Effect of Insoluble Okara Fiber on the Properties of Okara Protein Emulsion
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摘要: 本文探究不溶性豆渣纤维（IOF）对豆渣蛋白（SOP）乳液性能的影响。以葵花籽油为油相，研究不同浓度的IOF（0.25 wt%、0.50 wt%、0.75 wt%和1.00 wt%）对SOP乳液微观结构、界面活性、乳化性和稳定性的影响。结果表明：随着IOF浓度的升高，SOP/IOF乳液的粒径呈现逐渐升高的趋势，激光共聚焦表明乳液液滴变化呈现相同趋势，ζ-电位绝对值呈现升高趋势，界面蛋白含量和浓度呈现增大趋势，流变指标的变化表明剪切稀化的趋势在加强，且高浓度的IOF能显著增强SOP乳液的长期储存稳定性、耐酸稳定性及耐盐稳定性，这为IOF在蛋白乳液凝胶体系中的进一步应用提供了理论基础。Abstract: This article explored the effect of insoluble okara fiber (IOF) on the properties of okara protein (SOP) emulsion. The effects of different concentrations of IOF (0.25 wt%, 0.50 wt%, 0.75 wt% and 1.00 wt%) on the microstructure, interfacial activity, emulsifying activity and stability of SOP emulsion were studied with sunflower oil as oil phase. The results showed that with the increase of the IOF concentration, the particle size of the SOP/IOF emulsion showed a trend of gradual increase. The laser confocal microscope observation experiment showed that the emulsion droplets change in the same trend, and the absolute value of the zeta potential presents an increasing trend. The content and concentration of interfacial protein showed an increasing trend, and the change of rheological index showed that the trend of shear thinning was increasing, and high concentration of IOF could significantly enhance the long-term storage stability, acid resistance stability and salt resistance stability of SOP emulsion. This provides a theoretical basis for the further application of IOF in the protein emulsion gel system.
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Keywords:
- insoluble okara fiber /
- okara protein /
- emulsifying properties /
- emulsion stability
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大豆作为世界上最主要的植物蛋白及植物油脂来源[1]，每加工1吨大豆就会产生3~4吨的湿豆渣[2]。干燥的豆渣中含有豆渣蛋白（SOP）（15.2%~33.4%）、豆渣纤维（IOF）（42.4%~58.1%）、钙和钾等[3]，具有极高的营养价值和潜在的经济价值[4]。但是由于豆渣的口感不佳、加工特性差及不易存放，大量的豆渣作为废弃物倾倒或者低价销售给养殖户做家畜饲料，造成了资源的浪费[5]。与大豆分离蛋白（SPI）相比，豆渣蛋白含有更多的游离巯基及二硫键[6]。豆渣纤维则具有良好的持水性、膨胀性、热稳定性及抗氧化性等[7-8]。因此，开发豆渣蛋白和豆渣膳食纤维具有较大的意义。
相比SPI，豆渣蛋白具有成本低、产量大的优势，但其乳化性较弱，限制了在食品、医药等领域的应用。目前的研究通过物理、化学和酶改性等多种方法来改善SOP的乳化性能[9-11]。其中蛋白质与多糖之间的相互作用受到了广泛的关注。研究表明，在蛋白-多糖的复合乳液体系中，蛋白分子和多糖分子能通过增强分子间的相互作用（范德华力、疏水键以及氢键等），从而改善乳液的稳定性[12-13]。同时，复合乳液通常也比单一乳液更能抵抗环境条件的变化[14]。覃定奎[15]对比了刺槐胶等膳食纤维对蛋白包油型乳液的理化性质及消化特性的影响，发现不溶性膳食纤维可以和蛋白进行结合，增强蛋白包油型乳液体系的稳定性，表明不溶性膳食纤维可以通过和界面蛋白结合，改善其乳液体系的稳定性。但是对不溶性膳食纤维对蛋白包油型乳液体系的微观结构和界面特性研究较少。而不溶性IOF是一种在豆渣蛋白、大豆分离蛋白等大豆制品生产过程中残留的产量巨大的副产品[16]，其酸碱稳定性良好，并且在油水界面中表现出良好的乳化性和界面吸附性[17]。
