Effects of Different Protease-Producing Lactic Acid Bacteria on the Degradation of Dried Beef Protein
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摘要: 为探究产蛋白酶乳酸菌在风干牛肉发酵过程中对肌原纤维蛋白的影响。以牛肉为研究对象，分别接种乳酸乳球菌（S-1）、格氏乳球菌（S-2）、戊糖片球菌（S-3）制备风干牛肉，以不添加发酵剂的样品为对照组（CK），采用理化分析和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）技术检测风干牛肉发酵过程中肌原纤维蛋白降解情况。结果表明，在发酵和贮藏阶段，非蛋白氮、氨基酸态氮、TCA-可溶性肽含量随着发酵时间延长而逐渐升高，且接种组显著高于对照组（P<0.05），其中S-1组和S-2组样品中非蛋白氮、氨基酸态氮、TCA-可溶性肽含量均显著高于S-3组（P<0.05）。各组样品中氨基酸态氮含量均有增加，其中S-1组氨基酸态氮增加最多，达到577.68 mg/100 g，但实验组间无显著差异（P>0.05）。S-1组和S-2组样品中总游离氨基酸的含量显著增加（P<0.05），SDS-PAGE结果显示接种组中蛋白质降解程度明显高于对照组。在风干牛肉的制作过程中，接种产蛋白酶乳酸菌可以明显提高蛋白质的降解程度，三株乳酸菌中S-1组对蛋白质的降解作用最明显。Abstract: In order to improve the quality of dried beef products, the impact of protease-producing lactic acid bacteria on the degradation of beef protein was clarified. Three lactic acid bacteria (LAB) strains with high protease-producing ability were inoculated in the dried beef, namely Lactococcus lactis (S-1), Lactococcus gracilis (S-2) and Pediococcus pentosaceus (S-3). The samples without adding starter were used as control group (CK). Instrumental analysis and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) were used to detect the protein degradation of dried beef. The results showed that the contents of non-protein nitrogen, amino acid nitrogen and TCA-soluble peptide increased gradually with the extension of fermentation time, and the inoculation group was significantly higher than the CK group (P<0.05). The contents of non-protein nitrogen, amino acid nitrogen and TCA-soluble peptide of protease-production LAB S-1 and S-2 were significantly higher than those of S-3 group (P<0.05). The content of amino acid nitrogen in each group increased, and the amino acid nitrogen in S-1 group increased the most, reaching 577.68 mg/100 g, but there was no significant difference between the inoculation groups (P > 0.05). The total free amino acids in the samples of S-1 and S-2 groups were significantly increased (P < 0.05). SDS-PAGE results showed that the protein degradation degree of the inoculation group was significantly higher than that of the CK group. In the process of dried beef production, inoculation of protease-producing lactic acid bacteria could significantly improve the degree of protein degradation, and S-1 group had the most obvious effect on protein degradation.
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风干牛肉是新疆哈萨克族的传统美食，其风干过程一般在10 ℃以下，风干时间为2~8个月不等。长时间的发酵使得肉中蛋白质和脂肪在微生物和酶的作用下发生水解，从而产生特殊风味。其中，蛋白质水解对肉制品的营养价值和风味品质影响显著，催化蛋白质的水解主要是蛋白水解酶，而蛋白水解酶主要分内源酶和外源酶。内源酶主要有钙蛋白酶和组织蛋白酶[1-2]，外源酶则来自于微生物的代谢产物[3]。在肉制品加工过程中，外源酶通常可以作为肉的嫩化剂[4-5]、发酵促进剂[6]和感官增强剂[7-8]。新疆特色风干肉通常在低温条件下发酵，过低的温度会限制内源蛋白酶的活性，因此外源添加的发酵剂产生的酶会对蛋白降解起主导作用。
