高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定鸡肉中头孢菌素的不确定度评定

徐幸; 张燕; 舒平; 杨卫花; 赵浩军; 董依依

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2021090034

高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定鸡肉中头孢菌素的不确定度评定

大理州质量技术监督综合检测中心，云南大理 671000

基金项目: 国家市场监督管理总局技术保障专项项目（2019YJ040）。

详细信息

作者简介:
徐幸（1983−），女，博士，高级工程师，研究方向：食品质量安全检测，E-mail：xuxing1983@163.com

中图分类号: O657.63
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出版历程
- 收稿日期: 2021-09-02
- 网络出版日期: 2022-02-11
- 刊出日期: 2022-04-14

Evaluation of Uncertainty in Determination of Cephalosporins in Chicken by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Isotope Internal Standard Method

Dali Comprehensive Inspection Centre of Quality and Technical Supervision, Dali 671000, China

摘要

摘要: 为保证检测数据的准确可靠，对高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定鸡肉中头孢菌素进行不确定度的评定。分析测量过程中各不确定度的来源，建立数学计算模型，通过对各不确定度来源进行量化分析，计算出各个分量的不确定度，最终合成标准不确定度。当样品中头孢菌素的含量为250 μg/kg水平时，不同头孢菌素的扩展不确定度在43.60~50.10 μg/kg范围。结果表明，不确定度主要来源于计量器具（0.0762）、重复性（0.0337）、分析仪器（0.0250）以及添加内标（0.0224），其中计量器具对不确定度的贡献最大。该评估模型可为采用高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定头孢菌素的不确定度评定提供参考依据。
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- 头孢菌素 /
- 鸡肉
Abstract: In order to ensure the accuracy of test results, the uncertainty determination of cephalosporins in chicken by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry isotope internal standard method was evaluated. The source of uncertainty was evaluated and the mathematical model was established. Through quantitative analysis of each component of uncertainty, the uncertainty of each component was calculated. Finally, standard uncertainty was composited. When the content of cephalosporins in the sample was 250 μg/kg, the expanded uncertainty was 43.60~50.10 μg/kg. The results showed that uncertainty mainly derived from the measuring instruments (0.0762), repeatability (0.0337), analytical instruments (0.0250) and the addition of internal standards (0.0224). Among them the measurement instrument contributed the most to the uncertainty. It provided a reference basis for uncertainty evaluation of determination of cephalosporins by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry isotope internal standard method.
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头孢菌素（Cephalosporins）是一种常用的抗生素，其分子结构中含有头孢烯，是β-内酰胺类抗生素中的7-氨基头孢烷酸（7-Aminocephalosporanic acid，7-ACA）的衍生物，不同的头孢菌素具有类似的杀菌机制。然而在饲养家禽过程中频繁、大量地使用抗生素，可能会造成动物机体中抗生素蓄积的情况，抗生素残留可使动物体内的细菌产生耐药性，而耐药致病菌极易感染人体，扰乱人体微生态而产生副作用。因此，对动物源性食品中的头孢菌素残留展开风险监测具有现实意义。

目前，关于头孢菌素残留的检测方法主要有高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法，检测样品的种类涉及药品、水产品、肉制品和蜂产品等^[1-6]，这些检测方法多采用外标法定量，因动物机体样品基质复杂，采用外标定量容易产生明显的基质效应，使定量结果不准确。其次，这些方法的净化步骤繁琐，需要使用大量有机溶剂，所用的固相萃取柱大多数是商品化的通用柱，对头孢菌素的吸附特异性不高，因此，建立简便、快速检测头孢菌素的方法是实施有效监控的前提条件。

本实验考虑采用特异性较高的分子印迹技术^[7-10]，制备头孢菌素的分子印迹材料作为净化吸附剂，结合液相色谱-同位素稀释质谱法测定鸡肉中多种头孢菌素。为确保检测结果的准确可靠，有必要对其进行测量不确定度的评定。依据CNAS-GL06: 2019《化学分析中不确定度的评估指南》^[11]和JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》^[12]规定的不确定度评定的方法，对本文所建立的测量鸡肉中多种头孢菌素的方法，进行不确定度的评定，分析不确定度的来源，找出影响结果的主要因素，并有针对性的加以改进，对保障检测结果的准确性具有重要意义。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡脯肉　市售；头孢氨苄、头孢地尼、头孢克肟、头孢唑啉等标准品　中国食品药品检定研究院；头孢拉定、头孢匹林、头孢哌酮等标准品　德国Dr.Ehrenstorfer公司；头孢匹林-d4同位素内标物　加拿大TRC公司；油酸、纳米四氧化三铁（Fe₃O₄，≤30 nm）、甲基丙烯酸（MAA）、2,2’-偶氮二异丁腈（AIBN）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、0.22 μm尼龙滤膜　上海安谱科学仪器有限公司；甲酸（色谱纯）　Acros公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）　德国Merck公司；其他试剂　均为分析纯。

QTRAP 4500高效液相色谱-串联质谱仪　AB SCIEX公司；Ascentis C₈色谱柱（规格为10 cm×4.6 mm，3 μm）　SUPELCO公司；涡旋振荡器　Thermo公司；超纯水机　Millipore公司；AL204型电子天平（0.1 mg）、PL2002型电子天平（0.01 g）　Mettler toledo公司；TG16-WS台式高速离心机　湖南湘仪公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取头孢菌素标准品各10 mg（精确值0.1 mg），分别用甲醇/水（v/v=1:2）溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的单标储备液，避光保存于4 ℃冰箱中。分别吸取各单标储备液，配制成质量浓度为5、10、20、40、60、80、100 μg/L的混合标准溶液，准确吸取头孢匹林-d4内标储备液，配制进各质量浓度水平的混合标准溶液，得到内标的质量浓度为10 μg/L，供液相色谱-串联质谱联用仪测定。

