Analysis of Antioxidant Capacity and Active Components of Huangjiu Fermented with Hovenia dulcis Thunb
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摘要: 采用两步发酵法制备枳椇子黄酒（Huangjiu fermented with Hovenia dulcis Thunb, HFH），检测其理化指标并评价其抗氧化能力。为探究其抗氧化原因，比较了浸泡型和发酵型枳椇子黄酒中总酚、总黄酮含量，并采用高效液相色谱法进一步分析主要活性成分二氢杨梅素和杨梅素的含量差异。结果表明，发酵型枳椇子黄酒属于特型半干黄酒，具有药香，苦味和涩味有所改善，口感更佳。对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基清除能力及还原力分别为0.727、33.60、9.07、0.823 mg VC/mL，均高于普通发酵黄酒。经比较发现发酵型枳椇子黄酒中总酚含量为1120.20 mg/L，显著高于浸泡型（P<0.05），总黄酮含量为217.20 mg/L。发酵型枳椇子黄酒中二氢杨梅素含量为235.66 mg/L，显著高于浸泡型（P<0.05），杨梅素含量为16.12 mg/L。发酵法制备枳椇子黄酒，可以提高黄酒中总酚含量，富集了二氢杨梅素，使其具备良好的抗氧化能力。Abstract: A two-step fermentation method was used to prepare Hovenia dulcis Thunb Huangjiu, its physical and chemical indexes were tested, and its antioxidant capacity was evaluated. To explore the reasons for its antioxidant, the total phenols and total flavonoids in soaked and fermented Hovenia dulcis Thunb Huangjiu were compared, and the differences in the content of the main active ingredients dihydromyricetin and myricetin were further analyzed by high-performance liquid chromatography. The results showed that Huangjiu fermented with Hovenia dulcis Thunb (HFH) belonged to special type semi-dry Huangjiu. It had medicinal aroma, improved bitterness and astringency, and better taste. Its VC milligram equivalents on DPPH, ABTS, OH free radical scavenging ability and reducing power were 0.727, 33.60, 9.07 and 0.823 mg VC/mL, which were higher than those of Huangjiu. After comparison, it was found that the total phenol content of HFH was 1120.20 mg/L, which was significantly higher than that of the soaked type (P<0.05), and the total flavonoid content was 217.20 mg/L. The content of dihydromyricetin in HFH was 235.66 mg/L, which was significantly higher than that in the soaked type (P<0.05), and the content of myricetin was 16.12 mg/L. Fermentation increases the content of total phenols in HFH, enriches dihydromyricetin, and makes it possess an outstanding antioxidant capacity.
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Keywords:
- Hovenia dulcis Thunb Huangjiu /
- fermentation /
- soak /
- total phenols /
