Structural and Physicochemical Properties of Longan Kernel Starch by Enzyme-assisted Alkali Extraction
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摘要: 目的：明确酶辅助碱法提取的龙眼核淀粉的结构及理化性质。方法：以龙眼核为原料，碱性蛋白酶为酶解剂提取龙眼核淀粉，研究了其化学组成、粒径、微观形貌、晶体结构、透明度、溶解度及膨润力、热力学特性及糊化特性等。结果：100 g龙眼核淀粉中含有82.64 g淀粉、0.68 g粗脂肪、0.46 g粗蛋白和1.06 g灰分，其直链淀粉含量为36.37%；其颗粒多呈椭圆形或不规则多边形，平均粒径为11.21 μm，结晶结构为A型，近程有序程度较高；1%（w/v）龙眼核淀粉糊的透光率为4%；溶解度和膨润力均随温度上升而增大，90 ℃时分别为11.26%和15.93%；龙眼核淀粉具有较高的糊化起始温度（70.4 ℃）、峰值温度（75.9 ℃）、结束温度（82.1 ℃）和糊化焓（13.7 J/g），其热糊稳定性较差，冷糊稳定性较好。结论：酶辅助碱法提取的龙眼核淀粉直链淀粉含量高，蛋白质含量下降明显，颗粒小，不易糊化。Abstract: Objective: To clarify the structure and physicochemical properties of longan kernel starch extracted by enzyme-assisted alkali method. Methods: Using longan kernel as raw material and alkaline protease as enzymatic hydrolysis agent, the longan kernel starch was extracted. The chemical composition, particle size, morphology, crystal structure, transparency, solubility and swelling power, thermodynamic properties and gelatinizing properties of starch were studied. Results: 100 g longan kernel starch contained 82.64 g starch, 0.68 g crude fat, 0.46 g crude protein and 1.06 g ash, and its amylose content was 36.37%. Its particles were mostly elliptic or irregular polygon, and their average size was 11.21 μm. The starch had type A crystalline structure and higher short-range order degree. In addition, 1% (w/v) longan kernel starch paste had 4% transparency. Its solubility and swelling power increased with the increase of temperature, being 11.26% and 15.93% at 90 ℃, respectively. Longan kernel starch had high gelatinization initial temperature (70.4 ℃), peak temperature (75.9 ℃), conclusion temperature (82.1 ℃) and enthalpy change (13.7 J/g). Its hot paste stability was poor while its cold paste stability was better. Conclusion: Longan kernel starch by enzyme-assisted alkali extraction had high amylose content and its protein content decreased obviously. In addition, it had small granules, and it was not easily gelatinized.