1.2.2 磁性分子印迹材料的制备

称取0.1 mmol的7-ACA，置于100 mL的圆底烧瓶中，加入0.5 mmol MAA和2.5 mmol EGDMA，加入50 mL甲醇/水（v/v=1:4），溶解混匀，加入1 g油酸改性的Fe₃O₄粒子，最后加入0.5 mmol AIBN。充氮5 min，将瓶口密封，混合溶液在60 ℃水浴下振荡反应24 h，收集聚合物并用滤纸包好，置于索氏抽提器中，用500 mL乙酸/甲醇（v/v=1:4）抽提24 h，洗脱多余的7-ACA，用500 mL甲醇抽提12 h，60 ℃真空干燥收集头孢菌素的磁性分子印迹材料^[13-15]。

1.2.3 样品净化

称取2 g绞碎的鸡肉样品（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入头孢匹林-d4内标溶液，加入10 mL乙腈涡旋提取1 min，振荡混匀，以转速6000 r/min离心5 min，取上清液作为提取液，取1 mL提取液置于样品瓶中，添加10 mg磁性分子印迹材料，振荡混匀。将钕铁硼置于样品瓶外，作为外加磁场将分子印迹材料与溶液分离，弃去废液，再向装有磁性分子印迹材料的样品瓶中加入5 mL乙腈作为淋洗液，振荡混匀，通过磁场分离两相，弃去废液，再重复1次加入5 mL乙腈作为淋洗液，振荡混合，再次通过磁场分离两相，弃去废液。最后向装有磁性分子印迹材料的样品瓶中加入1 mL甲醇/水（v/v= 1:2）作为洗脱液，振荡混匀，再次通过磁场分离两相，收集洗脱液，采用0.22 μm尼龙滤膜过滤，得到待检测液，供液相色谱-串联质谱仪测定^[16]。

1.2.4 仪器分析条件

流动相：A为体积浓度为0.1%的甲酸溶液；B为乙腈。

液相色谱洗脱条件：0~1.0 min，5% B；1.0~8.0 min，5%~95% B；8.0~10.0 min，95% B；10.0~10.1 min，95%~5% B；10.1~14.0 min，5% B。流速0.50 mL/min，进样量为1 μL；柱温40 ℃。

质谱条件：离子源为正ESI源，喷雾电压为5500 eV，离子源温度为110 ℃，扫描方式多重反应监测模式（MRM）条件见表1。

表 1 多反应监测条件

Table 1. Parameter of MRM

化合物	保留时间（min）	母离子对（m/z）	子离子（m/z）	锥孔电压（V）	碰撞能量（eV）
头孢氨苄	5.58	348.1^*	158.0^*	80	14
头孢氨苄	5.58	348.1	174.0	80	22
头孢拉定	5.64	350.0^*	175.9^*	80	17
头孢拉定	5.64	350.0	157.9	80	13
头孢地尼	5.78	396.2^*	126.0^*	70	33
头孢地尼	5.78	396.2	152.0	70	33
头孢匹林	5.40	424.1^*	292.0^*	100	23
头孢匹林	5.40	424.1	152.1	100	34
头孢克肟	6.25	453.8^*	284.9^*	50	23
头孢克肟	6.25	453.8	126.0	50	33
头孢唑啉	6.70	455.1^*	323.2^*	70	17
头孢唑啉	6.70	455.1	155.9	70	24
头孢哌酮	7.07	646.2^*	142.9^*	70	30
头孢哌酮	7.07	646.2	530.2	70	10
头孢匹林-d4	5.36	428.0^*	296.0^*	80	22
头孢匹林-d4	5.36	428.0	156.0	80	28
注：*为定量离子。

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1.3 建立数学模型

本实验中，头孢菌素的数学计算模型如下：

$\rm X=\frac{C\times V\times 1000}{m\times {f}_{rec}\times 1000}$

(1)

式中：X为试样中头孢菌素的含量，μg/kg；C为从校准曲线上计算得到头孢菌素的质量浓度，μg/L；V为提取液定容体积，mL；m为试样质量，g；f_rec为样品加标回收率，%。

2. 结果与分析

2.1 不确定度的主要来源

根据上述建立的方法测量鸡肉样品中的头孢菌素时，可能引入不确定度的有：标准品纯度、标准溶液稀释过程、标准曲线拟合、样品前处理、回收率和分析仪器的重复性等因素，详细来源见图1。

图 1 鸡肉中头孢菌素残留不确定度来源

Figure 1. Uncertainty source for determination of cephalosporins residues in chicken

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2.2 标准溶液配制过程引入的不确定度

2.2.1 标准物质纯度的不确定度

根据标准品纯度计算不确定度，由头孢菌素的标准品纯度引入的不确定度见表2，取均匀分布^[17-18]，标准品物质纯度的不确定度计算公式为：

纯 度

$\rm {u}_{rel}(p)=\frac{1-纯度}{\sqrt{3}}$

(2)

表 2 标准物质的纯度及不确定度

Table 2. Purities and uncertainties of standard materials

标准品	纯度（%）	u_rel（p）
头孢氨苄	98	0.01155
头孢拉定	97	0.01732
头孢地尼	95	0.02887
头孢匹林	97	0.01732
头孢克肟	98	0.01155
头孢唑啉	97	0.01732
头孢哌酮	98	0.01155
头孢匹林-d4	97	0.01732