乳酸菌、葡萄球菌、微球菌被认为是导致发酵肉蛋白降解 的主要微生物[9]。由于乳酸菌不能直接利用外源蛋白质为菌体提供营养，因此它们必须利用自身的蛋白水解系统降解外源蛋白质，通过降解外源蛋白质或肽满足菌体对氨基酸的需求，保证菌体的正常生长代谢[10-11]。Nie 等[12]将干鱼中分离出的植物乳杆菌ZY-40和戊糖片球菌GY-23 应用于发酵草鱼香肠的制作，发现两株乳酸菌处理的香肠，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白发生显著降解，同时发现鱼肉香肠中的α-氨基氮、TCA-可溶性肽及游离氨基酸的含量明显增加。张波[13]在强化接种调控内源酶对风干羊肉的研究中发现，乳酸菌产生的外源酶不仅可以降解蛋白质，而且对内源酶的活性有协同作用。在肉制品的发酵过程中，微生物对蛋白的适度降解可以显著提升产品品质[14]。因此，有必要进一步明确产蛋白酶乳酸菌在风干牛肉发酵过程中对蛋白质的影响。
本研究通过将前期分离得到的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）（S-1）、格氏乳球菌（Lactococcus gracilis）（S-2）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）（S-3）[15]用于风干牛肉的制作，检测牛肉发酵过程中非蛋白氮、TCA可溶性肽、氨基酸态氮、游离氨基酸等指标变化；同时，结合SDS-PAGE技术对肌原纤维蛋白降解情况进行分析，旨在研究发酵过程中风干牛肉蛋白质的降解规律，为其品质的形成提供理论基础，也为后期改善传统风干牛肉产品风味提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
牛肉 新疆褐牛，20月龄，屠宰后排酸48 h，右后腿肉，新疆福润德食品有限公司；氨基酸标准品 美国Sigma公司；三氯乙酸（TCA）、苯酚、柠檬酸钠、盐酸等化学试剂 分析纯，天津永晟精细化工有限公司；乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）（S-1）、格氏乳球菌（Lactococcus gracilis）（S-2）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）（S-3） 实验室从新疆传统风干肉中筛选得到[15]。
SPX-250C 恒温恒湿箱 上海昕仪仪器仪表有限公司；101型电热鼓风干燥箱 北京市永光明医疗仪器有限公司；DZ-40C2SA多功能真空包装机 南通成盛机械有限公司；HENC实验室搅拌机 上海恒川机械设备有限公司；UV-1800紫外分光光度计 北京世纪科信科学仪器有限公司；TGL16A高速冷冻离心机 湖南凯达科学仪器有限公司；K-375全自动凯氏定氮仪 瑞士BUCHI；L-8900氨基酸自动分析仪 日立（中国）有限公司；JS-1030荧光化学发光凝胶成像系统 上海培清科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 风干牛肉样品制备
风干牛肉制作：原料处理：选择新鲜的牛肉后腿，去除筋腱，用无菌水淋洗，切割修整为200 g左右的长条状（20 cm×5 cm×1 cm）；腌制：将2.5%（质量分数）的盐以及亚硝酸钠100 mg/kg均匀涂抹在肉表面，4 ℃条件下腌制2 h；接种发酵：将样品分成4组，每组35个样品，共计140个样品。一组不接种（对照组），分别将终浓度为1.0×107 CFU/g的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）（S-1）、格氏乳球菌（Lactococcus gracilis）（S-2）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）（S-3）接种在另外三组牛肉样品中发酵（温度15 ℃、湿度70%、时间24 h）；快速风干期：温度45 ℃，湿度30%，风速18~20 m/s，时间48 h；贮藏期：温度4 ℃，贮藏14 d。
取样：分别在前处理结束、腌制结束、风干0、24、48 h以及贮藏第7、14 d取样。每个采样点随机取五份样品，将样品迅速保存于−80 ℃冰箱内备用。
1.2.2 肌原纤维蛋白提取
参考Fadda等[16]的方法并略作修改。将5 g 肉样剪碎置于50 mL 离心管中，加15 mL 标准盐溶液（7.45 g/L KCl、2.72 g/L KH2PO4、0.406 g/L MgCl2·6H2O、0.76 g/L EGTA、0.065 g/L NaN3）匀浆25 s，2000 ×g 离心15 min，弃上清，重复4次；然后向沉淀中加15 mL 标准盐溶液+1% Triton X-100溶液，匀浆10 s，4000 ×g 离心10 min，弃上清取沉淀，并重复3次；此后沉淀中加入10 mL，0.745 g/L KCl 溶液，用玻璃棒剧烈搅拌，4000 ×g 离心10 min，重复3次；最后向沉淀中加入8 倍体积的5.85 g/L NaCl溶液，剧烈震荡，使沉淀悬浮于溶液中，4000 ×g离心5 min，取沉淀，重复两次；沉淀即为肌原纤维蛋白。
1.2.3 非蛋白氮含量的测定
称取5 g搅碎肉样，置于烧杯中并向其中加入25 mL蒸馏水与之充分混匀，通过磁力搅拌装置于4 ℃条件下搅拌提取10 min 后，采用冷冻离心机于4 ℃低温条件下以6000 ×g的速度离心10 min，离心后收集上清液。向离心后的沉淀中加入25 mL蒸馏水，重复以上操作，合并上清液，并使用滤纸过滤。吸取滤液l0 mL，与10 mL 20% TCA混合，室温下静置30 min，然后采用冷冻离心机于4 ℃低温条件下以6000 ×g的速度再次离心，取离心后的上清液，之后采用凯氏定氮法测定非蛋白氮的含量。