因此，本文通过以葵花籽油为油相，以IOF和SOP为水相，以高压均质为均质方式，从微观结构、界面特性、乳化特性和稳定性等方面，探究了不同浓度的IOF对SOP/IOF复合乳液的功能特性和稳定性的影响，以期为IOF在蛋白乳液凝胶体系中的应用提供了理论基础，拓宽了SOP和IOF作为食品添加剂的应用范围。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
豆渣粉（60.09%的纤维、30.15%的蛋白质、6.80%的水、2.52%的灰分和0.44%的脂肪） 临邑禹王植物蛋白有限公司；葵花籽油（多力葵花籽油） 佳格食品（中国）有限公司；0.22 μm Millipore过滤器、叠氮化钠、尼罗红、尼罗蓝、Florisil分子筛吸附剂 美国默克公司；牛血清白蛋白（≥98%）、盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，均为分析纯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为分析纯。
AL204型分析天平 梅勒特-托利多仪器（上海）有限公司；PHSJ-4A型实验室pH计 中国上海雷磁公司；GL-21M型高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；3-18K型高速冷冻离心机 Sigma公司；85-2型磁力搅拌器 广州仪科实验仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅 金坛市双捷实验仪器厂；FD5-3型冷冻干燥机 美国SIM公司；T25型ULTRA-TURRAX高速均质 德国IKA公司；AH-BASIC Ⅱ型二级高速均质机 加拿大ATS工业公司；Zetasizer Nano ZS型Zeta电位仪 英国马尔文有限公司；Mastersizer 2000型激光粒度分析仪 英国马尔文有限公司；Auto IQ型比表面及孔隙分析仪 美国康塔仪器公司；OCA-25型视频光学接触角测量仪 德国Dataphysics公司；TCS SP8型激光共聚焦显微镜 德国Leica 公司；HAAKE MARS III型模块化流变仪 德国赛默飞公司。
1.2 实验方法
1.2.1 不溶性豆渣纤维（IOF）和豆渣蛋白（SOP）制备
参照文献[18]的方法稍作修改。将50 g豆渣粉与1 L去离子水混合，用1 mol/L的NaOH调节pH至12，并在50 ℃水浴锅中搅拌2 h。以9000 r/min的转速在4 ℃下将悬浮液离心30 min得到沉淀和清液。取沉淀部分用去离子水洗涤两次后悬浮在去离子水中，调pH至7；将其在8000 r/min、4 ℃离心10 min得到沉淀并用去离子水洗涤两次并冻干制得IOF。取清液部分用1 mol/L的HCl调节pH为4.5，将其在9000 r/min、4 ℃下离心30 min得到沉淀并用去离子水洗涤两次并冻干制得SOP。
1.2.2 乳液制备
将SOP以1.00%的浓度溶于去离子水中，并添加不同浓度的IOF（0.25 wt%、0.50 wt%、0.75 wt%和1.00 wt%）作为实验组，以不添加IOF作为对照组。然后室温下搅拌120 min使其充分溶解，调pH为7后，置于4 ℃备用。将样品和葵花籽油以9:1的比例混合，制备出初级乳液，然后使用高速均质机均质2 min，转速为10000 r/min。再用二级高压均质机在40 MPa压力下均质三次，第二个阀门压力设为4 MPa，制成乳液，之后向乳液中加入0.02%的叠氮化钠以抑制微生物并置于4 ℃备用。
1.2.3 ζ-电位测定
参照文献[19]的方法稍作修改。将待测乳液用磷酸盐缓冲溶液（pH7.0，0.01 mol/L）适度稀释后，使用电位仪在25 ℃测量电位，上样量为1 mL，测定温度为25 ℃，温度平衡时间为2 min。
1.2.4 粒径分布测定
参照文献[20]的方法。将样品用去离子水稀释后，使用Mastersizer 2000型激光粒度分析仪对其进行粒径分布测定，乳液液滴折射率为1.46，分散剂折射率为1.33，吸收参数为0.001。
1.2.5 微观结构的测定
参照文献[21]的方法稍作修改。取1 mL样品乳液于试管中，加入40 μL尼罗红染料和40 μL尼罗蓝染料，混匀后避光反应30 min使其充分染色，然后取少量样品于载玻片上，盖上盖玻片后分别在488和552 nm激发波长下进行激光共聚焦扫描，采集并保存图像。
1.2.6 界面张力测定
使用OCA-25视频光学接触角测量仪检测系统，测定了乳液吸附在油-水界面上的界面张力（γ）随吸附时间（t）的变化。
实验前，为了避免购买的葵花籽油中的杂质影响实验的精确度，向100 mL葵花籽油中加入3 g的Florisil分子筛吸附剂，搅拌静置和离心处理后，再加入新的吸附剂，重复三次，直到葵花籽油与去离子水的界面张力在30 min内保持恒定值即可备用。
实验时，将连接在毛细管上的不锈钢针插入含有纯化葵花籽油的光学玻璃试管中，在针尖上形成20 μL的液滴。CCD视频摄像系统立即开始连续地采集液滴外形图象，检测界面张力（γ）随吸附时间（t）的变化，测试时间持续3 h，温度保持在室温（25 ℃）。每个样品重复进行3次测定，测定结果的误差控制在0.5 mN/m。利用系统软件SCA23自动计算出界面张力γ（精确至0.01 mN/m）。
1.2.7 界面蛋白吸附量
参照文献[22]的方法稍作修改。取适量刚制成的乳液在10000×g，4 ℃下离心30 min。将上层的乳析层去除后使用注射器小心地取出底部的清液并通过0.22 μm过滤器过滤。以牛血清白蛋白（BSA）为标准，采用Lowry法[23]分析乳液和清液中的蛋白质含量。分别用式（1）和式（2）计算界面蛋白质含量（PA，%）和浓度（Γ，mg/m2）：
