，综合考虑，后续响应面优化试验不再选取此因素。
2.3 响应面优化试验
2.3.1 Box-Behnken试验设计与结果
选择乙醇溶液作为超声提取溶剂，根据单因素实验结果，研究三个变量之间的交互作用，变量的选择为：超声温度、料液比、乙醇浓度，响应值为苯乙醇苷得率。Box-Behnken实验设计，实验结果见表2。
表 2 响应面试验设计及结果Table 2. Response surface design and results序号 A 超声温度 B：料液比 C 乙醇浓度 Y 得率（mg/g DW） 1 1 0 1 12.79 2 −1 −1 0 13.02 3 0 1 −1 12.57 4 −1 0 −1 12.09 5 1 −1 0 13.11 6 0 −1 1 12.90 7 1 0 −1 12.75 8 −1 0 1 13.03 9 1 1 0 13.73 10 0 1 1 13.36 11 0 0 0 14.47 12 0 0 0 14.34 13 0 0 0 14.39 14 0 0 0 14.58 15 0 −1 −1 12.95 16 −1 1 0 13.15 17 0 0 0 14.48 2.3.2 回归方程方差分析及方差分析
根据上述结果，采用Design-Expert 13.0软件建立的二次回归多元方程如下：Y=14.45+0.1376A+0.1038B+0.2150C+0.1225AB−0.2250AC+0.2100BC−0.7398A2−0.4598B2−1.05C2，可以看出方程的每个二次项的系数都为负数，所以该方程存在最大值。
由表3可知，该模型极显著（F值为71.50，P<0.0001），模型的失拟项不显著（F=2.80，P=0.1727）。各项显著性因素统计分析表明，其显著性大小顺序为：C>A>B，即乙醇浓度>超声温度>料液比，C、AC、A2、B2、C2对肉苁蓉苯乙醇苷得率影响极显著（P<0.01），A、B、BC对肉苁蓉苯乙醇苷得率影响显著（P<0.05）。模型的决定系数R2=0.9892，说明模型可以预测实验结果。校正系数R2adj为0.9754，变异系数C.V.=0.9144%，结果表明模型具有可复制性。综上所述，实验拟合的数学模型预测性良好。
表 3 响应面模型方差分析Table 3. Variance analysis of response surface model项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 9.65 9 1.07 71.50 <0.0001 ** A 0.1485 1 0.1485 9.90 0.0162 * B 0.0861 1 0.0861 5.74 0.0477 * C 0.3698 1 0.3698 24.65 0.0016 ** AB 0.0600 1 0.0600 4.00 0.0856 AC 0.2025 1 0.2025 13.50 0.0079 ** BC 0.1764 1 0.1764 11.76 0.0110 * A2 2.30 1 2.30 153.60 <0.0001 ** B2 0.8900 1 0.8900 59.33 0.0001 ** C2 4.62 1 4.62 307.84 <0.0001 ** 残差 0.1050 7 0.0155 失拟项 0.0711 3 0.0245 2.80 0.1727 不显著 纯差 0.0339 4 0.0088 总和 9.76 16 注：*表示显著（P<0.05）；**表示极显著（P<0.01）；R2=0.9892，R2adj=0.9754。 2.3.3 响应面分析
响应面图曲面陡峭，等高线图呈明显的椭圆形，说明两因素交互作用显著。相反，当响应面曲面平缓，等高线图呈现圆形，则表示两者交互作用不显著。
由图6可知，在C因素（乙醇浓度）方向的响应面的曲线比较陡峭，B因素（料液比）方向比较平缓，因此，B因素（料液比）对苯乙醇苷得率的影响要低C因素（乙醇浓度）。响应面图陡峭，等高线图呈明显的椭圆且弧度较大，表示两因素的交互作用显著。
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图 6 乙醇浓度和料液比对苯乙醇苷得率的影响Figure 6. Effect of ethanol concentration and solid-liquid ratio on extraction yield of PhGs由图7可知：A因素（温度）方向的响应面的曲线相比C因素（乙醇浓度）的响应面曲线较为平缓，因此C因素（乙醇浓度）对苯乙醇苷得率的影响比A因素（温度）的影响更大。响应面图陡峭，等高线图呈明显的椭圆，表示两因素的交互作用显著。
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图 7 乙醇浓度和温度对苯乙醇苷得率的影响Figure 7. Effect of ethanol concentration and temperature on extraction yield of PhGs由图8可知：A因素（温度）方向的响应面的曲线相比B因素（料液比）的响应面曲线较为陡峭，因此A因素（温度）对苯乙醇苷得率的影响比的影响更大。响应面图相对平缓，等高线图偏圆形，表示两因素的交互作用不显著。
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图 8 料液比和温度对苯乙醇苷得率的影响Figure 8. Effect of solid-liquid ratio and temperature on extraction yield of PhGs依据以上三个自变量因素对苯乙醇苷得率的影响的分析，可以再次得出影响效果的大小：乙醇浓度>超声温度>料液比。
2.3.4 验证实验