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龙眼核约占龙眼果实鲜重的20%左右，含有淀粉、膳食纤维、蛋白质等营养成分以及多糖、多酚等活性成分，其中淀粉含量最高，约占龙眼核干重的60%，故龙眼核是一种良好的淀粉资源[1-2]。
目前，有关龙眼核的研究主要集中在其活性成分的提取及药理作用方面，关于龙眼核淀粉的研究较少且不够深入。彭小燕等[3]采用高速剪切辅助碱法提取龙眼核淀粉，确定了最佳提取工艺，但未对淀粉性质进行研究。Hu等[4]采用湿法提取储良、石硖和草铺3种龙眼核淀粉，并比较了其结构、糊化和消化特性。李秀娟等[5]采用传统碱法提取龙眼核淀粉，并以玉米淀粉和马铃薯淀粉为参照比较了其粒径及溶解度等特性，对其理化及结构特性的研究较为局限。
龙眼核中含6%左右的蛋白质，研究表明蛋白质易与淀粉结合形成致密结构，同时淀粉颗粒与蛋白质间存在的静电作用、疏水作用及氢键等也会影响淀粉的提取，酶辅助碱法提取的淀粉具有完整光滑的结构，碱性蛋白酶的加入能进一步降低淀粉中的蛋白质残留，提高淀粉得率及纯度[6]。此外，不同的淀粉提取方法也会影响淀粉的性质，基于此，本文采用蛋白酶辅助碱法提取龙眼核中的淀粉，以常见的谷类玉米淀粉和豆类豌豆淀粉为参比，分析其化学组成、结构及理化性质，以期获得更全面的龙眼核淀粉特性及对其高附加值利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
龙眼核粉 将新鲜龙眼核洗净后于45 ℃烘干后粉碎、过40目筛；玉米淀粉和豌豆淀粉 均为市售食用级产品；碱性蛋白酶（200 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；直链淀粉标准品 中国水稻研究所；溴化钾、无水乙醚、无水乙醇 成都市科隆化学品有限公司。
Multiskan GO型酶标仪 美国赛默飞公司；UV6000PC型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；IRTracer-100傅立叶变换红外光谱仪 日本岛津公司；LA-960型激光粒度仪 日本HORIBA；JSM-7500F型场发射扫描电子显微镜 日本电子株式会社；EMPYREAN型X射线衍射仪 荷兰帕纳科公司；DSC214型差示量热扫描仪 德国NETZESCH公司；RVA-Super3型快速黏度分析仪 澳大利亚NEWPORT公司。
1.2 实验方法
1.2.1 龙眼核淀粉的制备
参考傅新征[7]的方法并稍作改进，称取一定量的龙眼核粉，按料液比1:12加入pH9的氢氧化钠溶液，混匀后加入碱性蛋白酶（300 U/mL），40 ℃下振荡提取3 h，以200目滤布过滤后用蒸馏水冲洗残渣3次，合并滤液，混匀后于4000 r/min离心10 min，除去所得沉淀表层的棕色物质，再用蒸馏水洗涤沉淀多次后离心（4000 r/min离心10 min），收集沉淀，用适量无水乙醚浸泡脱脂3 h后用85%乙醇洗涤3次[8]，将所得淀粉于40 ℃烘干后过100目筛。
1.2.2 龙眼核淀粉的化学组成分析
水分含量测定参照GB 5009.3-2016中的直接干燥法；粗脂肪含量测定参照GB 5009.6-2016中的索氏抽提法；粗蛋白含量测定参照GB 5009.5-2016中的凯氏定氮法；灰分测定参照GB 5009.4-2016 食品中总灰分的测定方法；总淀粉含量测定参照GB5009.9-2016中的酶水解法；直链淀粉含量测定参照碘结合法，得到直链淀粉标准曲线拟合方程y=153.41x−12.119（R2=0.9996）。
1.2.3 龙眼核淀粉结构分析
1.2.3.1 粒径测定
采用激光粒度仪对龙眼核淀粉粒径分布进行测定。将适量淀粉悬浊液滴加于分散槽中，以超纯水为分散剂，超声分散1 min。
1.2.3.2 微观结构分析
采用扫描电子显微镜观察龙眼核淀粉的微观结构。将少量龙眼核淀粉固定在样品台上，对其截面喷金后观察。放大倍率为500倍和2000倍，加速加压为15 kV。
1.2.3.3 晶体结构分析