1.2.4 氨基酸态氮含量测定
准确称取5 g绞碎肉样，加入25 mL蒸馏水匀浆2 min，定容至100 mL，于4 ℃，10000 ×g离心 20 min，上清液过滤后加入质量分数 50% TCA使上清 TCA 终浓度为 5%，过滤除去蛋白质沉淀，将滤液用茚三酮进行比色测定，并使用异亮氨酸标准液绘制标准曲线。
1.2.5 TCA可溶性肽含量的测定
参照Visessanguan等[17]的方法。称取3 g 绞碎肉样，加入27 mL预冷的质量分数为 10% 的TCA溶液，高速均质（10000 ×g，2 min）后于4 ℃静置 1 h，然后使用高速冷冻离心机离心（12100 ×g，15 min），离心结束后取上清液用双缩脲法进行比色测定，并以牛血清蛋白作标准曲线，结果用 μmol Try/g 表示。
1.2.6 游离氨基酸的测定
游离氨基酸的测定参照张苏平等[18]的方法，略作修改。称取1.5 g绞碎肉样置于50 mL冷冻离心管，加入15 mL 0.02 mol/L稀盐酸后充分均质，超声萃取5 min，随后冷冻离心（5000 ×g，4 ℃，10 min），收集上清液，剩余残渣按相同条件重复操作一次，合并上清液，定容至 50 mL。吸取2 mL定容后的上清液，加入 2 mL 质量分数为8%的磺基水杨酸溶液，离心（10000 ×g，4 ℃，10 min），上清液经0.22 μm的水相过滤膜过滤后，直接在自动氨基酸分析仪上进行分析。
1.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳
SDS-PAGE参考于海等[19]的方法，利用双缩脲法测定肌原纤维蛋白的浓度，将蛋白浓度调为3 g/L。取0.5 mL 蛋白质溶液加入0.5 mL含1 % β-巯基乙醇的样品缓冲溶液，100 ℃沸水浴加热5 min，肌原纤维蛋白分离胶浓度为15%（质量分数），浓缩胶浓度为４%（质量分数）。电泳的初始电压为90 V，30 min后，将电压调节到120 V，时间为60 min。电泳结束后，考马斯亮蓝染液进行染色60 min、脱色液脱色3 h，之后凝胶成像仪上拍照并保存。
1.3 数据处理
数据使用Excel 2010进行统计，建立数据库，采用Origin Pro 2020软件进行数据绘图，用IBM SPSS Statistics 21做显著性分析。数据结果采用均值±标准偏差，数据差异性采用单因素方差分析中的最小显著差异法，P<0.05表示差异具有显著统计学意义。实验均重复5次。
2. 结果与分析
2.1 不同产蛋白酶乳酸菌对风干牛肉非蛋白氮含量的影响
非蛋白氮（NPN）含量能够反映肉中蛋白质的降解程度[20]，包括氨基酸、蛋白质降解产生的多肽、小肽、氨及铵盐等含氮化合物。由图1可知，四组牛肉风干期间，NPN含量均呈现出快速升高的趋势，说明在风干期间，蛋白质加速水解产生肽和氨基酸等物质，导致非蛋白氮含量升高。在前处理结束以及风干0 d时，各组风干牛肉的非蛋白氮含量没有显著性差异（P>0.05）。风干1 d后，S-1、S-2组显著高于CK组（P<0.05），S-1、S-2、S-3、CK组的NPN含量分别为12.12、11.84、11.36、10.72 mg/g蛋白质；风干2 d后S-1组非蛋白氮含量仍显著高于CK组（P<0.05）。在贮藏期间，S-1组、S-2组、S-3组显著高于CK组（P<0.05），且S-1组显著高于S-2组和S-3组（P<0.05），这可能是因为三株乳酸菌产生的蛋白酶的活力不同，从而导致了蛋白质降解程度有所差异。贮藏结束后，S-1组NPN含量最高，为15.08 mg/g。结果表明，接种产蛋白酶乳酸菌可以有效提高蛋白质的降解，提高风干牛肉中非蛋白氮含量，这与之前的研究结果相类似[14,21]。
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2.2 不同产蛋白酶乳酸菌对风干牛肉氨基酸态氮的影响
氨基酸态氮含量（AAN）也叫氨基酸态氮主要包括水溶性蛋白、多肽以及氨基酸等物质，其在肉制品中的含量可以反映蛋白质的水解程度，也是发酵产品发酵程度的特性指标，对产品的风味品质有一定的影响[22]。由图2可知，风干牛肉在制作过程中氨基酸态氮含量增加明显，其中CK组AAN含量由最初的211.25 mg/100 g增加到502.43 mg/100 g，S-1组、S-2组、S-3组则分别增加到578.66、573.49和552.87 mg/100 g。经过产蛋白酶乳酸菌发酵后的牛肉，尤其是风干前期含量增长速率最快（图2），可能是由于发酵初期，产蛋白酶乳酸菌呈对数期增长，乳酸菌的大量繁殖产生了大量蛋白酶，从而导致蛋白质迅速降解[23]。另外，张洵[24]研究也发现添加了混合发酵剂的鱼糜中AAN含量均随发酵时间的延长而明显升高，且其含量和有益微生物群落多少呈正相关，这与本实验的结果类似。
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图 2 不同加工阶段及贮藏过程中产蛋白酶乳酸菌对风干牛肉氨基酸态氮含量的影响Figure 2. Effects of protease-producing lactic acid bacteria on iminopeptide nitrogen content of dried beef in different processing stages and storage2.3 不同产蛋白酶乳酸菌对风干牛肉TCA-可溶性肽的影响