PA(%)=Ctotal−CserumCtotal×100 (1) Γ(mg/m2)=Ctotal−CserumSSA (2) 式中：Ctotal为新鲜乳液的总蛋白质含量，mg/mL；Cserum为清液中的蛋白质含量，mg/mL；SSA为使用比表面及孔隙分析仪测量的比表面积，m2/g。
1.2.8 流动特性测量
使用哈克流变仪在25 ℃下测量乳液表观黏度。取适量体积的乳液加入到流变仪感应板上，在平板直径40 mm、角度1°、剪切速率0～100 s−1、取点数100的条件下，采用流变仪测定其流变学曲线，并利用Sisko模型进行拟合其流变学曲线，具体如下：
τ=τ0+K˙γn (3) 式中，τ为表观黏度，Pa·s；τ0为初始表观黏度，Pa·s；K为稠度指数；
˙γ 为剪切速率，s−1；n为流动行为指数。1.2.9 振荡流变特性测量
使用哈克流变仪在25 ℃下测量乳液在不同频率（0.01~1 Hz）下的储能模量G'（Pa）和损耗模量G''（Pa）。所用配件为P60 TiL平行板，间距1 mm。在频率扫描之前，通过对pH7的乳液在1 Hz下，在0.001到10 Pa的应力范围内的振幅扫描实验确定乳液的线性粘弹区（LVR）。正式测定时设定参数如下：恒定应力0.01 Pa，频率扫描范围0.01~1 Hz。损耗角正切（tanδ）由式（4）计算：
tanδ=G″G′ (4) 1.2.10 乳化性
参照文献[24]的方法稍作修改。取20 μL乳液加入到3 mL 0.1%的SDS溶液中充分混匀，在500 nm波长处测定吸光度A。乳化性（EAI）计算公式如式（5）所示：
EAI=2×2.303×ANρφ×10000 (5) 式中，EAI为乳化性，m2/g；N为稀释倍数（150）；ρ为乳液形成前蛋白质水溶液中蛋白质质量浓度，g/mL；φ为乳化液中油相体积分数，%；A为0 min时的吸光度。
1.2.11 乳液稳定性
1.2.11.1 储藏稳定性
将制备的乳液于25 ℃密封储藏30 d，在第0、7、15、30 d取样，测乳液的平均粒径、ζ-电位。用式（6）计算∆30-0：
Δ30−0(%)=D1−D2D2×100 (6) 式中：D1为第30 d的粒径；D2为第0 d的粒径。
1.2.11.2 耐酸稳定性
考虑在饮料中的应用，参照文献[25]的方法稍作修改。将1.2.2中制备的乳液调节至pH为5.0，静置2 h后测定乳液的ζ电位和粒径。
1.2.11.3 盐离子浓度稳定性
参照文献[25]的方法稍作修改。向1.2.2中制备的乳液中添加0.1 mol/L NaCl，静置2 h后测定乳液的ζ电位和粒径。
1.3 数据处理
所有的实验进行 3 次试验取平均值，利用 SPSS Statistics 22 软件对数据进行 ANOVA 差异显著性分析，P<0.05 为显著性差异。采用 Origin9.1 软件、 OMNIC 软件包等进行数据分析、图表处理及图谱分析处理。
2. 结果与分析
2.1 IOF对SOP乳液粒径和ζ-电位的影响
IOF浓度对SOP乳液粒径和ζ-电位的影响见表1。
表 1 IOF浓度对SOP乳液粒径和ζ-电位的影响Table 1. The effect of IOF concentration on the particle size and ζ-potential of SOP emulsion由表1可知，未添加IOF的SOP乳液粒径最小为4.81 μm，ζ-电位为−35.2 mV，表明了未添加IOF的乳液液滴带负电荷，具有一定的静电排斥力维持乳液稳定。随着IOF的添加量的增大，SOP乳液的平均粒径和ζ-电位绝对值呈现逐渐升高的趋势。这表明IOF对SOP乳液的电位和粒径均具有显著影响（P<0.05）。这是因为IOF能够和SOP中带正电荷的区域发生静电吸引进而通过分子间相互作用形成大粒径的复合物，导致其乳液粒径增加；同时IOF带有的-COO−阴离子可以和SOP分子上的正电基团通过疏水作用或者氢键作用结合，促使形成的乳液界面膜的带电荷数量增加，导致其乳液电位的降低。而且IOF含量的升高也会导致存在于连续相中未吸附的纤维分子增多，形成相互交联的带电块状物质，引起乳液粒径的升高和ζ-电位的降低[26-27]。周海媚[28]的研究表明适当浓度的不溶性膳食纤维可以促使乳滴液滴表面形成更为致密和厚度的界面膜，引起乳滴粒径的增大和ζ-电位的降低。但当IOF的添加浓度超过0.25 wt%后，乳液粒径显著上升（P<0.05）。这可能是IOF添加量过高导致部分IOF无法与SOP充分结合，引起排空效应和消耗絮凝作用，导致乳液形成聚集和解体，并且过多的IOF也会阻碍均质过程中蛋白和油滴分子的移动和在油水界面处的舒张吸附，降低均质效率，从而导致乳滴粒径变大[29]。
2.2 IOF对SOP乳液微观结构的影响
IOF浓度对SOP乳液微观结构的影响见图1。