采用X射线衍射仪对龙眼核淀粉晶体结构进行测定。X射线源为Cu-Kα射线，管电压40 kV，管电流40 mA，扫描速率5 °/min，步长0.02°，扫描范围4~70°。
1.2.3.4 红外光谱分析
将3 mg龙眼核淀粉与450 mg KBr混合均匀后压片，采用傅立叶红外光谱仪在400~4000 cm−1范围对其进行扫描，分辨率2 cm−1，扫描次数12次。
1.2.4 龙眼核淀粉理化特性测定
在以下实验中选择豌豆淀粉和玉米淀粉作为对照样品。
1.2.4.1 透明度测定
参照孔露等[9]的方法并稍作修改。将1 g龙眼核淀粉放入100 mL蒸馏水中，沸水浴中搅拌糊化30 min，期间补水以保持原质量，冷却至室温后放置72 h，期间每隔12 h摇匀后于620 nm测定透光率，以蒸馏水为对照。
1.2.4.2 溶解度与膨润力测定
参照姚月华等[10]的方法并略作改进。将0.5 g（m）烘干至恒重的龙眼核淀粉放入40 mL蒸馏水中振荡1 min，分别于50、60、70、80 ℃和90 ℃水浴下保持30 min，冷却至室温后在4000 r/min下离心10 min，将所得上清液于105 ℃烘干至恒重，所得干燥物质量记为m1，将离心管中沉淀物的质量记为m2，按照以下公式计算龙眼核淀粉的溶解度和膨润力。
溶解度(%)=m1m×100 膨润力(%)=m2m(1−溶解度)×100 1.2.4.3 热力学特性测定
采用差示扫描量热仪（DSC）测定龙眼核淀粉的热力学性质。参照Mapengo等[11]的方法对测试条件稍作调整。称取约2.5 mg龙眼核淀粉于坩埚中，加入7.5 mg蒸馏水，压紧坩埚后室温下平衡24 h，以空白坩埚作对照。测定程序为升温速率10 ℃/min，氮气流速20 mL/min，升温范围20~170 ℃。
1.2.4.4 糊化特性测定
参考Liu等[12]的方法稍作修改。将3 g龙眼核淀粉放入装有25 mL超纯水的RVA专用铝盒中，混匀后置于RVA仪测定。测定程序为：前10 s搅拌速度为960 r/min，后降至160 r/min保持。起始温度为50 ℃，维持1 min后以12 ℃/min的速度升温至95 ℃，保持3 min，再以12 ℃/min的速度降温至50 ℃，保持2 min。
1.3 数据处理
所有实验均重复三次，数据按平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0软件对结果进行统计分析，采用OriginPro8.5软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 龙眼核淀粉的化学组成
龙眼核淀粉的化学组成见表1。可以看出，龙眼核淀粉含有较高的总淀粉、直链淀粉及水分，较低的粗蛋白、粗脂肪和灰分。其直链淀粉含量高于李秀娟等[5]和Guo等[13]的研究结果，二者分别为20.5%和30.1%，这可能是由于选用的桂圆品种与提取方法不同。其粗蛋白含量明显低于彭小燕等[3]分别采用高速剪切辅助碱法和传统碱法提取的龙眼核淀粉，二者分别为4.24%和3.76%，说明添加碱性蛋白酶能有效分解龙眼核中的蛋白质，降低淀粉中的蛋白质含量。
表 1 龙眼核淀粉的化学组成Table 1. Chemical composition of longan kernel starch成分 总淀粉
（g/100 g）直链淀粉
（%）水分
（g/100 g）粗脂肪
（g/100 g）粗蛋白
（g/100 g）灰分
（g/100 g）龙眼核淀粉 82.64±0.52 36.37±1.02 12.41±0.06 0.68±0.03 0.46±0.04 1.06±0.13 2.2 龙眼核淀粉的颗粒形态与结构特性
2.2.1 龙眼核淀粉的粒径分布与颗粒形貌
龙眼核淀粉颗粒粒径见表2。可以看出，3种淀粉颗粒粒径间存在显著差异，其中龙眼核淀粉的粒径最小。小颗粒淀粉具有良好的流动性、填充性和反应活性，因此龙眼核淀粉在生物降解塑料、脂肪替代物、化妆品等领域显示出良好的应用前景[14]。
表 2 龙眼核淀粉颗粒的粒径Table 2. Size of longan kernel starch granules龙眼核淀粉的颗粒形态如图1所示。可以看出，龙眼核淀粉颗粒多呈椭圆形或不规则多边形，表面较光滑，仅少许淀粉颗粒表面存在裂纹，这与Hu等[4]和李秀娟等[5]的研究结果一致，说明碱性蛋白酶的加入未对淀粉结构造成不良影响。