风干牛肉发酵过程中TCA-可溶性肽含量的变化如图3所示。由图可知，贮藏第14 d时，S-1组和S-2组样品中TCA-可溶性肽含量显著高于S-3组和CK组（P<0.05）。前处理结束时三个试验组样品中TCA-可溶性肽含量分别为6.52、6.56和6.54 μmol Try/g，随着发酵时间的延长，其结果也不断增加，到贮藏第14 d时，发酵牛肉中TCA-可溶性肽含量分别达到12.06、12.11和10.48 μmol Try/g，这表明牛肉在发酵过程中一直伴随着蛋白水解。这是因为乳酸菌发酵产生了大量的蛋白酶，使得牛肉中蛋白质发生水解，从而导致TCA-可溶性肽含量上升。其中，TCA-溶解肽和氨基酸态氮是小分子含氮化合物，都属于非蛋白氮（NPN），随着发酵时间的延长，其含量的增加也会导致牛肉样品中NPN的增加，因此TCA-溶解肽和氨基酸态氮变化趋势和NPN的变化趋势一致。戴梦婕等[25]对发酵鲢鱼鱼糜研究也发现，随着发酵时间延长，鱼糜中TCA-可溶性肽含量持续增加，且其变化趋势与发酵鲢鱼鱼糜中NPN的变化趋势一致，这与本文的研究结果相似。
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图 3 不同加工阶段及贮藏过程中产蛋白酶乳酸菌对风干牛肉TCA-可溶性肽的影响Figure 3. Effects of protease-producing lactic acid bacteria on dried beef TCA-soluble peptide in different processing stages and storage2.4 不同产蛋白酶乳酸菌对风干牛肉游离氨基酸含量的影响
游离氨基酸在整个成熟过程中的逐渐释放是风干肉制品的典型特征，这些化合物对最终产品的风味和口感至关重要[26-28]。表1为贮藏14 d时风干牛肉中游离氨基酸含量。如表1所示，在贮藏结束14 d时，不同乳酸菌处理的样品之间游离氨基酸含量有所差异。S-1组和S-2组样品中呈鲜味、呈甜味和呈苦味的氨基酸都有显著增加（P<0.05）。其中，S-1组和S-2组样品中呈鲜味的天冬氨酸和谷氨酸含量显著高于CK组（P<0.05），而S-3组样品中天冬氨酸含量则显著高于其他三组（P<0.05），但谷氨酸含量却显著低于其他三组（P<0.05）。在S-1组和S-2组样品中呈甜味的丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸含量也显著高于CK组（P<0.05），S-3组中甘氨酸含量最高（P<0.05）。样品总游离氨基酸含量中S-1组（577.68 mg/100 g）、S-2组（576.23 mg/100 g）和S-3组（545.43 mg/100 g）显著高于CK组（525.54 mg/100 g）（P<0.05）。相对于CK组，S-1组和S-2组中的必需氨基酸也有明显增加（P<0.05），S-3组则明显降低（P<0.05）。这可能是由于其产蛋白酶菌株的不同导致其酶学特性有所差异，从而导致了不同乳酸菌对蛋白质降解后的产物有所不同。相对于戊糖片球菌，乳酸乳球菌和格氏乳球菌会使得产品产生更多的鲜味、甜味、苦味氨基酸和必需氨基酸。有研究表明，肉制品的发酵过程中蛋白质的降解是一个非常复杂的过程，在微生物释放的外源蛋白酶和肉自身的内源酶共同作用，将大分子的蛋白质分解成肽和氨基酸，从而导致了肉制品中氨基酸也发生相应变化[29-32]。
表 1 风干牛肉游离氨基酸含量（mg/100 g）Table 1. Free amino acid content of dried beef (mg/100 g)氨基酸名称 不同组别风干牛肉游离氨基酸含量 CK S-1 S-2 S-3 天冬氨酸（Asp） 60.56 ± 0.65c 64.38 ± 0.62b 63.68 ± 0.73b 67.84 ± 0.67a 谷氨酸（Glu） 101.70 ± 0.79b 106.64 ± 1.04a 106.49 ± 1.16a 96.84 ± 1.01c 丝氨酸（Ser） 13.96 ± 0.83b 15.39 ± 0.53a 15.45 ± 0.44a 12.88 ± 0.77b 甘氨酸（Gly） 15.25 ± 0.61c 16.09 ± 0.52c 18.65 ± 0.56b 23.93 ± 0.78a 丙氨酸（Ala） 120.40 ± 0.85b 121.84±0.67ab 122.43 ± 1.19a 117.74 ± 0.57c 精氨酸（Arg） 21.68 ± 0.58b 24.24 ± 0.61a 23.83 ± 0.82a 19.47 ± 0.55c 脯氨酸（Pro） 13.74 ± 0.59b 15.33 ± 0.52a 15.11 ± 0.48a 13.22 ± 0.61b 酪氨酸（Tyr）* 11.34 ± 0.53b 12.78 ± 0.68a 12.34 ± 0.47ab 10.25 ± 0.61c 半胱氨酸（Cys） 5.92 ± 0.06a 6.18 ± 0.25ab 5.99 ± 0.08b 5.80 ± 0.06a 苏氨酸（Thr）* 15.45 ± 0.51b 17.34 ± 0.58a 16.73 ± 0.60a 14.33 ± 0.53c 缬氨酸（Val）* 15.49 ± 0.45b 17.27 ± 0.43a 17.12 ± 0.48a 13.78 ± 0.85c 亮氨酸（Leu）* 47.81 ± 0.65b 51.28 ± 0.56a 50.44 ± 0.67a 45.67 ± 1.04c 异亮氨酸（Ile）* 15.11 ± 0.53b 16.43 ± 0.50a 16.37 ± 0.50a 13.76 ± 0.54c 苯丙氨酸（Phe）* 15.35 ± 0.56b 16.76 ± 0.65a 16.50 ± 0.56a 13.86 ± 0.58c 蛋氨酸（Met）* 8.72 ± 0.55bc 9.67 ± 0.56a 9.54 ± 0.43ab 8.00 ± 0.34c 组氨酸（His） 12.48 ± 0.42ab 12.61 ± 0.51a 13.31 ± 0.50a 10.83 ± 0.67b 赖氨酸（Lys）* 49.58 ± 0.46c 53.27 ± 0.57a 52.25 ± 0.45b 47.23 ± 0.60d 总游离氨基酸（TFAA） 