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2.2.2 称量标准物质引入的不确定度

天平允许的最大误差为±0.1 mg，每种头孢菌素的标准品均称取10 mg，取均匀分布^[19-21]，称量标准物质引入的相对不确定度为：

$\rm {u_{rel}}(m) = \frac{{0.1}}{{\sqrt 3 \times 10}} = 0.005774$

(3)

2.2.3 稀释标准溶液引入的不确定度

稀释标准溶液的过程中使用了各种计量器具，参考JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》^[22]以及JJG 646-2006《移液器检定规程》^[23]对最大允许误差的规定，按照CNAS-GL06：2019《化学分析中不确定度的评估指南》^[11]的评估方法，玻璃量器取三角分布，移液器取均匀分布，按照检定规程中的最大允许误差，计算出稀释标准溶液的过程中，由计量器具引入的相对不确定度见表3。

表 3 标准溶液配制过程中玻璃量器和移液器引入的不确定度

Table 3. Uncertainties resulting from the preparation of standard solution by volumetric flasks and pipettes

玻璃量器与移液器	最大允许误差	定容或移取体积（mL）	包含因子	使用次数	相对不确定度
10 mL单标线容量瓶A级	±0.020 mL	10	$\sqrt 6$	1	u_v1rel=0.000816
100 mL单标线容量瓶A级	±0.10 mL	100	$\sqrt 6$	1	u_v2rel=0.000408
0.1~1 mL移液器1 mL检定点	±1.0%	1	$\sqrt 3$	7	u_v3rel=0.005774
0.01~0.1 mL移液器0.1 mL检定点	±2.0%	0.06、0.08、0.1	$\sqrt 3$	4	u_v4rel=0.01155
0.01~0.1 mL移液器0.05 mL检定点	±3.0%	0.02、0.04	$\sqrt 3$	2	u_v5rel=0.01732
0.001~0.01 mL移液器0.01 mL检定点	±8.0%	0.01	$\sqrt 3$	1	U_v6rel=0.04619
0.001~0.01 mL移液器0.005 mL检定点	±8.0%	0.005	$\sqrt 3$	1	U_v7rel=0.04619

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稀释标准溶液的过程中，按照玻璃量器和移液器的使用频次，由表3的数据合成出标准溶液稀释过程由计量器具引入的不确定度：

$\begin{split} & \rm {u}_{rel}{(v)}_{外标}\\ & =\sqrt{ \rm {u}_{v1rel}^{2}+{u}_{v2rel}^{2}+7{u}_{v3rel}^{2}+4{u}_{v4rel}^{2}+2{u}_{v5rel}^{2}+{u}_{v6rel}^{2}+{u}_{v7rel}^{2}}\\ & \rm =0.07506 \end{split}$

(4)

$\rm {u}_{rel}{(v)}_{内标}=\sqrt{\rm {u}_{v1rel}^{2}+{u}_{v2rel}^{2}+{u}_{v3rel}^{2}+{u}_{v4rel}^{2}}=0.01294$

(5)

$\rm {u}_{rel}{(V)}_{标液}=\sqrt{\rm {u}_{rel}{(v)}_{外标}^{2}+{u}_{rel}{(v)}_{内标}^{2}}=0.07617$

(6)

2.2.4 配制标准溶液由温度引入的不确定度

按照标准溶液配制的要求温度应符合20±5 ℃的要求，根据不同溶剂的体积膨胀系数，计算温度引入的不确定度。采用甲醇/水（体积比1:2）的混合溶剂稀释标准溶液，甲醇在20 ℃时的膨胀系数为1.19×10⁻³ mL/℃，水在20 ℃时的膨胀系数为1.80×10⁻³ mL/℃，取均匀分布，由温度引入的不确定度如下：

$\rm {u}_{T甲醇rel}=\frac{5\text{×1}{\text{.19×10}}^{{-3}}}{\sqrt{3}}=0.003435$

(7)

$\rm {u}_{T水rel}=\frac{5\text{×1}{\text{.80×10}}^{{-3}}}{\sqrt{3}}=0.005196$

(8)

$\rm {u}_{rel}(T)=\sqrt{\rm \frac{1}{3}{u}_{T甲醇rel}^{2}+\frac{2}{3}{u}_{水2rel}^{2}}=0.004683$

(9)

2.2.5 最小二乘法拟合校准曲线的不确定度

标准系列的质量浓度为5、10、20、40、60、80、100 μg/L，通过测定标准工作溶液，每个浓度测量2次，采用最小二乘法拟合校准曲线，得到的回归方程与相关系数见表4。