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图 1 龙眼核淀粉的扫描电镜图（500×和2000×）Figure 1. Scanning electron micrograph of longan kernel starch (500× and 2000×)2.2.2 龙眼核淀粉的晶体结构
淀粉微晶大小的差异使其在X衍射曲线上表现出不同衍射特征，据此可将淀粉分为A、B和C型3种晶型结构[15]。龙眼核淀粉的晶体结构如图2所示。可以看出，龙眼核淀粉在15°、17°、18°和23°附近有较强的衍射峰，符合常见于谷物淀粉的A型晶体结构[16]，这与Hu等[4]的研究结果一致。通过对衍射峰及基线间衍射强度积分，得到龙眼核淀粉的相对结晶度为27.8%，该值与Hu等[4]报道的石硖龙眼核淀粉的相对结晶度接近（28.6%）。
2.2.3 龙眼核淀粉的红外吸收光谱
龙眼核淀粉的红外吸收光谱如图3所示。可以看出，3种淀粉的红外光谱大体相似，龙眼核淀粉的化学键类型和其他两种淀粉基本相同，但在含量上存在一些差异。龙眼核淀粉在3000~3700 cm−1处存在宽带特征吸收峰可能是己糖环上的O-H伸缩振动峰，说明其中存在分子内和分子间的氢键[17]。龙眼核淀粉在此位置的吸收峰与豌豆淀粉及玉米淀粉相比有一定偏移，可能是因为三者分子间和分子内氢键的强度及比例存在差异[18]。2928 cm−1附近的吸收峰是C-H键的不对称伸缩振动吸收峰；1641 cm−1处为淀粉中水分子的δ（O-H）弯曲振动吸收峰；1157 cm−1附近为C-C、C-O伸缩振动吸收峰；1082 cm−1处的吸收峰代表了淀粉分子中的C-O-H弯曲，也可表示淀粉中的非晶态[19-21]，三种淀粉在此4个吸收峰下的波数无明显差异，但在1019 cm−1处龙眼核淀粉的C-O伸缩振动吸收峰的波数与玉米淀粉和豌豆淀粉相差较大，这主要是受淀粉储存时间的影响[22]。
此外，淀粉在1045、1022 cm−1和995 cm−1处的峰值可以反映其晶体、非晶体结构及水合碳水化合物的螺旋结构[23]，因此常用（1045/1022）cm−1及（1022/995）cm−1的峰强度比值表征淀粉分子的近程有序结构，（1045/1022）cm−1值越大，（1022/995）cm−1值越小，淀粉的近程有序度越高[24]。龙眼核淀粉红外光谱共振峰相对强度比值见表3。可以看出，3种淀粉中，龙眼核淀粉的（1045/1022）cm−1值低于玉米淀粉，但高于豌豆淀粉；其（1022/995）cm−1比值稍高于玉米淀粉，但接近于豌豆淀粉，说明龙眼核淀粉的近程有序程度略低于玉米淀粉，但高于豌豆淀粉。
表 3 龙眼核淀粉的共振峰相对强度比值Table 3. Relative intensity ratios of resonance peak of longan kernel starch品种 （1045/1022）cm−1 （1022/995）cm−1 龙眼核淀粉 1.030 1.002 玉米淀粉 1.037 0.993 豌豆淀粉 1.013 1.005 2.3 龙眼核淀粉的理化特性
2.3.1 淀粉糊的透明度
透光率可表征淀粉糊的透明度；透光率越高，则淀粉糊的透明度越高[25]。1%龙眼核淀粉糊的透光率随着放置时间的变化如图4所示。可以看出，随放置时间的延长，3种淀粉糊的透明度均呈缓慢下降趋势，室温下放置60 h后龙眼核淀粉糊的透明度与豌豆淀粉接近，透光率为3.81%；3种淀粉糊中，豌豆淀粉糊的透光率最大，龙眼核淀粉糊次之，玉米淀粉糊的透光率最小，这与淀粉颗粒大小及直链淀粉聚集和重结晶等均有关。龙眼核淀粉透明度较低可能因为其颗粒较小、结构紧凑，易对光线产生反射或折射[26-27]。
2.3.2 溶解度与膨润力
溶解度和膨润力可反映淀粉在加热过程中的变化，对其在食品中的应用具有重要意义。龙眼核淀粉的溶解度随温度的变化如图5（a）所示。可以看出，3种淀粉中，豌豆淀粉的溶解度最大，龙眼核淀粉次之，玉米淀粉的溶解度最小，这是由于玉米淀粉较高的支链淀粉含量会阻碍淀粉分子的溶出，从而降低其溶解度[28]。三者溶解度均随温度升高而增大，龙眼核淀粉的溶解度从50 ℃的3.5%上升至90 ℃的11.26%，这与李秀娟等[5]的结果相似，究其原因可能是温度超过70 ℃后龙眼核淀粉开始糊化，使得水分子进入淀粉的结晶区，淀粉颗粒膨胀崩解，颗粒内的淀粉分子大量溶出使其溶解度上升[10]。