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图 1 IOF对SOP乳液微观结构的影响注：IOF添加量：A：0；B：0.25 wt%；C：0.50 wt%；D：0.75 wt%；E：1.00 wt%。Figure 1. The effect of IOF concentration on the microstructure of SOP emulsion激光共聚焦（CLSM）图像中红色荧光代表油滴，绿色荧光代表蛋白质。由图1可知，未添加IOF的SOP乳液颗粒分布均匀，蛋白可均匀的包裹在油脂表面形成均匀的乳液。当IOF添加量为0.25 wt%时，SOP乳液的液滴粒径变大，且蛋白界面膜变厚。这表明低浓度的IOF添加可以促进IOF和SOP共同在油滴界面形成致密的包裹层，界面膜的厚度升高，增强了液滴间的空间位阻斥力，进而改善SOP蛋白乳化特性和阻碍液滴间的聚合[30]。但是随着IOF添加量的升高，乳液液滴出现明显的聚集现象，且IOF添加量越高，聚集现象越明显，这可能是由于存在于连续相中未被界面吸附的IOF分子间发生相互交联诱导而导致的絮凝现象[26]。向飞等[31]的研究表明随着魔芋葡甘聚糖添加量增加，分子链间的凝聚缠结的强度与密度不断加强，形成非常紧密的局部网络状的结构，导致分子形成较大的聚集态。研究表明，高分子聚合物也会导致乳液体系发生排空效应诱导聚集现象[32]。当在乳液体系中能和蛋白有效结合插入油脂内部的IOF浓度达到饱和后，继续增大溶液体系的IOF浓度，会导致界面和溶液体系间的IOF总体浓度存在差异产生渗透差压力。当渗透差压力大于乳滴间的斥力时就会发生乳滴絮凝和聚集现象。
2.3 界面张力
IOF浓度对SOP乳液界面张力的影响见图2。
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图 2 IOF浓度对SOP乳液界面张力的影响Figure 2. The effect of different concentrations of IOF on the interfacial tension of SOP emulsion界面张力是表征油水界面中表面活性物质吸附和解析动力学性质的重要指标。由图2所示，同一时间，IOF浓度越高的乳液，界面张力越低；所有乳液的界面张力均随着吸附时间的延长呈现逐渐降低的趋势，且在吸附初期（0~900 s）界面张力急剧下降，随后下降速度逐渐趋于平缓；低浓度（0.25～0.75 wt%）IOF的复合乳液的界面张力整体变化趋势较为接近，但随着吸附时间的增加，含有1.00 wt% IOF的复合乳液的界面张力也逐渐接近添加了低浓度IOF的复合乳液。乳液界面形成一般都经历蛋白质逐步扩散至油滴表面构成次级界面区域，然后到达次级界面区域的蛋白分子发生部分柔性化结构展开导致界面张力下降，最后吸附在界面层的蛋白质分子发生结构重排的过程，因此界面流动性质的变化极大程度的影响乳液稳定性和乳化过程。动态界面张力是由缓冲液的界面张力减去蛋白的界面张力进行表示的，随着吸附时间的延长，界面张力逐渐减小，表明蛋白质逐渐吸附到油水界面。佟臻等[27]的研究表明膳食纤维添加量的适度升高，会导致乳液界面张力下降的速率逐渐升高，从而影响乳液的界面吸附速率。研究表明，乳液界面吸附特性受蛋白表面疏水性和粒径大小的影响，而IOF会和SOP相互结合会降低界面的吸附能，吸引更多分子在界面上，并且明显提高IOF和SOP复合体系的表面疏水性，进而加速蛋白质对油水界面的吸附，导致界面张力下降趋势加剧[33]；而IOF添加量会显著提高粒径大小，大粒径的IOF和SOP产生的空间位阻会在一定程度上降低疏水性提高导致的吸附速率的增加。因此，低浓度（0.25～0.75 wt%）IOF的复合乳液的界面张力整体变化趋势较为接近。
2.4 界面蛋白含量（PA）和浓度（Γ）
IOF浓度对SOP乳液界面蛋白含量和浓度的影响见表2。
表 2 IOF浓度对SOP乳液界面蛋白含量和浓度的影响Table 2. The effect of IOF concentration on the protein content and concentration of SOP emulsion interfaceIOF浓度（wt%） 界面蛋白含量（PA，%） 界面蛋白浓度（Γ，mg/m2） 0 34.211±0.106d 0.127±0.002c 0.25 38.153±0.062c 0.131±0.003c 0.50 41.785±0.099b 0.169±0.003a 0.75 42.062±0.150b 0.174±0.004a 1.00 46.566±0.271a 0.151±0.009b 界面蛋白含量（PA）是指吸附到乳滴表面上蛋白质含量和连续相蛋白质含量的百分比，而界面蛋白浓度（Γ）表示乳滴表面单位面积上的蛋白质含量。乳液的乳化过程中，界面蛋白质会迅速从连续相吸附到新形成的小油滴表面上，阻止油滴间重新聚结，保持乳液稳定。界面蛋白质含量（PA）和界面蛋白质浓度（Γ）是表征乳液稳定性的重要指标。由表2可知，随着IOF浓度的升高，界面蛋白含量呈现升高趋势，界面蛋白浓度呈现先升高后降低的趋势。在乳液体系中，IOF和SOP经过高压均质机混合均质的瞬间，IOF和SOP之间的热力学不兼容性会促进SOP在油水界面上的吸附厚度甚至形成多层界面膜的结构，且随着IOF的添加SOP和IOF间的相互作用力逐渐增强，促进了蛋白质在液滴表面的吸附[34]，因此，随着IOF浓度的升高，界面蛋白含量逐渐增加。当IOF浓度由0升高至0.25 wt%时，界面蛋白含量显著升高（P<0.05），界面蛋白浓度却差异不显著（P>0.05）。界面蛋白浓度与界面蛋白含量和乳液比表面积的比值呈正相关，随着IOF浓度的升高，界面蛋白含量增大，并且粒径和激光共聚焦的结果表明，乳液的比表面积也逐渐增大，因此两者的比值变化不显著，从而导致界面蛋白浓度呈现不显著的升高趋势[33]。而当IOF的浓度由0.50 wt%升高至0.75 wt%时，界面蛋白含量和界面蛋白浓度均差异不显著（P>0.05），继续升高至1.00%时，界面蛋白含量显著升高但界面蛋白浓度却呈现显著下降趋势（P<0.05）。这可能是因为IOF浓度由0.50 wt%升高至0.75 wt%时，界面蛋白竞争吸附行为达到动态平衡。但继续升高IOF浓度会引起乳液体系中生成较大结构和粒径的絮凝乳滴且该乳滴在稀释过程中不被破坏[25]。而比表面仪测定乳滴的比表面积是基于将絮凝体假设作为球形颗粒得到的理论比表面积，而不是绝对真实的比表面积。在此前提下，随着IOF浓度升高，絮凝结构体越大，所得的理论比表面积逐渐升高，因此得到的界面蛋白浓度呈现下降趋势。