表 4 头孢菌素内标法标准曲线的数据

Table 4. Data for internal standard curve of cephalosporins

待测化合物	标准溶液浓度（μg/L）	外标溶液峰面积		外标/内标峰面积比值		回归方程	相关系数
待测化合物	标准溶液浓度（μg/L）	1	2	1	2	回归方程	相关系数
头孢氨苄	5	3550	3650	0.475	0.475	y=0.0923x+0.0659	0.9995
	10	8030	8050	1.032	0.998
	20	14300	13800	1.970	1.890
	40	31400	31000	3.829	3.794
	60	47400	47800	5.623	5.463
	80	62400	60200	7.482	7.497
	100	81200	79500	9.186	9.386
头孢拉定	5	4530	4590	0.606	0.598	y=0.0944x+0.0984	0.9997
	10	7680	7780	0.987	0.964
	20	14400	14500	1.983	1.986
	40	32500	32100	3.963	3.929
	60	48400	50100	5.741	5.726
	80	63400	61800	7.602	7.696
	100	83700	81300	9.468	9.599
头孢地尼	5	2110	2220	0.282	0.289	y=0.0653x–0.0779	0.9996
	10	4370	4440	0.562	0.550
	20	8630	8790	1.189	1.204
	40	20800	21200	2.537	2.595
	60	32300	33500	3.832	3.829
	80	42300	41000	5.072	5.106
	100	56900	55400	6.437	6.541
头孢匹林	5	5760	5820	0.771	0.758	y=0.1982x–0.2668	0.9998
	10	13700	14200	1.761	1760
	20	26700	27400	3.678	3.753
	40	61900	61500	7.549	7.528
	60	97900	101300	11.613	11.577
	80	129700	125000	15.552	15.567
	100	175000	165000	19.796	19.481
头孢克肟	5	6160	6290	0.825	0.819	y=0.1264x+0.1732	0.9994
	10	11600	11000	1.491	1.363
	20	19300	18700	2.658	2.562
	40	43400	43000	5.293	5.263
	60	66100	67900	7.841	7.760
	80	86900	83200	10.420	10.361
	100	114000	106000	12.896	12.515
头孢唑啉	5	2120	2280	0.284	0.297	y=0.0470x+0.0704	0.9994
	10	4290	4300	0.551	0.533
	20	7340	7380	1.011	1.011
	40	16100	15900	1.963	1.946
	60	24500	25200	2.906	2.880
	80	32100	31600	3.849	3.935
	100	41300	40500	4.672	4.782
头孢哌酮	5	3760	3820	0.503	0.497	y=0.0916x+0.0469	0.9988
	10	7670	7810	0.986	0.968
	20	13300	13500	1.832	1.849
	40	30800	30300	3.756	3.709
	60	46600	47300	5.528	5.406
	80	62700	61500	7.518	7.659
	100	80800	76500	9.140	9.032

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待测样品重复测量2次，根据表4中的回归方程计算出平均值，最小二乘法拟合校准曲线的不确定度计算公式为^[24]：

$\rm {u_{rel}}(c) = \frac{{S(A)}}{b}\sqrt {\rm \frac{1}{p} + \frac{1}{{mn}} + \frac{{{{({C_0} - \overline C )}^2}}}{{{S_{cc}}}}}$

(10)

其中：

$\rm S(A) = \sqrt {\rm \frac{{\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^n {\displaystyle\sum\limits_{j = 1}^m {{{({Y_{ij}} - {Y_i})}^2}} } }}{{mn - 2}}}$

(11)

$\rm \overline C = \frac{{\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^n {\displaystyle\sum\limits_{j = 1}^m {{C_{ij}}} } }}{{mn}}$

(12)

$\rm {S_{cc}} = {\sum\limits_{i = 1}^n {\sum\limits_{j = 1}^m {({C_{ij}} - \overline C )} } ^2}$

(13)

$\rm {u_{rel}}(c') = \frac{{{u_{rel}}(c)}}{{{C_0}}}$

(14)

式中：S（A）为校准曲线的标准偏差；b为校准曲线的斜率；C₀为样品中实测头孢菌素的平均值； $\overline {\rm{C}}$ 为各头孢菌素组分的质量浓度C_ij平均值（本文中为45）；p为重复测量样品的次数（本文中为2）；m为重复测量标准溶液的次数（本文中为2）；n为标准溶液质量浓度的个数（本文中为7）；S_cc为C_ij与 $\overline {\rm{C}}$ 之差的平方和（本文中为7950）；Y_ij为外标/内标的实测峰面积比值；Y_i为根据回归方程计算出外标/内标的峰面积比值。按照以上公式计算由标准曲线拟合的标准不确定度u_rel（c）和相对不确定度u_rel（c'）见表5。

表 5 校准曲线拟合数据及不确定度

Table 5. Data for fitting calibration curve and uncertainties

待测化合物	S（A）	b	（Y_ij−Y_i）²	C₀	标准不确定度u_rel（c）	相对不确定度u_rel（c'）
头孢氨苄	0.07154	0.0923	0.06141	52.17	0.5892	0.01129
头孢拉定	0.05546	0.0944	0.03691	53.07	0.4473	0.008428
头孢地尼	0.04549	0.0653	0.02483	50.63	0.5284	0.01044
头孢匹林	0.09584	0.1982	0.1102	48.43	0.3660	0.007558
头孢克肟	0.1163	0.1264	0.1623	47.89	0.6895	0.01440
头孢唑啉	0.04322	0.0470	0.02242	51.25	0.6982	0.01362
头孢哌酮	0.1158	0.0916	0.1609	54.85	0.9658	0.01761

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在测量鸡肉中头孢菌素的过程中，由标准溶液配制稀释过程引入的合成不确定度采用如下公式计算，结果数据见表6。

表 6 标准溶液配制过程中引入的合成不确定度

Table 6. Combined uncertainties resulting from the preparation of standard solution