- dihydromyricetin
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黄酒是以稻米、黍米、小米、玉米、小麦、水等为主要原料，经加曲和/或部分酶制剂、酵母等糖化发酵剂酿制而成的发酵酒，与啤酒、葡萄酒并称为世界三大古酒，是中国的“国酒”之一[1]。如今，消费者对黄酒的品质也提出了更高的要求，主要体现为：风味的优雅与个性、品质的安全与健康、饮后的舒适与愉悦等。近年来，对黄酒的研究重点逐渐转向发酵型保健黄酒的研究与开发[2]，目前这一方面的研究已取得一定的进展，尤其是结合药食同源类中药材制备的保健黄酒，如清爽型银耳黄酒、发酵型黄精糯米黄酒、薏米茯苓黄酒、山楂黍米黄酒、薏米葛根黄酒[3]等，不仅丰富了黄酒的营养和风味，还有助于拓宽黄酒市场。
枳椇子（Hovenia dulcis Thunb），鼠李科枳椇属植物北枳椇和毛果枳椇的成熟种子，为卫生部2002年公布的87种药食两用的药物之一。枳椇子是经典的解酒保肝中药之一，可以通过激活肝脏内的乙醇脱氢酶来加快体内乙醇的代谢速度。一般来说，种子的酚醛含量往往更高，因为它们被用作植物防御机制的次生代谢物，从而保护幼嫩果实使其具有成熟和繁殖能力。有研究表明，枳椇子的抗氧化活性与其丰富的酚类化合物有关，对谷氨酸诱导的HT22细胞神经毒性和急性酒精诱导的小鼠肝损伤均有显著的保护作用[4]。二氢杨梅素和杨梅素被发现是枳椇子中最主要的活性成分，具有多种药理作用，如降压、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎等[5-6]。枳椇子在功能性食品、膳食补充剂或营养品的开发上具有潜在价值，目前在食品中的应用有解酒饮料、枳椇子酸奶[7]等，尚未有枳椇子黄酒的报道。
在黄酒酿造过程中，淀粉被用于产生酒精，枳椇子中类黄酮等生物活性物质也随之溶于酒中[8]。本研究将药食两用的枳椇子和糯米作为主要原料，在原有的黄酒制备工艺中采用分批补料法加入枳椇子粉一起发酵，制备了枳椇子黄酒并研究其活性物质和抗氧化能力，为枳椇子中营养因子的富集和黄酒保健功能的开发提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
糯米、枳椇子、大曲、小曲、沙洲优黄、仙不走、会稽山、女儿红、古越龙山 均为市售；氯化铵（食品级） 河南巧手食品添加剂有限公司；没食子酸、二氢杨梅素、杨梅素、磷酸、DPPH、ABTS、抗坏血酸 均为色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇 优级纯，美国Thermo Fisher Scientific公司；甲醛 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；福林酚 分析纯，上海长哲生物科技有限公司；其他药品 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
10 L不锈钢发酵罐 浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室；36 L恒温发酵桶 毅盛原能酒设备厂；2 L压榨机 苏州金世达工具制造有限公司；EZ28YAS01蒸锅 浙江苏泊尔股份有限公司；111B高速中药粉碎机 瑞安永历制药机械有限公司；FA2004精密电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司；KQ-400KDB超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；酒精测量计 温州市坂口有限公司；MB-150CL恒温培养箱 青岛明博环保科技有限公司；PHS-3C精密酸度计 杭州齐威仪器有限公司；916 Ti-Touch电位滴定仪 瑞士Metrohm公司；SepctraMax iD5多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；E2690液相色谱仪 美国Waters公司。
1.2 实验方法
1.2.1 发酵型枳椇子黄酒的制备
将枳椇子清洗后65 ℃烘干，粉碎，过40目筛。参考葛根黄酒[9]的制备工艺（图1），原料枳椇子与糯米按质量比1:3.3投入，其中，枳椇子粉按微生物生长规律采用分批补料法分两次加入，第一批加总投入量的40%，第二批加总投入量的60%。
操作要点：淘洗糯米5 kg，用无菌水浸泡20 h后投入蒸锅内蒸熟，用无菌水淋饭使糯米快速降温至37 ℃后投入恒温发酵桶中，加入36 g白色小曲和600 g枳椇子粉与米饭搅拌均匀，压紧搭窝，30 ℃发酵3 d。拌入大曲500 g，压紧，30 ℃发酵5 d，每天开耙。大曲中的曲酶为糖化剂，可将淀粉水解为可发酵性糖，供酵母菌利用繁殖。前发酵结束后加入900 g枳椇子粉、1 g氯化铵和5 L无菌水，25 ℃密闭发酵15 d。后发酵结束后，压榨过滤，将酒液灌入陈酿罐中，70 ℃灭菌20 min。