根据响应面的分析结果显示，通过回归方程式求解，使苯乙醇苷的提取量达到最大值时预测得到最佳条件为：超声温度40.437 ℃，料液比1:41.691 g/mL、乙醇浓度51.081%，在此条件下苯乙醇苷得率为14.345 mg/g。考虑实验操作的可行性，将提取条件修改为：超声温度40 ℃，料液比1:41.7 g/mL、乙醇浓度51%。在此条件之下进行三次验证实验，得到苯乙醇苷平均得率为（14.36±0.12） mg/g，表明该模型可用于肉苁蓉苯乙醇苷提取工艺的预测。
2.4 提取物中苯乙醇苷的组成及含量
按照1.2.4方法进行操作，以峰面积（A）为纵坐标，进样溶液中毛蕊花糖苷（松果菊苷）（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，结果见表4。采用HPLC对最优条件下提取物中苯乙醇苷类化合物进行了定性定量分析（图9），结果显示提取物中苯乙醇苷类主要由松果菊苷和毛蕊花糖苷构成，含量为（12.96±0.33）mg/g和（1.19±0.09）mg/g。
表 4 HPLC法测定松果菊苷、毛蕊花糖苷方法学参数Table 4. Methodological parameters of echinoside and acteoside determined by HPLC化合物 出峰时间（min） 标准曲线 R2 线性范围（mg/mL） 松果菊苷 15.027 y=15311296.40x−119140.61 0.999 0.04~0.48 毛蕊花糖苷 36.971 y=21780400.45x−121356.95 0.9996 0.04~0.08 ![]()
图 9 标准品及管花肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的HPLC色谱图注：A：标准品，B：管花肉苁蓉。Figure 9. HPLC chromatogram of phenylethanoside compounds in standards and Cistanche tubulosaLiu等[34]通过超声辅助的方式对阿拉善荒漠肉苁蓉中苯乙醇苷进行提取，提取物中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量分别为1.79%和1.43%。蔡鸿等[35]对68批肉苁蓉进行测定，得到12个新疆管花肉苁蓉的平均质量分数：松果菊苷3.32%，毛蕊花糖苷0.91%。本文中测定松果菊苷和毛蕊花糖苷平均含量为（12.96±0.33）mg/g和（1.19±0.09）mg/g，测定结果与Liu等[34]对荒漠肉苁蓉中苯乙醇苷含量研究相比，两种肉苁蓉中松果菊苷含量差距不大，但荒漠肉苁蓉中毛蕊花糖苷含量明显高于本文测定结果。
2.5 苯乙醇苷提取物抗氧化性
2.5.1 羟基自由基清除能力
由图10可知，随着苯乙醇苷提取物质量浓度的不断增加，苯乙醇苷提取物对羟基自由基的清除能力也随之增强。当苯乙醇苷提取物的质量浓度为35 mg/mL时，其羟基自由基清除率达到44.67%；随后其清除率趋于平缓，当浓度达到45 mg/mL时，清除率为45.04%。在相同浓度下，苯乙醇苷提取物对羟基自由基清除能力远小于抗坏血酸，二者IC50值分别为60.196和0.824 mg/mL。
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图 10 苯乙醇苷提取物的羟基自由基清除能力Figure 10. The hydroxyl radical scavenging activity of PhGs extract2.5.2 DPPH自由基清除能力
由图11可知，随着苯乙醇苷提取物浓度的不断增加，其DPPH自由基的清除能力也随之增强。当苯乙醇苷提取物的浓度为5 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到73.69%；随后其清除能力趋于平缓，当浓度达到10 mg/mL时，清除率为73.83%。在相同浓度下，苯乙醇苷提取物DPPH自由基清除能力略小于VC，二者IC50值分别为0.875和0.035 mg/mL。本研究结果与宫晓庆[36]结果相似，研究表明肉苁蓉苯乙醇苷提取物对于DPPH自由基有较好的清除能力。
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图 11 苯乙醇苷提取物的DPPH自由基清除能力Figure 11. The DPPH free radical scavenging activity of PhGs extract3. 结论
本文采用响应面法优化了新疆管花肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的超声辅助提取工艺为：温度40 ℃，料液比1:41.7 g/mL，乙醇浓度51%。该条件下苯乙醇苷的得率为（14.36±0.12） mg/g。肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物主要包含松果菊苷和毛蕊花糖苷，其含量分别为（12.96±0.33） mg/g和（1.19 ± 0.09） mg/g。肉苁蓉苯乙醇苷提取物对羟基自由基和DPPH自由基具有较强的清除能力，其IC50值分别为60.196 mg/mL和0.875 mg/mL。本文利用超声辅助提取可以从管花肉苁蓉中有效提取苯乙醇苷类成分，且研究证明管花肉苁蓉苯乙醇苷提取物具有较好的体外抗氧化活性，为新疆肉苁蓉苯乙醇苷类化合物的高效提取和应用提供了理论依据。
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图 6 乙醇浓度和料液比对苯乙醇苷得率的影响