2.5 流变特性
IOF浓度对SOP乳液表观粘度随剪切速率的变化见图3。IOF浓度对SOP乳液流动行为的影响见表3。
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图 3 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液的表观粘度的影响Figure 3. The effect of different concentrations of IOF on the apparent viscosity of SOP/IOF composite emulsion表 3 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液的流动行为的影响Table 3. The effect of different concentrations of IOF on the flow behavior of SOP/IOF composite emulsionIOF浓度
（wt%）初始表观黏度
（Pa·s）稠度指数
（Pa.sn）流动行为指数 R2 0 3.681±0.940d 2.734±0.619c 0.9784±0.0163a 0.9989 0.25 4.033±0.974d 2.885±0.794c 0.9715±0.0311a 0.9996 0.50 9.917±1.048c 4.967±1.538bc 0.8515±0.0702b 0.9993 0.75 16.004±1.411b 10.154±3.192b 0.8374±0.0386b 0.9975 1.00 30.405±3.827a 37.848±7.166a 0.5635±0.0794c 0.9967 由图3可知，在剪切速率范围（0.001~100 s−1）内，所有样品的表观粘度均随剪切速率的增大而减小，并呈现剪切稀化行为；在同一剪切速率下，SOP/IOF复合乳液的表观粘度随着IOF浓度的增加而升高，但IOF含量为0.25 wt%的复合乳液的表观粘度与SOP乳液极为接近。乳液所呈现出的剪切变稀行为的原因可能是乳液界面中的蛋白质分子之间发生相互吸引所形成的网状结构所造成的[35]。对表观粘度曲线进行Herschel-Bulkley模型拟合，表征乳液的流变参数（初始表观黏度，稠度指数，流动行为指数）与IOF添加量之间的关系。由表3可知，拟合后方程R2均大于0.99，证明模型选取正确，可用于后续分析。随IOF添加量的增加，初始表观黏度（τ0）和稠度指数（K）均呈现升高趋势。这表明IOF参与了蛋白形成空间屏障结构，进而影响乳液的流变特性。随IOF添加量的增加，流动行为指数（n）则均小于1且呈现降低的趋势。这表明随着IOF浓度的增加，乳液的剪切稀化程度加剧。龙肇[36]研究表明，IOF可以通过参与乳液的界面组分重组构建三维网状结构。当低浓度的IOF添入到乳液制备体系中，IOF会通过交互作用和SOP发生交联反应，进而增加界面膜上的SOP和IOF的含量，形成更为紧密的三维网状结构和界面膜结构，从而导致表观粘度的升高，但因低浓度的IOF并不会引起乳液液滴发生絮凝现象，对乳液的流动限制性小，升高速率较慢。随着IOF的添加量逐渐升高，乳液液滴出现絮凝现象，生成较大的絮凝液滴和出现聚集现象，剪切稀化程度加剧，而较大的乳液液滴则需要更大的外界剪切应力才能发生剪切流变行为，导致表观粘度升高速率明显增加。
2.6 粘弹性
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图 4 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液G′的影响Figure 4. The effect of different concentrations of IOF on the storage modulus of SOP/IOF composite emulsion![]()
图 5 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液G′′的影响Figure 5. The effect of different concentrations of IOF on the loss modulus of SOP/IOF composite emulsion![]()
图 6 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液 tanδ的影响Figure 6. The effect of different concentrations of IOF on the loss tangent of SOP/IOF composite emulsion当物体发生形变时，其内部会产生一定的应力，这种力可以作为衡量样品弹性的指标，称为储能模量或弹性模量（G′），而物体内部损失的一部分力可以衡量样品的粘性，称为损耗模量或粘性模量（G′′）[37]。G′′和G′的比值称为损耗角正切（tanδ），可以表明样品的黏弹性[38]。图4、图5和图6分别展示了不同IOF浓度下各个复合乳液的G′、G′′以及tanδ的频率扫描结果。
由图4可知，G′整体基本呈现随频率的增大而增大的趋势，且在同一频率时，IOF添加量越大的复合乳液的G′值越高。从图6中可以看出，添加0~0.25 wt%