525.54±1.17c 577.68±1.24a 576.23±0.98a 545.43±1.13b 必需氨基酸（EAA） 191.33±1.34b 207.41±1.09a 204.6±1.45a 177.71±1.39c 鲜味氨基酸（DAA） 162.26±1.89b 171.02±1.21a 170.17±1.83a 164.68±2.21b 甜味氨基酸（SAA） 185.03±2.11b 192.89±0.89a 195.47±2.06a 187.24±1.33b 苦味氨基酸（BAA） 175.88±1.42b 190.07±0.87a 187.87±1.58a 163.38±1.36c 注：*：必需氨基酸；鲜味氨基酸（DAA）：Glu、Asp；甜味氨基酸（SAA）：Gly、Ala、Ser、Thr、Pro；苦味氨基酸（BAA）：Lys、Met、Val、Ile、Leu、Tyr、His、Phe；数据表示为平均值±标准偏差（n = 3）；不同组别之间的均值以不同的小写字母（a~d）表示差异显著（P< 0.05）。 2.5 肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳
图4为牛肉肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳图，蛋白条带的亮度跟蛋白质的多少呈正相关，CK组、S-1组、S-2组和S-3组为样品贮藏第14 d的样品。从图4可以看出，四组风干牛肉在贮藏第14 d时肌球蛋白重链（Band1，220 kDa）、肌动蛋白（Band2，45 kDa）、原肌球蛋白（Band3，40 kDa）、肌钙蛋白（Band4，37 kDa）和肌球蛋白轻链（Band5，25 kDa）条带染色亮度均有不同程度变化。相对于第0 d，牛肉样品中肌球蛋白重链降解程度最大的是S-1组、其次是S-2组和S-3组，CK组条带强度降低幅度最小。S-1组样品中原肌球蛋白条带基本消失，且S-2组和S-3组蛋白条带亮度也有明显的减弱。但各组中肌球蛋白轻链条带亮度变化均不明显。从以上结果可以看出，接种乳酸乳球菌、格氏乳球菌和戊糖片球菌可以促进大分子蛋白降解。另外，5个主要蛋白条带的变化结果表明，实验组风干牛肉蛋白降解程度明显高于CK组，其中S-1组蛋白质降解速度及降解程度最高。发酵剂对牛肉风干期间肌原纤维蛋白降解具有促进作用，这与微生物产蛋白酶作用紧密相关。
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图 4 风干牛肉的肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳图注：Band1：肌球蛋白重链（220 kDa）；Band2：肌动蛋白（45 kDa）；Band3：原肌球蛋白（40 kDa）；Band4：肌钙蛋白（37 kDa）；Band5：肌球蛋白轻链（25 kDa）。Figure 4. SDS-PAGE electrophoresis of myofibrillar protein of dried beef3. 结论
研究发现，在风干牛肉制作过程中分别接种产蛋白酶的乳酸乳球菌、格氏乳球菌和戊糖片球菌可以促进牛肉中蛋白质的降解，提高牛肉产品中非蛋白氮和TCA可溶性肽含量；S-1组蛋白质的降解程度比S-2组和S-3组更加明显。风干牛肉贮藏第14 d后，S-1组和S-2组样品中鲜味氨基酸和甜味氨基酸含量明显增加，总游离氨基酸的含量也有明显增加。在贮藏结束时，样品中总游离氨基酸含量分别为S-1组 577.68 mg/100 g、S-2组576.23 mg/100 g、S-3组545.43 mg/100 g、CK组525.54 mg/100 g。SDS-PAGE结果表明，三株产蛋白酶乳酸菌对风干牛肉蛋白分子量在37 kDa以上的肌球蛋白重链、肌动蛋白、原肌球蛋白及肌钙蛋白的降解作用明显，对蛋白分子量在37 kDa以下的肌球蛋白蛋白轻链降解作用不明显。
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图 2 不同加工阶段及贮藏过程中产蛋白酶乳酸菌对风干牛肉氨基酸态氮含量的影响
Figure 2. Effects of protease-producing lactic acid bacteria on iminopeptide nitrogen content of dried beef in different processing stages and storage
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图 3 不同加工阶段及贮藏过程中产蛋白酶乳酸菌对风干牛肉TCA-可溶性肽的影响
Figure 3. Effects of protease-producing lactic acid bacteria on dried beef TCA-soluble peptide in different processing stages and storage
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图 4 风干牛肉的肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳图
注：Band1：肌球蛋白重链（220 kDa）；Band2：肌动蛋白（45 kDa）；Band3：原肌球蛋白（40 kDa）；Band4：肌钙蛋白（37 kDa）；Band5：肌球蛋白轻链（25 kDa）。
Figure 4. SDS-PAGE electrophoresis of myofibrillar protein of dried beef
表 1 风干牛肉游离氨基酸含量（mg/100 g）
Table 1 Free amino acid content of dried beef (mg/100 g)