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图 5 不同温度下龙眼核淀粉的溶解度（a）与膨润力（b）Figure 5. Solubility (a) and swelling power (b) of longan kernel starch at different temperatures由图5（b）可知，3种淀粉的膨润力均随温度的升高而增大；60 ℃之前膨润力基本一致，玉米淀粉和豌豆淀粉的膨润力在60 ℃后明显上升，龙眼核淀粉的膨润力在70 ℃后才快速增加，并在80 ℃后超过玉米淀粉和豌豆淀粉，最终达到15.93%。这可能是因为龙眼核淀粉分子间氢键在较高温度下才发生断裂，之后水分子加速渗入淀粉分子中，使得淀粉快速膨胀而糊化。该结果中膨润力值低于李秀娟等[5]报道的结果，这可能是由于本研究提取的龙眼核淀粉直链淀粉含量高于李秀娟等的结果，直链淀粉与支链淀粉相互缠结，抑制了淀粉的膨胀[29]。
2.3.3 热力学特性
淀粉糊化过程常伴随着支链淀粉双螺旋从半结晶结构解离成无定形构象以及部分直链淀粉的溶出。3种淀粉糊化的起始温度（T0）、峰值温度（Tp）、结束温度（Tc）和糊化焓（ΔH）见表4。可以看出，3种淀粉的热力学特性存在显著差异（P<0.05），其中龙眼核淀粉的糊化温度和糊化焓最高，说明其凝胶化起始所需的能量最大，且其双螺旋结构更为紧密。3种淀粉糊化温度的差异可能是其颗粒形态、晶体结构、直链淀粉含量、淀粉的分子结构等存在差异导致的，研究表明淀粉糊化温度和焓变与直链淀粉含量呈负相关，B型结晶度比A型结晶度更易糊化，小颗粒淀粉比大颗粒淀粉具有更高的糊化温度[30-32]。本研究中龙眼核淀粉的T0和Tc与Guo等[13]DSC法测定的结果接近，明显高于李秀娟等[5]采用偏光十字法测得的结果，这可能是二者的测定方法及直链淀粉含量的不同。
表 4 龙眼核淀粉的热力学特性Table 4. Thermal parameters of longan kernel starch品种 T0（℃） Tp（℃） Tc（℃） ΔH（J/g） 龙眼核淀粉 70.4±0.2a 75.9±0.4a 82.1±0.1a 13.7±0.3a 玉米淀粉 63.3±0.4b 68.8±0.3b 73.9±0.5b 11.4±0.7b 豌豆淀粉 61.5±0.2c 67.3±0.4c 71.8±0.6c 10.6±0.3b 2.3.4 糊化特性
糊化特性是淀粉特性的重要指标之一，可以反映淀粉悬浮液在加热及冷却过程中的黏度变化。3种淀粉的糊化参数见表5。可以看出，3种淀粉中，龙眼核淀粉的糊化温度为76.45 ℃，接近于玉米淀粉，明显高于豌豆淀粉（P<0.05），表明其颗粒结构更为紧密，淀粉分子间存在更强的结合力，使得其能更强地抵抗溶胀和破裂，因此不易糊化。该结果与表4存在差异是因为测定方法及淀粉浓度不同。钱建亚等[33]研究显示，DSC法测定的淀粉糊化温度明显低于RVA法。除糊化温度外，3种淀粉其它糊化参数均存在显著差异（P<0.05），这可能是因为这些淀粉的颗粒大小、颗粒内部分子排列、直链淀粉含量等不同[34-36]。龙眼核淀粉较高的峰值黏度可能与其高直链淀粉含量和高温下较高的溶胀力有关。崩解值可以表征淀粉的热糊稳定性；崩解值越小表明热糊稳定性越好。龙眼核淀粉的崩解值显著高于豌豆淀粉和玉米淀粉，说明龙眼核淀粉的热糊稳定性较差[37]。回生值可以表征淀粉的冷糊稳定性，其值越小表明冷糊稳定性越好[38]，龙眼核淀粉的回生值明显低于豌豆淀粉，说明其冷糊稳定性优于豌豆淀粉。此研究结果中峰值黏度、谷值黏度、最终黏度、崩解值和回生值均明显高于Guo等[13]的研究，这可能由于本研究中龙眼核淀粉含有更多的直链淀粉。
表 5 龙眼核淀粉的糊化特性参数Table 5. Gelatinization characteristic parameters of longan kernel starch品种 糊化温度
（℃）峰值黏度（cP） 谷值黏度（cP） 崩解值
（cP）最终黏度（cP） 回生值
（cP）峰值时间
（min）龙眼核淀粉 76.45±0.40a 3735±58a 2468±42a 1268±17a 3972±62a 1504±84b 4.57±0.04b 玉米淀粉 76.38±0.48a 2596±32c 1757±41c 840±72c 2660±59c 904±100c 5.27±0.07a 豌豆淀粉 74.50±0.15b 2999±45b 1836±50b 1163±6b 3555±49b 1719±99a 4.57±0.10b 3. 结论