IOF的乳液，tanδ有超过1的情况且基本上随着频率的增加而增加；添加0.50 wt% IOF的乳液，tanδ虽然随频率的增加基本也呈现上升趋势，但是tanδ一直小于1；而添加0.50~1.00 wt% IOF的乳液，tanδ则一直小于1且随频率的增加略有下降。这是因为未被吸收的IOF在连续相中形成凝胶状结构，IOF可以促进乳液的弹性结构[39]。当tanδ出现超过1的情况，则说明G′和G′′之间存在一个交叉点，证明了乳液中纠缠网络的形成[40]。当tanδ一直小于1，则说明乳液中的弹性行为占主导地位，可将其归类为弱凝胶行为。这种明显的粘弹性行为可能是由于絮凝液滴和凝胶状网络的形成而导致的[41]。 2.7 乳化性
EAI表示蛋白质在油水混合过程中吸附在油滴界面降低其界面张力，起到乳化作用的性质，它主要是由蛋白质分子链内部分布的亲水或疏水基团所决定的[42]。图7为添加不同浓度的IOF后的SOP/IOF复合乳液（pH7）的乳化性。
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图 7 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液乳化性的影响注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 7. The effect of different concentrations of IOF on emulsifying activity of SOP/IOF composite emulsion如图7所示，随着IOF添加量的增加，EAI呈现显著增高的趋势（P<0.05）。当乳液中不含IOF时，EAI最低（36.9 m2/g）。加入0.25 wt%的IOF后，EAI有大幅度的升高（43.4 m2/g），之后EAI随着IOF添加量的增加而缓慢上升到最大值（47.5 m2/g）。这可能是因为IOF中含有丰富的亲水链，SOP与IOF形成的复合物分子中也会含有亲水链，进而影响了复合乳液的EAI[24]。之后由于IOF添加量的增加导致了复合乳液的粒径因SOP/IOF复合分子的形成以及絮凝作用而增加，从而导致EAI增长的速率放缓。
2.8 储存稳定性
IOF浓度对SOP乳液储藏稳定性的影响见表4。
表 4 IOF浓度对SOP乳液储藏稳定性的影响Table 4. The effect of IOF concentration on the storage stability of SOP emulsionIOF浓度
（wt%）乳液平均粒径（μm） 0 d 7 d 15 d 30 d ∆30-0（%） 0 4.81±0.19Ed 5.96±0.04Ec 8.13±0.04Eb 11.49±0.15Ea 138.82 0.25 6.34±0.21Dd 9.51±0.18Dc 11.08±0.19Db 12.64±0.11Da 99.37 0.50 13.98±0.45Cd 15.71±0.63Cc 18.69±0.52Cb 22.09±0.46Ca 58.03 0.75 18.49±0.72Bd 19.3±0.31Bc 21.74±0.44Bb 23.38±0.35Ba 26.43 1.00 26.09±0.82Ad 26.49±0.39Ac 26.90±0.06Ab 28.58±0.27Aa 9.56 注：同列不同大写字母表示有显著性（P<0.05）；同行不同小写字母表示有显著性（P<0.05）。 由表4可知，随着乳液储藏时间的延长，乳液的平均粒径均呈现逐渐增大的趋势。这表明在乳液储藏过程中会发生界面蛋白质的重排和油滴间的相互聚集导致乳液粒径升高。随着IOF的添加量升高，乳液△30-0的值逐渐降低，表明添加IOF可以明显提高SOP乳液的稳定性。卢薇等[43]的研究表明低浓度IOF的添加量可以通过促进和SOP发生交联反应形成较厚的界面膜结构和弱凝胶网状结构，明显提升乳液的分子间斥力、粘弹性和弱凝胶行为，进而提升乳液的储藏稳定性。而高浓度的IOF会导致△30-0变化较小的原因可能在于高浓度IOF会导致乳液已经出现了严重的絮凝结构和聚集现象，而粒径越大的粒子需要更大的解析能才能促使蛋白脱离界面，同时高浓度IOF会引起乳液粘性能力的增大，从而增强了乳液的聚结稳定性和导致后期粒径变化较小[44]。这和IOF浓度对SOP/IOF复合乳液流变性能的影响结果相一致。这表明在长期贮存过程中，适当添加一定浓度的IOF能有效提高复合乳液的稳定性。
2.9 耐酸稳定性及耐盐稳定性
IOF浓度对SOP乳液耐酸稳定性及耐盐稳定性的影响见表5。
表 5 不同IOF浓度下pH和盐离子对SOP乳液的ζ-电位和平均粒径的影响Table 5. The effect of pH and salt ions on the ζ-potential and average particle size of SOP emulsion under IOF concentrationIOF浓度（wt%） 乳液电位（mV） 乳液平均粒径（μm） pH=7 pH=5 pH=7+
0.1 mol/L NaClpH=7 pH=5 pH=7+