氨基酸名称 不同组别风干牛肉游离氨基酸含量 CK S-1 S-2 S-3 天冬氨酸（Asp） 60.56 ± 0.65c 64.38 ± 0.62b 63.68 ± 0.73b 67.84 ± 0.67a 谷氨酸（Glu） 101.70 ± 0.79b 106.64 ± 1.04a 106.49 ± 1.16a 96.84 ± 1.01c 丝氨酸（Ser） 13.96 ± 0.83b 15.39 ± 0.53a 15.45 ± 0.44a 12.88 ± 0.77b 甘氨酸（Gly） 15.25 ± 0.61c 16.09 ± 0.52c 18.65 ± 0.56b 23.93 ± 0.78a 丙氨酸（Ala） 120.40 ± 0.85b 121.84±0.67ab 122.43 ± 1.19a 117.74 ± 0.57c 精氨酸（Arg） 21.68 ± 0.58b 24.24 ± 0.61a 23.83 ± 0.82a 19.47 ± 0.55c 脯氨酸（Pro） 13.74 ± 0.59b 15.33 ± 0.52a 15.11 ± 0.48a 13.22 ± 0.61b 酪氨酸（Tyr）* 11.34 ± 0.53b 12.78 ± 0.68a 12.34 ± 0.47ab 10.25 ± 0.61c 半胱氨酸（Cys） 5.92 ± 0.06a 6.18 ± 0.25ab 5.99 ± 0.08b 5.80 ± 0.06a 苏氨酸（Thr）* 15.45 ± 0.51b 17.34 ± 0.58a 16.73 ± 0.60a 14.33 ± 0.53c 缬氨酸（Val）* 15.49 ± 0.45b 17.27 ± 0.43a 17.12 ± 0.48a 13.78 ± 0.85c 亮氨酸（Leu）* 47.81 ± 0.65b 51.28 ± 0.56a 50.44 ± 0.67a 45.67 ± 1.04c 异亮氨酸（Ile）* 15.11 ± 0.53b 16.43 ± 0.50a 16.37 ± 0.50a 13.76 ± 0.54c 苯丙氨酸（Phe）* 15.35 ± 0.56b 16.76 ± 0.65a 16.50 ± 0.56a 13.86 ± 0.58c 蛋氨酸（Met）* 8.72 ± 0.55bc 9.67 ± 0.56a 9.54 ± 0.43ab 8.00 ± 0.34c 组氨酸（His） 12.48 ± 0.42ab 12.61 ± 0.51a 13.31 ± 0.50a 10.83 ± 0.67b 赖氨酸（Lys）* 49.58 ± 0.46c 53.27 ± 0.57a 52.25 ± 0.45b 47.23 ± 0.60d 总游离氨基酸（TFAA） 525.54±1.17c 577.68±1.24a 576.23±0.98a 545.43±1.13b 必需氨基酸（EAA） 191.33±1.34b 207.41±1.09a 204.6±1.45a 177.71±1.39c 鲜味氨基酸（DAA） 162.26±1.89b 171.02±1.21a 170.17±1.83a 164.68±2.21b 甜味氨基酸（SAA） 185.03±2.11b 192.89±0.89a 195.47±2.06a 187.24±1.33b 苦味氨基酸（BAA） 175.88±1.42b 190.07±0.87a 187.87±1.58a 163.38±1.36c 注：*：必需氨基酸；鲜味氨基酸（DAA）：Glu、Asp；甜味氨基酸（SAA）：Gly、Ala、Ser、Thr、Pro；苦味氨基酸（BAA）：Lys、Met、Val、Ile、Leu、Tyr、His、Phe；数据表示为平均值±标准偏差（n = 3）；不同组别之间的均值以不同的小写字母（a~d）表示差异显著（P< 0.05）。 
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[1] CHANG Y S, WU S Y, STROMER M H, et al. Calpain activation and proteolysis in postmortem goose muscles[J]. Animal Science Journal,2020,91(1):1−9.
[2] 陈武东, 杜险峰. 肉类嫩度的影响因素及盐类嫩化牛肉技术研究进展[J]. 中国调味品,2021,46(6):192−195. [CHEN W D, DU X F. Influencing factors of meat tenderness and research progress of salt tenderizing beef technology[J]. China Condiment,2021,46(6):192−195. doi: 10.3969/j.issn.1000-9973.2021.06.039 [3] 韩爽, 张健, 井月欣, 等. 微生物源蛋白酶研究进展[J]. 食品工业科技,2020,41(13):321−327. [HAN S, ZHANG J, JING Y X, et al. Progress in research about the protease extracted from microorganisms[J]. Science and Technology of Food Industry,2020,41(13):321−327. [4] BUREROS K J C, DIZON E I, ISRAEL K A C, et al. Physicochemical and sensory properties of carabeef treated with Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn protease as meat tenderizer[J]. Journal of Food Science and Technology,2020,57(4):310−318.