按照上述制备工艺，不加入枳椇子粉，制备普通发酵黄酒，以普通发酵黄酒为对照，分析黄酒酿造过程中枳椇子对其理化指标和抗氧化能力的影响；浸泡型枳椇子黄酒和枳椇子浸泡10.79%乙醇的制备：称取200 g枳椇子粉，分别用1 L黄酒和10.79%乙醇水溶液于25 ℃培养箱中浸泡15 d，用于比较活性物质的对照。选取五种市售黄酒：沙洲优黄（一级）、仙不走（二级）、会稽山（优等品）、女儿红（一等品）、古越龙山（一级），对比分析普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒的感官评价、总酚和总黄酮含量。
1.2.2 理化指标的测定
酒样在10000 r/min离心10 min后，于−20 ℃保存，备用。
1.2.2.1 总糖
采用苯酚-硫酸法测定，测定结果参考GB/T 13662-2018《黄酒》以葡萄糖（g/L）计。
1.2.2.2 非糖固形物
参照GB/T 13662-2018《黄酒》中的方法，采用仲裁法测定。
1.2.2.3 酒精度
参照GB/T 5009.225-2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的方法，用酒精计测定20 ℃时酒样酒精度（%vol）。
1.2.2.4 总酸
参照GB/T 13662-2018《黄酒》中的方法，使用电位滴定仪测定，测定结果以乳酸计（g/L）。
1.2.2.5 氨基酸态氮
测定方法参照GB/T 13662-2018《黄酒》中的方法，使用电位滴定仪测定。
1.2.2.6 pH
使用精密pH计测定。
1.2.2.7 感官分析
参考GB/T 13662-2018《黄酒》和GB/T 33404-2016《白酒感官品评导则》，选取30名食品专业且年龄在20~25岁间的感官评价员，经培训后采用暗评（blind evalutiuon）对市售黄酒会稽山、普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒的色泽、香气、口味、口感进行感官分析，标准如表1所示。
表 1 发酵型枳椇子黄酒感官分析标准Table 1. Sensory analysis criteria of HFH项目 品评标准 分值（分） 8~10 5~7 1~4 色泽
（20%）1.澄清度 澄清透明 较澄清 浑浊 2.颜色 色泽鲜亮，有喜感 棕黄色 黄色 香气
（20%）3.气味 有黄酒特有香味和淡淡的药味 黄酒香味不协调或药味过重 异常气味 4.程度 喜欢，闻着舒心 不反感也不喜欢 反感 口味
（40%）5.苦味 无苦味 苦味很轻，不影响味道 较苦 6.甜味 甜味适中 较甜 甜味很淡 7.涩味 无涩味 涩味较轻，舌头无厚重感 涩味较重，舌头有厚重感 8.鲜味 鲜爽且入口醇香 比较鲜美 酒体淡薄且不够柔和 口感
（20%）9.持久度 悠长 绵长 短暂 10.丰满度 醇厚 平淡 寡淡 1.2.3 抗氧化能力的测定
1.2.3.1 DPPH自由基清除能力
参照PINTEUS等[10]的方法。取1 mL用去离子水稀释成不同倍数的酒样，加入2 mL DPPH-甲醇溶液（0.1 mmol/L）和225 μL Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH7.4），25 ℃水浴30 min，测定A517值。以去离子水为空白对照，以VC作为阳性对照，下同。
式中： A0为空白对照液的吸光度；A1为样品测定管的吸光度；A2为样品本底管的吸光度。
1.2.3.2 ABTS自由基清除能力
参照ARNAO等[11]的方法。取150 μL用PBS缓冲液（5 mmol/L，pH7.4）稀释成不同倍数的酒样，加入2.5 mL ABTS自由基稀释液，30 ℃水浴1 h，测A734值。
式中：A0为空白对照液的吸光度；A1为样品测定管的吸光度；A2为样品本底管的吸光度。
1.2.3.3 羟基自由基清除能力
参照SHI等[12]的方法。将酒样稀释，取1 mL用去离子水稀释成不同倍数的酒样，加入700 μL H2O2溶液（6 mmol/L），300 μL水杨酸钠溶液（20 mmol/L）和1 mL FeSO4溶液（1.5 mmol/L），37 ℃水浴1 h，测定A510值。
式中：A0为空白对照液的吸光度；A1为样品测定管的吸光度；A2为样品本底管的吸光度。
1.2.3.4 还原力的测定
参照TOHIDI等[13]的方法。取1 mL用PBS缓冲液（0.2 mol/L，pH6.6）稀释成不同倍数的酒样，加入1 mL铁氰化钾（0.1 g/L），50 ℃水浴30 min后加1 mL三氯乙酸（1 g/L），振荡混匀，静置10 min。取1 mL上述反应液加入1 mL去离子水和200 μL三氯化铁（0.01 g/L），振荡混匀，测定A700值。
1.2.4 活性物质的测定
1.2.4.1 总酚含量测定
参考LI等[14]的方法，以没食子酸为标准品计算总酚含量。没食子酸标准曲线方程：y=0.005x+0.045，R2=0.999，其中x为质量浓度（mg/L），y为765 nm处的吸光度。
1.2.4.2 总黄酮含量测定：