本文中采用酶辅助碱法提取龙眼核淀粉，分析了其化学组成、理化及结构特性。龙眼核淀粉含有较高的直链淀粉，其颗粒呈椭圆形或不规则多边形，表面较为光滑，少许颗粒表面有裂纹及孔洞。龙眼核淀粉具有小粒径、A型结晶结构和较高的近程有序度，其透明度较低且随放置时间的增加而缓慢下降，溶解度随温度增加而平稳上升，膨润力在70 ℃后迅速增加。龙眼核淀粉较难糊化，拥有较高的糊化温度和糊化焓，热糊稳定性较差，冷糊稳定性较好。本研究表明酶辅助碱法提取的龙眼核淀粉相较于其他提取方法可明显减少淀粉中的蛋白质残留，且对淀粉结构未造成不良影响，理化性质上存在一定差异，这为龙眼核淀粉在食品中的应用研究提供了支撑。
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图 1 龙眼核淀粉的扫描电镜图（500×和2000×）
Figure 1. Scanning electron micrograph of longan kernel starch (500× and 2000×)
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图 5 不同温度下龙眼核淀粉的溶解度（a）与膨润力（b）
Figure 5. Solubility (a) and swelling power (b) of longan kernel starch at different temperatures
表 1 龙眼核淀粉的化学组成
Table 1 Chemical composition of longan kernel starch
成分 总淀粉
（g/100 g）直链淀粉
（%）水分
（g/100 g）粗脂肪
（g/100 g）粗蛋白
（g/100 g）灰分
（g/100 g）龙眼核淀粉 82.64±0.52 36.37±1.02 12.41±0.06 0.68±0.03 0.46±0.04 1.06±0.13 
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表 3 龙眼核淀粉的共振峰相对强度比值
Table 3 Relative intensity ratios of resonance peak of longan kernel starch
品种 （1045/1022）cm−1 （1022/995）cm−1 龙眼核淀粉 1.030 1.002 玉米淀粉 1.037 0.993 豌豆淀粉 1.013 1.005
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表 4 龙眼核淀粉的热力学特性
Table 4 Thermal parameters of longan kernel starch
品种 T0（℃） Tp（℃） Tc（℃） ΔH（J/g） 龙眼核淀粉 70.4±0.2a 75.9±0.4a 82.1±0.1a 13.7±0.3a 玉米淀粉 63.3±0.4b 68.8±0.3b 73.9±0.5b 11.4±0.7b 豌豆淀粉 61.5±0.2c 67.3±0.4c 71.8±0.6c 10.6±0.3b
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表 5 龙眼核淀粉的糊化特性参数
Table 5 Gelatinization characteristic parameters of longan kernel starch
品种 糊化温度
（℃）峰值黏度（cP） 谷值黏度（cP） 崩解值
（cP）最终黏度（cP） 回生值
（cP）峰值时间
（min）龙眼核淀粉 76.45±0.40a 3735±58a 2468±42a 1268±17a 3972±62a 1504±84b 4.57±0.04b 玉米淀粉 76.38±0.48a 2596±32c 1757±41c 840±72c 2660±59c 904±100c 5.27±0.07a 豌豆淀粉 74.50±0.15b 2999±45b 1836±50b 1163±6b 3555±49b 1719±99a 4.57±0.10b
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