[5] KARTIKA A I, KUSUMA H S, DARMAWATI S, et al. Microstructural and proteomic analysis to investigate the effectiveness of papaya leaf as a tenderizer of beef and goat’s meat[J]. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science,2019,292:012010.
[6] HE H L, CHEN X L, LI J W, et al. Taste improvement of refrigerated meat treated with cold-adapted protease[J]. Food Chemistry,2004,84(2):307−311. doi: 10.1016/S0308-8146(03)00242-5
[7] 孔晓雪, 楼宵玮, 李新福, 等. 外源酶制剂在传统腊肉现代化工艺改造中的应用[J]. 食品与生物技术学报,2020,39(5):74−81. [SUN X X, LOU X W, LI X F, et al. Application of exogenous enzymes in the modern technological transformation of traditional bacon[J]. Journal of Food Science and Biotechnology,2020,39(5):74−81. doi: 10.3969/j.issn.1673-1689.2020.05.011 [8] ZAGOREC M, MARIE-CHRISTINE C V. Lactobacillus sakei: A starter for sausage fermentation, a protective culture for meat products[J]. Microorganisms,2017,5(3):3−13.
[9] TALON R, LEROY S, LEBERT I. Microbial ecosystems of traditional fermented meat products: The importance of indigenous starters[J]. Meat Science,2007,77(1):55−62. doi: 10.1016/j.meatsci.2007.04.023
[10] 杜越欧, 侯俊财. 乳酸菌蛋白水解体系及相关基因表达的研究进展[J]. 食品工业科技,2013,34(3):383−386,391. [DU Y O, HOU J C. Research progress in proteolysis system of lactic acid bacteria and related gene expression[J]. Science and Technology of Food Industry,2013,34(3):383−386,391. [11] BROADBENT J R, STEELE J L. Proteolytic enzymes of lactic acid bacteria and their influence on bitterness in bacterial-ripened cheeses[J]. ACS Symposium Series,2007,971:193−204.
[12] NIE X H, LIN S L, MENG X H. Identification of two selected lactic acid bacteria strains isolated from dry-cured fish and their behaviors in fermented fish sausage[J]. Journal of Fisheries Sciences Com,2016,10(1):47−52.
[13] 张波. 强化接种调控内源酶对风干羊肉蛋白质降解的研究[D]. 石河子: 石河子大学, 2013: 53−55. ZHANG B. The effect of strengthening inoculation starter on proteolytic by the regulation of endogenous enzymes of air-dried mutton[D]. Shihezi: Shihezi University, 2013: 53−55.
[14] SUN W Z, ZHAO H F, ZHAO Q Z, et al. Structural characteristics of peptides extracted from Cantonese sausage during drying and their antioxidant activities[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2009,10(4):558−563.
[15] 李丹阳, 李宇辉, 高云云, 等. 新疆哈萨克族风干肉中产蛋白酶乳酸菌的筛选及酶学特性研究[J]. 食品与发酵工业,2020,46(9):57−63. [LI D, LI Y H, GAO Y Y, et al. Screening of protease-producing lactic acid bacteria from Xinjiang Kazakh air-dried meat and their enzymatic characteristics[J]. Food and Fermentation Industry,2020,46(9):57−63. [16] FADDA S, SANZ Y, VIGNOLO G, et al. Characterization of muscle sarcoplasmic and myofibrillar protein hydrolysis caused by Lactobacillus plantarum[J]. Applied and Environmental Microbiology,1999,65(8):3540−3546. doi: 10.1128/AEM.65.8.3540-3546.1999
[17] VISESSANGUAN W, BENJAKUL S, RIEBROY S, et al. Changes in composition and functional properties of proteins and their contributions to Nham characteristics[J]. Meat Science,2004,66(3):579−588. doi: 10.1016/S0309-1740(03)00172-4
[18] 张苏平, 邱伟强, 卢祺, 等. 全自动氨基酸分析仪法测定4种贝类肌肉中谷胱甘肽和游离氨基酸含量[J]. 食品科学,2017,38(4):170−176. [ZHANG S P, QIU W Q, LU Q, et al. Determination of glutathione and free amino acids in muscles of four shellfish species by automatic amino acid analyzer[J]. Food Science,2017,38(4):170−176. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201704027 [19] 于海, 曹宏, 李想, 等. 辐照对发酵香肠品质特性的影响[J]. 核农学报,2010,24(6):1214−1218. [YU H, CAO H, LI X, et al. Effect of irradiation on the quality of fermented sausage[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2010,24(6):1214−1218. doi: 10.11869/hnxb.2010.06.1214 [20] 戚巍威, 徐为民, 徐幸莲, 等. 传统风鸭加工过程中非蛋白氮和游离氨基酸的变化[J]. 江苏农业学报,2008,24(2):190−193. [QI W W, XU W M, XU X L, et al. Changes of non-protein nitrogen and free amino acids during traditional dry-cured duck processing[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences,2008,24(2):190−193. doi: 10.3969/j.issn.1000-4440.2008.02.016 [21] ANSORENA D, ZAPELENA M J, ASTIASARÁN I, et al. Simultaneous addition of palatase M and protease P to a dry fermented sausage (Chorizo de Pamplona) elaboration: Effect over peptidic and lipid fractions [J]. Meat Science,1998,50(1):37−44. doi: 10.1016/S0309-1740(98)00014-X
[22] 栾宏伟, 朱文慧, 祝伦伟, 等. 不同发酵时间对乌虾酱风味的影响[J]. 食品工业科技,2020,41(12):75−81,87. [LUAN H W, ZHU W H, ZHU L W, et al. Effect of different fermentation time on the flavor of shrimp paste[J]. Science and Technology of Food Industry,2020,41(12):75−81,87. [23] 穆建稳. 腊牛肉(牛干巴)加工过程中酶对蛋白质变化影响的研究[D]. 重庆: 西南大学, 2006: 36−38. MU J W. Study on effect of enzyme to protein changes in the processing of dry-cured beef[D]. Chongqing: Xinan University, 2006: 36−38.