参考杨小慧等[15]的方法，以芦丁为标准品计算总黄酮含量。芦丁标准曲线y=0.005x−0.010，R2=0.999，其中x为（mg/L），y为510 nm处的吸光度。
1.2.4.3 二氢杨梅素、杨梅素含量测定
色谱条件：色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为30 ℃；流动相A为甲醇，流动相B为0.03%磷酸；流速为0.8 mL/min；进样量为5 μL；检测波长：二氢杨梅素为290 nm，杨梅素为373 nm；洗脱程序如表2所示[16]。
表 2 梯度洗脱程序Table 2. Gradient elution时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0 12 88 25 65 35 30 12 88 40 12 88 分别精密称取二氢杨梅素、杨梅素标准品0.1 g，用甲醇配制成浓度为1 g/L标准品母液，4 ℃保存。测定前用甲醇配制成浓度为50、100、150、200、250、300 mg/L混标溶液，取1 mL上机检测。以标准品质量浓度（x）为横坐标（mg/L），峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。二氢杨梅素标准曲线方程为：y=170463x−1591390，R2=9989；杨梅素标准曲线方程为：y=180503x−88045，R2=9994。取适量酒样，按体积比1:1加入甲醇超声提取（功率300 W，频率45 kHz，40 ℃）30 min，过0.45 μm的滤膜，待测。
1.3 数据处理
所有数据以平均值±标准差形式表示。采用SPSS 26.0软件进行统计分析，采用Duncan’s检验进行多组件显著性分析。采用Graphpad Prism 8软件作图，图表中标注不同字母表示差异显著（P<0.05），不同组分用大小写区分。
2. 结果与分析
2.1 理化指标及感官分析
由表3可知，参照GB/T 13662-2018《黄酒》的分类标准，普通发酵黄酒属于传统型半干黄酒，发酵型枳椇子黄酒属于特型半干黄酒。
表 3 发酵型枳椇子黄酒的理化指标Table 3. Physical and chemical indexes of HFH理化指标 国家标准参考值 普通发酵黄酒 发酵型枳椇子黄酒 总糖（g/L） 半干型15.1~40.0 16.62±0.12 16.14±0.15 非糖固形物（g/L） 一级≥16.0 17.72±0.45 18.20±0.78 酒精度（%vol） ≥8.0 10.79±0.01 10.79±0.01 总酸（g/L） 3.0~7.5 6.87±0.12 7.42±0.11 氨基酸态氮（g/L） 优级≥0.40 0.70±0.06 0.62±0.06 pH 3.5~4.6 4.30±0.05 4.38±0.07 市售黄酒、普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒的感官评价结果如图2所示。就色泽而言，三种酒样澄清度无明显差异，颜色深浅程度为：市售黄酒会稽山>普通发酵黄酒>发酵型枳椇子黄酒；就香气而言，发酵型枳椇子黄酒因具有药香、青草香的特点，更为清新优雅，易被记忆和辨识；就滋味而言，发酵型枳椇子黄酒因原料中加入了枳椇子，发酵后苦味、涩味有所改善，但口感不够持久。综合评价结果显示发酵型枳椇子黄酒感官品质较佳。
2.2 发酵型枳椇子黄酒的抗氧化能力
常用半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）评价其抗氧化能力[17]。普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒中固形物含量均为34 mg/mL，为方便计算和比较IC50，将稀释倍数换算成固形物浓度即样品浓度进行绘图。
2.2.1 DPPH·清除能力
DPPH自由基是以氮为中心很稳定的有机自由基。以VC为对照，比较普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒的DPPH自由基清除能力，如图3所示，二者均随着浓度升高而不断增大。经SPSS计算，普通发酵黄酒、发酵型枳椇子黄酒和VC清除DPPH自由基的IC50分别为363.54、183.77和3.931 μg/mL，即DPPH自由基清除能力为：VC>发酵型枳椇子黄酒>普通发酵黄酒。以VC当量表示，普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒的DPPH自由基清除能力分别为0.367、0.727 mg VC/mL，即发酵型枳椇子黄酒的DPPH自由基清除能力是普通发酵黄酒的1.98倍，这可能是发酵型枳椇子黄酒中含有更多酚羟基，能提供活泼的氢，从而终止自由基连锁反应，起到抗氧化作用。与其他特型黄酒相比，发酵型枳椇子黄酒的DPPH自由基清除能力优于清爽型银耳黄酒（0.0739 mg VC/mL）[18]。