0.1 mol/L NaCl0 −35.2±0.3eA −23.9±0.3eC −30.7±0.2aB 4.81±0.19eE 17.62±0.24dD 5.02±0.45eE 0.25 −40.2±0.2dA −24.8±0.1dC −29.3±0.6bB 6.34±0.21dE 21.93±0.13cD 6.62±0.53dE 0.5 −42.0±0.2cA −26.0±0.5cD −29.0±0.4bB 13.98±0.45cF 27.34±0.51bC 15.27±0.75cE 0.75 −43.3±0.3bA −27.1±0.1bD −28.5±0.3bC 18.49±0.72bF 32.84±0.50aB 19.84±0.18bE 1 −43.9±0.2aA −28.3±0.4aC −28.9±0.4bC 26.09±0.82aD 33.28±0.22aB 28.41±0.36aC 注：同行不同大写字母表示有显著性（P<0.05）；同列不同小写字母表示有显著性（P<0.05）。 由表5可知，乳液的pH由中性转为酸性时，ζ电位和粒径大小显著升高（P<0.05），但随着IOF添加量的升高，SOP乳液的粒径增加速度显著放缓（P<0.05），这表明酸性环境对乳液稳定性具有负面作用。陈冬等[45]的研究表明不溶性膳食纤维的添加可以有效增强乳液的耐酸稳定性，这是因为随着pH逐渐接近蛋白质的等电点，ζ电位升高，乳液液滴间的静电斥力降低，促进了乳液中粒子的聚集，发生了絮凝聚集。而IOF的-COO−阴离子与SOP分子上的正电基团相结合并增强SOP乳液液滴的带电荷数量，有助于在连续相中形成更为紧密的三维凝胶网状结构和界面膜，从而增加乳滴间的静电斥力和空间斥力，增强了SOP乳液的耐酸稳定性。
同时可以看到，加入盐离子后乳液的ζ电位显著升高（P<0.05），粒径却没有大幅度的增加。而且添加了NaCl的乳液ζ电位并没有随着IOF添加量的增加而下降，反而在小幅度增加后保持稳定。这可能是由于SOP乳液中盐离子的存在导致乳液液滴表面吸附了大量的Na+，这会导致SOP和IOF表面产生电荷屏蔽作用，导致IOF和SOP之间的分子间结合能力变弱，使得ζ电位值上升且基本不受IOF浓度影响[46]。而随着ζ电位的升高，乳液液滴间的静电斥力降低，所以粒径均有所上升。
3. 结论
利用动态光散射和激光共聚焦显微镜从宏观角度评价IOF添加量对SOP乳液粒径大小及乳滴分布的影响。添加IOF后，SOP乳液粒径增大，葵花籽油能够被包埋且均匀分布在乳液体系中（IOF添加量为0.25 wt%），这与乳化性的变化规律相一致。采用ζ电位分析、稳定性分析等方法从不同角度评价了乳液的稳定性。IOF添加量为1.00 wt%时可以大幅度增强乳液的长期储存稳定性（>15 d）、耐酸稳定性以及耐盐稳定性。通过对乳液的界面性质及流变特性的研究可知，IOF添加量为1.00 wt%时可以有效提升乳液的弹性。结合其能够大幅度增强乳液的稳定性这一性质，可为SOP和IOF在蛋白乳液凝胶体系中的应用提供了理论基础，拓宽其作为食品添加剂的应用范围。
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图 1 IOF对SOP乳液微观结构的影响
注：IOF添加量：A：0；B：0.25 wt%；C：0.50 wt%；D：0.75 wt%；E：1.00 wt%。
Figure 1. The effect of IOF concentration on the microstructure of SOP emulsion
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图 2 IOF浓度对SOP乳液界面张力的影响
Figure 2. The effect of different concentrations of IOF on the interfacial tension of SOP emulsion
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图 3 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液的表观粘度的影响
Figure 3. The effect of different concentrations of IOF on the apparent viscosity of SOP/IOF composite emulsion
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图 4 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液G′的影响
Figure 4. The effect of different concentrations of IOF on the storage modulus of SOP/IOF composite emulsion
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图 5 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液G′′的影响
Figure 5. The effect of different concentrations of IOF on the loss modulus of SOP/IOF composite emulsion
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图 6 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液 tanδ的影响
Figure 6. The effect of different concentrations of IOF on the loss tangent of SOP/IOF composite emulsion
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图 7 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液乳化性的影响