[24] 张洵. 发酵鱼糜的风味改良研究[D]. 无锡: 江南大学, 2013: 48−49. ZHANG X. Study on the improvement of fermented surimi flavor[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2013: 48−49.
[25] 戴梦婕, 许艳顺, 姜启兴, 等. 戊糖片球菌产蛋白酶对发酵鲢鱼鱼糜凝胶性能的影响[J]. 食品与发酵工业,2014,40(6):17−21. [DAI M J, XU Y S, JIANG Q X, et al. Effect of Pediococcus pentosaceus protease on gel properties of fermented silver carp surimi[J]. Food and Fermentation Industry,2014,40(6):17−21. [26] BERIAIN M, CHASCO J, LIZASO G. Relationship between biochemical and sensory quality characteristics of different commercial brands of salchichon[J]. Food Control,2000,11(3):231−237. doi: 10.1016/S0956-7135(99)00104-8
[27] MONTEL M C, MASSON F, TALON R. Bacterial role in flavour development[J]. Meat Science,1998,49:S111−S123. doi: 10.1016/S0309-1740(98)90042-0
[28] BERIAIN M J, LIZASO G, CHASCO J. Free amino acids and proteolysis involved in ‘salchichon’ processing[J]. Food Control,2000,11(1):41−47. doi: 10.1016/S0956-7135(99)00062-6
[29] EVA H, LORENZO D I H, JUAN A O. Contribution of the microbial and meat endogenous enzymes to the free amino acid and amine contents of dry fermented sausages[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1999,3(47):1156−1161.
[30] ARO J M, NYAM-OSOR P, TSUJI K, et al. The effect of starter cultures on proteolytic changes and amino acid content in fermented sausages[J]. Food Chemistry,2010,119(1):279−285. doi: 10.1016/j.foodchem.2009.06.025
[31] BERARDO A, DEVREESE B, DE MAERE H, et al. Actin proteolysis during ripening of dry fermented sausages at different pH values[J]. Food Chemistry,2017,221:1322−1332. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.11.023
[32] FADDA S, SANZ Y, VIGNOLO G, et al. Hydrolysis of pork muscle sarcoplasmic proteins by Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sake[J]. Applied & Environmental Microbiology,1999,65(2):578−584.
-
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1. 霍善琴，赵新楠，林怡辰，王腾，谭志军，彭吉星. 食品中维生素B分析方法研究进展. 食品与药品. 2025(01): 112-119 . 
百度学术
2. 于瑞莉，任静，华佳淼，邹凤，黄丽俊. 国标法测定特医食品中叶酸的方法研究. 中国标准化. 2024(15): 251-256 . 百度学术
3. 陆伟，王俊，靳利军，熊菲菲，晏永球，贾福怀. 高效液相色谱法测定复合营养素补充剂中叶酸含量. 山东化工. 2023(04): 127-130 . 百度学术
4. 于瑞莉，冯永巍，黄丽俊，杨婷. 特殊食品中3种B族维生素检测方法的研究进展. 食品与药品. 2022(01): 91-96 . 百度学术
5. 王养平，焦建军. 运动营养饼干品质指标的主成分分析及聚类分析. 食品安全质量检测学报. 2022(05): 1405-1413 . 百度学术
6. 苏妙仪，严家俊，张娟. 微生物法检测乳粉中叶酸的优化研究. 中国乳业. 2021(02): 81-85 . 百度学术
7. 涂宏建，陆伟，贾福怀，谢承群，雷蕾，王鹏泽. 涡旋振荡提取-高效液相色谱-紫外检测法测定铁叶酸片中的叶酸含量. 食品安全质量检测学报. 2021(09): 3721-3726 . 百度学术
8. 吴思敏，严家俊，黄钟标. 微生物法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量不确定度评估. 中国乳业. 2021(07): 91-97 . 百度学术
9. 霍艳杰，雷浩，高勤叶，曹晓洁，张晓英，贺习文. 分光光度法测定饲料添加剂叶酸含量的方法研究. 粮油与饲料科技. 2021(05): 30-33 . 百度学术
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