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图 3 不同浓度发酵型枳椇子黄酒清除DPPH自由基的能力Figure 3. The ability of scavenging DPPH free radical of HFH at different concentrations2.2.2 ABTS自由基清除能力
过硫酸钾能与ABTS生成绿色的ABTS自由基，其最大吸收峰为734 nm处。若黄酒中含有抗氧化物则ABTS自由基被捕捉而使其颜色变浅，因此可用ABTS自由基清除率来评价其抗氧化能力[19]。由图4可知，普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒在17~85 μg/mL浓度范围内对ABTS自由基清除能力无明显差异，低浓度下量效关系不佳；当浓度大于85 μg/mL时，发酵型枳椇子黄酒表现出更好的ABTS自由基清除能力。VC在27~80 μg/mL范围内呈良好的线性关系（R2=0.9982）。经SPSS计算，普通发酵黄酒、发酵型枳椇子黄酒和VC清除ABTS自由基的IC50值分别为75.90、65.41和64.64 μg/mL。以VC当量表示，普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒的ABTS自由基清除能力分别为28.96、33.60 mg VC/mL，即发酵型枳椇子黄酒的ABTS自由基清除能力是普通发酵黄酒的1.16倍。
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图 4 不同浓度发酵型枳椇子黄酒清除ABTS自由基的能力Figure 4. The ability of scavenging ABTS free radical of HFH at different concentrations2.2.3 羟基自由基清除能力
OH−失去一个电子即形成羟基自由基，羟基自由基是活性氧中最活泼的自由基，它几乎能与活细胞中任何生物大分子发生反应，且反应速度极快，是对机体危害最大的自由基[20]。如图5所示，普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒都表现出较强的浓度依赖性。经SPSS计算，普通发酵黄酒、发酵型枳椇子黄酒和VC清除羟基自由基的IC50值分别为2495.41、935.49和249.54 μg/mL，由此看出羟基自由基清除能力为：VC>发酵型枳椇子黄酒>普通发酵黄酒。以VC当量表示，普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒的羟基自由基清除能力为3.40、9.07 mg VC/mL，即发酵型枳椇子黄酒的羟基自由基清除能力是普通发酵黄酒的2.67倍。
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图 5 不同浓度发酵型枳椇子黄酒清除羟基自由基的能力Figure 5. The ability of scavenging OH free radical of HFH at different concentrations2.2.4 还原力
铁氰化钾还原力可用来判断物质是否为良好的电子供体，是评价物质抗氧化能力的一个重要指标[21]。由图6可知，普通发酵黄酒、发酵型枳椇子黄酒和VC的还原力都表现出一定的浓度依赖性，随着浓度的升高，还原力增强。普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒在850~3400 μg/mL均呈现良好的线性关系（R2分别为0.9932、0.9967），发酵型枳椇子黄酒斜率比普通黄酒大表示其浓度对还原力影响力更大。VC在50~100 μg/mL呈现良好的线性关系（R2=0.9994），但随着浓度进一步提高，还原力增强幅度变小。同时可知，浓度为2000 μg/mL的普通发酵黄酒和发酵型枳椇子黄酒还原力分别相当于浓度为35.65和48.39 μg/mL的VC溶液，即发酵型枳椇子黄酒还原力是普通发酵黄酒的1.36倍。与其他特型黄酒相比，发酵型枳椇子黄酒还原力明显优于黄精糯米黄酒[17]、金银花黄酒[22]、山楂黍米黄酒[23]、薏米茯苓黄酒[21]。
2.3 枳椇子黄酒中总酚、总黄酮含量
酚类物质对黄酒的抗氧化活性具有重要影响，其来源主要是原辅料本身和发酵过程中的微生物代谢[24]。陈金娥等[25]研究发现因黄酒中的多酚含量较高，其对羟基自由基清除能力远高于其他酒类，且黄酒中多酚含量越高，抗氧化能力越强。如表4所示，普通发酵黄酒中总酚含量为794.86 mg/L，明显高于5种市售黄酒的总酚含量平均值521.77 mg/L，这可能与市售酒经过长期陈酿使酚类物质自身氧化缩合并与含有氨基成分进一步缩合成褐色高聚物有关[26]。发酵型枳椇子黄酒中总酚和总黄酮含量分别比普通发酵黄酒高40.93%和94.52%。