Figure 6. Effect of ethanol concentration and solid-liquid ratio on extraction yield of PhGs
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图 7 乙醇浓度和温度对苯乙醇苷得率的影响
Figure 7. Effect of ethanol concentration and temperature on extraction yield of PhGs
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图 8 料液比和温度对苯乙醇苷得率的影响
Figure 8. Effect of solid-liquid ratio and temperature on extraction yield of PhGs
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图 9 标准品及管花肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的HPLC色谱图
注：A：标准品，B：管花肉苁蓉。
Figure 9. HPLC chromatogram of phenylethanoside compounds in standards and Cistanche tubulosa
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图 10 苯乙醇苷提取物的羟基自由基清除能力
Figure 10. The hydroxyl radical scavenging activity of PhGs extract
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图 11 苯乙醇苷提取物的DPPH自由基清除能力
Figure 11. The DPPH free radical scavenging activity of PhGs extract
表 1 响应面试验的因素与水平设计
Table 1 Factors and levels design of response surface test
因素 水平 −1 0 1 A 超声温度（℃） 35 40 45 B 料液比（g/mL） 1:30 1:40 1:50 C 乙醇浓度（%） 40 50 60 
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表 2 响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface design and results
序号 A 超声温度 B：料液比 C 乙醇浓度 Y 得率（mg/g DW） 1 1 0 1 12.79 2 −1 −1 0 13.02 3 0 1 −1 12.57 4 −1 0 −1 12.09 5 1 −1 0 13.11 6 0 −1 1 12.90 7 1 0 −1 12.75 8 −1 0 1 13.03 9 1 1 0 13.73 10 0 1 1 13.36 11 0 0 0 14.47 12 0 0 0 14.34 13 0 0 0 14.39 14 0 0 0 14.58 15 0 −1 −1 12.95 16 −1 1 0 13.15 17 0 0 0 14.48
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表 3 响应面模型方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface model
项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 9.65 9 1.07 71.50 <0.0001 ** A 0.1485 1 0.1485 9.90 0.0162 * B 0.0861 1 0.0861 5.74 0.0477 * C 0.3698 1 0.3698 24.65 0.0016 ** AB 0.0600 1 0.0600 4.00 0.0856 AC 0.2025 1 0.2025 13.50 0.0079 ** BC 0.1764 1 0.1764 11.76 0.0110 * A2 2.30 1 2.30 153.60 <0.0001 ** B2 0.8900 1 0.8900 59.33 0.0001 ** C2 4.62 1 4.62 307.84 <0.0001 ** 残差 0.1050 7 0.0155 失拟项 0.0711 3 0.0245 2.80 0.1727 不显著 纯差 0.0339 4 0.0088 总和 9.76 16 注：*表示显著（P<0.05）；**表示极显著（P<0.01）；R2=0.9892，R2adj=0.9754。
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表 4 HPLC法测定松果菊苷、毛蕊花糖苷方法学参数
Table 4 Methodological parameters of echinoside and acteoside determined by HPLC
化合物 出峰时间（min） 标准曲线 R2 线性范围（mg/mL） 松果菊苷 15.027 y=15311296.40x−119140.61 0.999 0.04~0.48 毛蕊花糖苷 36.971 y=21780400.45x−121356.95 0.9996 0.04~0.08
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