待测化合物	u_rel（p）	u_rel（m）	u_rel（V）_标液	u_rel（T）	u_rel（c'）	u_rel（C）
头孢氨苄	0.01155	0.005774	0.07617	0.004683	0.01129	0.07822
头孢拉定	0.01732	0.005774	0.07617	0.004683	0.008428	0.07892
头孢地尼	0.02887	0.005774	0.07617	0.004683	0.01044	0.08246
头孢匹林	0.01732	0.005774	0.07617	0.004683	0.007558	0.07883
头孢克肟	0.01155	0.005774	0.07617	0.004683	0.01440	0.07873
头孢唑啉	0.01732	0.005774	0.07617	0.004683	0.01362	0.07964
头孢哌酮	0.01155	0.005774	0.07617	0.004683	0.01761	0.07938

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$\rm {u}_{rel}(C)=\sqrt{\rm{u}_{rel}{(p)}^{2}+{u}_{rel}{(m)}^{2}+{u}_{rel}{(V)}_{标液}^{2}+{u}_{rel}{(T)}^{2}+{u}_{rel}{(c{'})}^{2}}$

(15)

2.3 样品净化过程引入的不确定度

2.3.1 称量样品引入的不确定度

天平检定证书上给出的最大误差为±0.0l g，称取鸡肉样品2 g，取均匀分布，引入的不确定度为：

$\rm {u_{rel}}(W) = \frac{{0.01}}{{\sqrt 3 \times 2}} = 0.002887$

(16)

2.3.2 添加内标引入的不确定度

采用0.01~0.1 mL移液器吸取质量浓度为1 mg/L头孢匹林-d4标准溶液0.1 mL，由添加内标引入的不确定度为^[25-26]：

$\rm {u}_{rel}(I)=\sqrt{\rm{u}_{rel}{(p)}^{2}+{u}_{rel}{(m)}^{2}+{u}_{rel}{(v)}_{内标}^{2}} =0.02238$

(17)

2.3.3 样品定容引入的不确定度

采用10 mL玻璃吸量管吸取10 mL提取溶液加入样品中，10 mL单标线吸量管A级的最大允许误差为±0.020 mL，经过磁性分子印迹材料萃取后，采用0.1~1 mL的移液器吸取1 mL甲醇/水（v/v=1:2）溶液定容，由样品定容引入的不确定度各分量分别为：

$\rm {u_{v8rel}} = \frac{{0.02}}{{\sqrt 6 \times 10}} = 0.000816$

(18)

由样品定容引入的不确定度为：

$\rm {u}_{rel}{(V)}_{样品}=\sqrt{\rm{u}_{v3rel}^{2}+{u}_{v8rel}^{2}+{u}_{rel}{(T)}^{2}}=0.007479$

(19)

2.3.4 重复性引入的不确定度

采用空白鸡肉样品中做添加回收率试验，添加水平为40 μg/L，重复测定6次，由重复性引入的相对不确定度计算公式如下^[27-29]：

$\rm {u_{rel}}(R) = \frac{{S(\overline R )}}{{\sqrt 6 \times \overline R }}$

(20)

对回收率进行显著性检验：

$\rm t = \frac{{\left| {100\text{%} - \overline R } \right|}}{{{u_{rel}}(R)}}$

(21)

$\rm {u}_{rel}(S)=\sqrt{\rm{u}_{rel}{(W)}^{2}+{u}_{rel}{(I)}^{2}+{u}_{rel}{(V)}_{样品}^{2}+{u}_{rel}{(R)}^{2}}$

(22)

式中： $\overline {\rm{R}}$ 为平均回收率； $\rm S(\overline R )$ 为相对标准偏差；u_rel（R）为重复性引入的不确定度；u_rel（S）为样品前处理过程引入的合成不确定度。

根据以上公式计算，自由度f=n−1=5，根据t检验临界值分布表，在95%的置信水平下，t（0.05,5）=2.571，如t值˃双侧临界值，说明 $\overline {\rm{R}}$ 与100%具有显著性差异，需将f_rec带入修正结果^[24]。本文中t值结果均小于2.571，说明与100%不具有显著性差异，因此，无需带入f_rec以修正结果，结果数据见表7。

表 7 头孢菌素的回收率和相对不确定度

Table 7. Recoveries of cephalosporins and relative uncertainties

化合物名称	$\overline {\rm{R}}$ （%）	${\rm{S}}（\overline {\rm{R} } ）$ （%）	u_rel（R）	t值	P	u_rel（S）
头孢氨苄	105.45	6.13	0.02372	2.296	不显著	0.03358
头孢拉定	104.09	7.78	0.03052	1.338	不显著	0.03869
头孢地尼	96.41	8.94	0.03787	0.948	不显著	0.04471
头孢匹林	94.98	7.16	0.03078	1.630	不显著	0.03889
头孢克肟	91.68	10.33	0.04599	1.809	不显著	0.05177
头孢唑啉	103.07	7.84	0.03104	0.988	不显著	0.03910
头孢哌酮	97.01	8.48	0.03567	0.837	不显著	0.04287

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2.4 分析仪器引入的不确定度

本文采用高效液相色谱-串联质谱仪测量鸡肉中的头孢菌素，分析仪器的校准证书显示其扩展不确定度为5%，k=2，因此，分析仪器引入的不确定度为：

$\rm {u_{rel}}(E) = \frac{{0.050}}{2} = 0.0250$

(23)

2.5 测量不确定度的评定与报告

根据以上分析，测量鸡肉中头孢菌素的不确定度各分量来源见表8，各分量合成的不确定度计算公式为：

表 8 鸡肉中头孢菌素的相对不确定度来源表

Table 8. List of relative uncertainties for determination of cephalosporins in chicken