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 7. The effect of different concentrations of IOF on emulsifying activity of SOP/IOF composite emulsion
表 1 IOF浓度对SOP乳液粒径和ζ-电位的影响
Table 1 The effect of IOF concentration on the particle size and ζ-potential of SOP emulsion
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表 2 IOF浓度对SOP乳液界面蛋白含量和浓度的影响
Table 2 The effect of IOF concentration on the protein content and concentration of SOP emulsion interface
IOF浓度（wt%） 界面蛋白含量（PA，%） 界面蛋白浓度（Γ，mg/m2） 0 34.211±0.106d 0.127±0.002c 0.25 38.153±0.062c 0.131±0.003c 0.50 41.785±0.099b 0.169±0.003a 0.75 42.062±0.150b 0.174±0.004a 1.00 46.566±0.271a 0.151±0.009b
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表 3 IOF浓度对SOP/IOF复合乳液的流动行为的影响
Table 3 The effect of different concentrations of IOF on the flow behavior of SOP/IOF composite emulsion
IOF浓度
（wt%）初始表观黏度
（Pa·s）稠度指数
（Pa.sn）流动行为指数 R2 0 3.681±0.940d 2.734±0.619c 0.9784±0.0163a 0.9989 0.25 4.033±0.974d 2.885±0.794c 0.9715±0.0311a 0.9996 0.50 9.917±1.048c 4.967±1.538bc 0.8515±0.0702b 0.9993 0.75 16.004±1.411b 10.154±3.192b 0.8374±0.0386b 0.9975 1.00 30.405±3.827a 37.848±7.166a 0.5635±0.0794c 0.9967
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表 4 IOF浓度对SOP乳液储藏稳定性的影响
Table 4 The effect of IOF concentration on the storage stability of SOP emulsion
IOF浓度
（wt%）乳液平均粒径（μm） 0 d 7 d 15 d 30 d ∆30-0（%） 0 4.81±0.19Ed 5.96±0.04Ec 8.13±0.04Eb 11.49±0.15Ea 138.82 0.25 6.34±0.21Dd 9.51±0.18Dc 11.08±0.19Db 12.64±0.11Da 99.37 0.50 13.98±0.45Cd 15.71±0.63Cc 18.69±0.52Cb 22.09±0.46Ca 58.03 0.75 18.49±0.72Bd 19.3±0.31Bc 21.74±0.44Bb 23.38±0.35Ba 26.43 1.00 26.09±0.82Ad 26.49±0.39Ac 26.90±0.06Ab 28.58±0.27Aa 9.56 注：同列不同大写字母表示有显著性（P<0.05）；同行不同小写字母表示有显著性（P<0.05）。
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表 5 不同IOF浓度下pH和盐离子对SOP乳液的ζ-电位和平均粒径的影响
Table 5 The effect of pH and salt ions on the ζ-potential and average particle size of SOP emulsion under IOF concentration
IOF浓度（wt%） 乳液电位（mV） 乳液平均粒径（μm） pH=7 pH=5 pH=7+
0.1 mol/L NaClpH=7 pH=5 pH=7+
0.1 mol/L NaCl0 −35.2±0.3eA −23.9±0.3eC −30.7±0.2aB 4.81±0.19eE 17.62±0.24dD 5.02±0.45eE 0.25 −40.2±0.2dA −24.8±0.1dC −29.3±0.6bB 6.34±0.21dE 21.93±0.13cD 6.62±0.53dE 0.5 −42.0±0.2cA −26.0±0.5cD −29.0±0.4bB 13.98±0.45cF 27.34±0.51bC 15.27±0.75cE 0.75 −43.3±0.3bA −27.1±0.1bD −28.5±0.3bC 18.49±0.72bF 32.84±0.50aB 19.84±0.18bE 1 −43.9±0.2aA −28.3±0.4aC −28.9±0.4bC 26.09±0.82aD 33.28±0.22aB 28.41±0.36aC 注：同行不同大写字母表示有显著性（P<0.05）；同列不同小写字母表示有显著性（P<0.05）。
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