化合物名称	配制标准溶液 u_rel（C）	样品前处理 u_rel（S）	分析仪器 u_rel（E）	合成标准不确定度 u_rel（X）	试样中头孢菌素的含量 X（μg/kg）	扩展不确定度 U（μg/kg）
头孢氨苄	0.07822	0.03358	0.0250	0.08872	258.27	45.83
头孢拉定	0.07892	0.03869	0.0250	0.09138	261.43	47.78
头孢地尼	0.08246	0.04471	0.0250	0.09708	253.15	49.15
头孢匹林	0.07883	0.03889	0.0250	0.09139	238.57	43.60
头孢克肟	0.07873	0.05177	0.0250	0.09749	234.75	45.77
头孢唑啉	0.07964	0.03910	0.0250	0.09218	253.71	46.77
头孢哌酮	0.07938	0.04287	0.0250	0.09362	267.56	50.10

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$\rm {u_{rel}}(X) = \sqrt {\rm{u_{rel}}{{(C)}^2} + {u_{rel}}{{(S)}^2} + {u_{rel}}{{(E)}^2}}$

(24)

在95%的置信概率下，取包含因子k=2，依据JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》^[30]，扩展不确定度的计算公式为：

$\rm U = {C_0} \times {u_{rel}}(X) \times 2$

(25)

综上所述，测量鸡肉样品中头孢菌素的扩展不确定度见表8。

2.6 测量鸡肉中头孢菌素的不确定度来源分析

由图2可以看出，鸡肉中头孢菌素的不确定度各分量贡献率大小依次为计量器具、重复性、分析仪器、添加内标、标准品纯度、标准曲线拟合、样品定容与标准品称量等，而温度与称量样品引入的不确定度最小。

图 2 各分量不确定度柱状图

Figure 2. Bar chart of the uncertainty components

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3. 讨论与结论

本研究新建立了高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定鸡肉中头孢菌素的检测方法，为评估新方法的测量准确性，进行了不确定度的评定，结果显示不确定度的主要来源为：计量器具（0.0762）、重复性（0.0337）、分析仪器（0.0250）以及添加内标（0.0224）。计量器具的不确定度较高，主要是由于使用了微量移液器，若采用体积较大的计量器具配制标准溶液，将会降低由计量器具引入的不确定度，从而减小测量数据的不确定度。通过对高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定鸡肉中头孢菌素的不确定度进行评定，找出了影响不确定度的主要因素，对今后测量方法的改进提供了依据，以保障检测结果的准确性。

图 1 鸡肉中头孢菌素残留不确定度来源

Figure 1. Uncertainty source for determination of cephalosporins residues in chicken

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图 2 各分量不确定度柱状图

Figure 2. Bar chart of the uncertainty components

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表 1 多反应监测条件

Table 1 Parameter of MRM

化合物	保留时间（min）	母离子对（m/z）	子离子（m/z）	锥孔电压（V）	碰撞能量（eV）
头孢氨苄	5.58	348.1^*	158.0^*	80	14
头孢氨苄	5.58	348.1	174.0	80	22
头孢拉定	5.64	350.0^*	175.9^*	80	17
头孢拉定	5.64	350.0	157.9	80	13
头孢地尼	5.78	396.2^*	126.0^*	70	33
头孢地尼	5.78	396.2	152.0	70	33
头孢匹林	5.40	424.1^*	292.0^*	100	23
头孢匹林	5.40	424.1	152.1	100	34
头孢克肟	6.25	453.8^*	284.9^*	50	23
头孢克肟	6.25	453.8	126.0	50	33
头孢唑啉	6.70	455.1^*	323.2^*	70	17
头孢唑啉	6.70	455.1	155.9	70	24
头孢哌酮	7.07	646.2^*	142.9^*	70	30
头孢哌酮	7.07	646.2	530.2	70	10
头孢匹林-d4	5.36	428.0^*	296.0^*	80	22
头孢匹林-d4	5.36	428.0	156.0	80	28
注：*为定量离子。

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表 2 标准物质的纯度及不确定度

Table 2 Purities and uncertainties of standard materials

标准品	纯度（%）	u_rel（p）
头孢氨苄	98	0.01155
头孢拉定	97	0.01732
头孢地尼	95	0.02887
头孢匹林	97	0.01732
头孢克肟	98	0.01155
头孢唑啉	97	0.01732
头孢哌酮	98	0.01155
头孢匹林-d4	97	0.01732

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表 3 标准溶液配制过程中玻璃量器和移液器引入的不确定度

Table 3 Uncertainties resulting from the preparation of standard solution by volumetric flasks and pipettes

玻璃量器与移液器	最大允许误差	定容或移取体积（mL）	包含因子	使用次数	相对不确定度
10 mL单标线容量瓶A级	±0.020 mL	10	$\sqrt 6$	1	u_v1rel=0.000816
100 mL单标线容量瓶A级	±0.10 mL	100	$\sqrt 6$	1	u_v2rel=0.000408
0.1~1 mL移液器1 mL检定点	±1.0%	1	$\sqrt 3$	7	u_v3rel=0.005774
0.01~0.1 mL移液器0.1 mL检定点	±2.0%	0.06、0.08、0.1	$\sqrt 3$	4	u_v4rel=0.01155
0.01~0.1 mL移液器0.05 mL检定点	±3.0%	0.02、0.04	$\sqrt 3$	2	u_v5rel=0.01732
0.001~0.01 mL移液器0.01 mL检定点	±8.0%	0.01	$\sqrt 3$	1	U_v6rel=0.04619
0.001~0.01 mL移液器0.005 mL检定点	±8.0%	0.005	$\sqrt 3$	1	U_v7rel=0.04619

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表 4 头孢菌素内标法标准曲线的数据

Table 4 Data for internal standard curve of cephalosporins

待测化合物	标准溶液浓度（μg/L）	外标溶液峰面积		外标/内标峰面积比值		回归方程	相关系数
待测化合物	标准溶液浓度（μg/L）	1	2	1	2	回归方程	相关系数
头孢氨苄	5	3550	3650	0.475	0.475	y=0.0923x+0.0659	0.9995
	10	8030	8050	1.032	0.998
	20	14300	13800	1.970	1.890
	40	31400	31000	3.829	3.794
	60	47400	47800	5.623	5.463
	80	62400	60200	7.482	7.497
	100	81200	79500	9.186	9.386
头孢拉定	5	4530	4590	0.606	0.598	y=0.0944x+0.0984	0.9997
	10	7680	7780	0.987	0.964
	20	14400	14500	1.983	1.986
	40	32500	32100	3.963	3.929
	60	48400	50100	5.741	5.726
	80	63400	61800	7.602	7.696
	100	83700	81300	9.468	9.599
头孢地尼	5	2110	2220	0.282	0.289	y=0.0653x–0.0779	0.9996
	10	4370	4440	0.562	0.550
	20	8630	8790	1.189	1.204
	40	20800	21200	2.537	2.595
	60	32300	33500	3.832	3.829
	80	42300	41000	5.072	5.106
	100	56900	55400	6.437	6.541
头孢匹林	5	5760	5820	0.771	0.758	y=0.1982x–0.2668	0.9998
	10	13700	14200	1.761	1760
	20	26700	27400	3.678	3.753
	40	61900	61500	7.549	7.528
	60	97900	101300	11.613	11.577
	80	129700	125000	15.552	15.567
	100	175000	165000	19.796	19.481
头孢克肟	5	6160	6290	0.825	0.819	y=0.1264x+0.1732	0.9994
	10	11600	11000	1.491	1.363
	20	19300	18700	2.658	2.562
	40	43400	43000	5.293	5.263
	60	66100	67900	7.841	7.760
	80	86900	83200	10.420	10.361
	100	114000	106000	12.896	12.515
头孢唑啉	5	2120	2280	0.284	0.297	y=0.0470x+0.0704	0.9994
	10	4290	4300	0.551	0.533
	20	7340	7380	1.011	1.011
	40	16100	15900	1.963	1.946
	60	24500	25200	2.906	2.880
	80	32100	31600	3.849	3.935
	100	41300	40500	4.672	4.782
头孢哌酮	5	3760	3820	0.503	0.497	y=0.0916x+0.0469	0.9988
	10	7670	7810	0.986	0.968
	20	13300	13500	1.832	1.849
	40	30800	30300	3.756	3.709
	60	46600	47300	5.528	5.406
	80	62700	61500	7.518	7.659
	100	80800	76500	9.140	9.032

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表 5 校准曲线拟合数据及不确定度

Table 5 Data for fitting calibration curve and uncertainties

待测化合物	S（A）	b	（Y_ij−Y_i）²	C₀	标准不确定度u_rel（c）	相对不确定度u_rel（c'）
头孢氨苄	0.07154	0.0923	0.06141	52.17	0.5892	0.01129
头孢拉定	0.05546	0.0944	0.03691	53.07	0.4473	0.008428
头孢地尼	0.04549	0.0653	0.02483	50.63	0.5284	0.01044
头孢匹林	0.09584	0.1982	0.1102	48.43	0.3660	0.007558
头孢克肟	0.1163	0.1264	0.1623	47.89	0.6895	0.01440
头孢唑啉	0.04322	0.0470	0.02242	51.25	0.6982	0.01362
头孢哌酮	0.1158	0.0916	0.1609	54.85	0.9658	0.01761

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表 6 标准溶液配制过程中引入的合成不确定度

Table 6 Combined uncertainties resulting from the preparation of standard solution

待测化合物	u_rel（p）	u_rel（m）	u_rel（V）_标液	u_rel（T）	u_rel（c'）	u_rel（C）
头孢氨苄	0.01155	0.005774	0.07617	0.004683	0.01129	0.07822
头孢拉定	0.01732	0.005774	0.07617	0.004683	0.008428	0.07892
头孢地尼	0.02887	0.005774	0.07617	0.004683	0.01044	0.08246
头孢匹林	0.01732	0.005774	0.07617	0.004683	0.007558	0.07883
头孢克肟	0.01155	0.005774	0.07617	0.004683	0.01440	0.07873
头孢唑啉	0.01732	0.005774	0.07617	0.004683	0.01362	0.07964
头孢哌酮	0.01155	0.005774	0.07617	0.004683	0.01761	0.07938

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表 7 头孢菌素的回收率和相对不确定度

Table 7 Recoveries of cephalosporins and relative uncertainties

化合物名称	$\overline {\rm{R}}$ （%）	${\rm{S}}（\overline {\rm{R} } ）$ （%）	u_rel（R）	t值	P	u_rel（S）
头孢氨苄	105.45	6.13	0.02372	2.296	不显著	0.03358
头孢拉定	104.09	7.78	0.03052	1.338	不显著	0.03869
头孢地尼	96.41	8.94	0.03787	0.948	不显著	0.04471
头孢匹林	94.98	7.16	0.03078	1.630	不显著	0.03889
头孢克肟	91.68	10.33	0.04599	1.809	不显著	0.05177
头孢唑啉	103.07	7.84	0.03104	0.988	不显著	0.03910
头孢哌酮	97.01	8.48	0.03567	0.837	不显著	0.04287

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表 8 鸡肉中头孢菌素的相对不确定度来源表

Table 8 List of relative uncertainties for determination of cephalosporins in chicken

化合物名称	配制标准溶液 u_rel（C）	样品前处理 u_rel（S）	分析仪器 u_rel（E）	合成标准不确定度 u_rel（X）	试样中头孢菌素的含量 X（μg/kg）	扩展不确定度 U（μg/kg）
头孢氨苄	0.07822	0.03358	0.0250	0.08872	258.27	45.83
头孢拉定	0.07892	0.03869	0.0250	0.09138	261.43	47.78
头孢地尼	0.08246	0.04471	0.0250	0.09708	253.15	49.15
头孢匹林	0.07883	0.03889	0.0250	0.09139	238.57	43.60
头孢克肟	0.07873	0.05177	0.0250	0.09749	234.75	45.77
头孢唑啉	0.07964	0.03910	0.0250	0.09218	253.71	46.77
头孢哌酮	0.07938	0.04287	0.0250	0.09362	267.56	50.10

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施引文献(4)

期刊类型引用(3)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
1.2.2 磁性分子印迹材料的制备
1.2.3 样品净化
1.2.4 仪器分析条件
1.3 建立数学模型
2. 结果与分析
2.1 不确定度的主要来源
2.2 标准溶液配制过程引入的不确定度
2.2.1 标准物质纯度的不确定度
2.2.2 称量标准物质引入的不确定度
2.2.3 稀释标准溶液引入的不确定度
2.2.4 配制标准溶液由温度引入的不确定度
2.2.5 最小二乘法拟合校准曲线的不确定度
2.3 样品净化过程引入的不确定度
2.3.1 称量样品引入的不确定度
2.3.2 添加内标引入的不确定度
2.3.3 样品定容引入的不确定度
2.3.4 重复性引入的不确定度
2.4 分析仪器引入的不确定度
2.5 测量不确定度的评定与报告
2.6 测量鸡肉中头孢菌素的不确定度来源分析
3. 讨论与结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
1.2.2 磁性分子印迹材料的制备
1.2.3 样品净化
1.2.4 仪器分析条件
1.3 建立数学模型
2. 结果与分析
2.1 不确定度的主要来源
2.2 标准溶液配制过程引入的不确定度
2.2.1 标准物质纯度的不确定度
2.2.2 称量标准物质引入的不确定度
2.2.3 稀释标准溶液引入的不确定度
2.2.4 配制标准溶液由温度引入的不确定度
2.2.5 最小二乘法拟合校准曲线的不确定度
2.3 样品净化过程引入的不确定度
2.3.1 称量样品引入的不确定度
2.3.2 添加内标引入的不确定度
2.3.3 样品定容引入的不确定度
2.3.4 重复性引入的不确定度
2.4 分析仪器引入的不确定度
2.5 测量不确定度的评定与报告
2.6 测量鸡肉中头孢菌素的不确定度来源分析
3. 讨论与结论

参考文献(30)

施引文献

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高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定鸡肉中头孢菌素的不确定度评定

作者简介: 徐幸（1983−），女，博士，高级工程师，研究方向：食品质量安全检测，E-mail：xuxing1983@163.com

计量

出版历程

Evaluation of Uncertainty in Determination of Cephalosporins in Chicken by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Isotope Internal Standard Method

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

1.2.2 磁性分子印迹材料的制备

1.2.3 样品净化

1.2.4 仪器分析条件

1.3 建立数学模型

2. 结果与分析

2.1 不确定度的主要来源

2.2 标准溶液配制过程引入的不确定度

2.2.1 标准物质纯度的不确定度

2.2.2 称量标准物质引入的不确定度

2.2.3 稀释标准溶液引入的不确定度

2.2.4 配制标准溶液由温度引入的不确定度

2.2.5 最小二乘法拟合校准曲线的不确定度

2.3 样品净化过程引入的不确定度

2.3.1 称量样品引入的不确定度

2.3.2 添加内标引入的不确定度

2.3.3 样品定容引入的不确定度

2.3.4 重复性引入的不确定度

2.4 分析仪器引入的不确定度

2.5 测量不确定度的评定与报告

2.6 测量鸡肉中头孢菌素的不确定度来源分析

3. 讨论与结论

期刊类型引用(3)

其他类型引用(1)

计量

出版历程

目录

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

1.2.2 磁性分子印迹材料的制备

1.2.3 样品净化

1.2.4 仪器分析条件

1.3 建立数学模型

2. 结果与分析

2.1 不确定度的主要来源

2.2 标准溶液配制过程引入的不确定度

2.2.1 标准物质纯度的不确定度

2.2.2 称量标准物质引入的不确定度

2.2.3 稀释标准溶液引入的不确定度

2.2.4 配制标准溶液由温度引入的不确定度

2.2.5 最小二乘法拟合校准曲线的不确定度

2.3 样品净化过程引入的不确定度

2.3.1 称量样品引入的不确定度

2.3.2 添加内标引入的不确定度

2.3.3 样品定容引入的不确定度

2.3.4 重复性引入的不确定度

2.4 分析仪器引入的不确定度

2.5 测量不确定度的评定与报告

2.6 测量鸡肉中头孢菌素的不确定度来源分析

3. 讨论与结论

作者简介:
徐幸（1983−），女，博士，高级工程师，研究方向：食品质量安全检测，E-mail：xuxing1983@163.com