表 4 酒样中抗氧化物质含量Table 4. Antioxidant content in wine samples样品 总酚（mg/L） 总黄酮（mg/L） 普通发酵黄酒 794.86±11.79c 111.66±6.91e 发酵型枳椇子黄酒 1120.20±26.18a 217.20±1.40c 市售黄酒1 568.07±8.71e 86.60±2.09f 市售黄酒2 276.73±2.31g 72.67±2.72f 市售黄酒3 564.13±17.08e 91.13±8.38f 市售黄酒4 696.53±4.94d 144.53±4.46d 市售黄酒5 503.40±0.60f 112.07±14.44e 浸泡型枳椇子黄酒 901.40±4.00b 275.47±11.87b 枳椇子泡10.79%乙醇 774.00±5.20c 371.80±19.44a 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 枳椇子中含有山奈酚、槲皮素、杨梅素、二氢杨梅素、表儿茶素等酚类化合物[27]，将枳椇子浸泡于黄酒或乙醇中也能促使枳椇子中酚类活性物质的溶出。为进一步探究发酵型枳椇子黄酒中总酚和总黄酮的来源，制备了浸泡型枳椇子黄酒和枳椇子泡10.79%乙醇。从表4可以看出，与普通发酵黄酒比，浸泡型枳椇子黄酒的总酚含量提高了106.54 mg/L，总黄酮含量提高了163.81 mg/L；与发酵型枳椇子黄酒比，浸泡型枳椇子黄酒的总酚含量降低了218.8 mg/L，总黄酮含量提高了58.27 mg/L。不同制备方式对酒样中的总酚和总黄酮含量影响较大，这可能与发酵使酚类物质随着碳源的消耗而释放出，枳椇子中复杂的大分子酚类物质转化成小分子酚类物质有关。此外，发酵过程中游离态的黄酮类物质易与葡萄糖结合形成黄酮苷，其溶解度小于游离态黄酮类化合物，导致部分黄酮类物质析出含量降低。上述研究结果表明，加入枳椇子一起发酵有利于黄酒中总酚含量的提高。
2.4 发酵对枳椇子黄酒中二氢杨梅素和杨梅素的影响
枳椇子中抗氧化活性成分主要为二氢杨梅素和杨梅素，二者均溶于乙醇，微溶于水，在酸性条件下更稳定[28]。其中，二氢杨梅素在解除醇中毒，保肝护肝、降血压、抗氧化等方面具有特殊功效，是天然活性成分研究的热点[29]。本研究比较了发酵法和浸泡法对枳椇子黄酒中二氢杨梅素和杨梅素溶出的影响，结果如图7所示。
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图 7 不同制备方式对二氢杨梅素和杨梅素含量的影响注：不同字母代表组间差异显著（P<0.05）。Figure 7. Effects of different preparation methods on the content of dihydromyricetin and myricetin发酵型枳椇子黄酒中二氢杨梅素含量为235.66 mg/L，杨梅素含量为16.12 mg/L。用10.79%乙醇水溶液和黄酒浸泡枳椇子所得样品中二氢杨梅素含量无显著性差异（P>0.05）。发酵型枳椇子黄酒中二氢杨梅素含量是浸泡型的2.85倍，说明发酵较浸泡更有利于二氢杨梅素的富集。一方面，黄酒在前发酵和后发酵开始时分批加入枳椇子，提高微生物的利用率，加快了微生物代谢活动从而促进二氢杨梅素的溶出；另一方面，二氢杨梅素易溶于热水、热乙醇，煎酒时温度升高使二氢杨梅素溶解度提高。发酵型与浸泡型枳椇子黄酒所得杨梅素含量没有显著性差异（P>0.05），不同制备方式对杨梅素溶出影响不大。而杨梅素在10.79%乙醇水溶液中含量显著高于枳椇子黄酒（P<0.05），这可能是因为杨梅素属于黄酮醇类物质，易与黄酒中的糖苷结合从而形成配糖体杨梅素苷或其他衍生物。上述研究结果表明，同时发酵法制备枳椇子黄酒有利于黄酒中二氢杨梅素含量的提高。
3. 结论
采用两步发酵法制备枳椇子黄酒，对其理化指标和感官评价进行分析，以VC为对照研究其抗氧化能力；为探究其抗氧化原因，比较了浸泡型和发酵型枳椇子黄酒中总酚、总黄酮、二氢杨梅素和杨梅素含量。结果表明，发酵型枳椇子黄酒属于特型半干黄酒，具有药香，苦味和涩味有所改善，口感更佳。以VC当量计，发酵型枳椇子黄酒对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基清除能力及还原力的能力分别为黄酒的1.98倍、1.16倍、2.67倍和1.36倍。经比较，发酵型枳椇子黄酒中总酚含量为1120.20 mg/L，显著高于普通发酵黄酒和浸泡型枳椇子黄酒（P<0.05），说明通过发酵可以提高枳椇子黄酒中的总酚含量。经检测进一步发现枳椇子中的活性物质二氢杨梅素在发酵过程中得到富集，含量为235.66 mg/L，是浸泡型枳椇子黄酒的2.85倍，表明发酵有利于枳椇子黄酒中二氢杨梅素的富集。综上表明通过发酵提高了黄酒中总酚含量，富集了枳椇子中活性成分二氢杨梅素，使枳椇子黄酒具备良好的抗氧化能力，可预见其在保健黄酒的开发上有较好的应用前景。
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图 3 不同浓度发酵型枳椇子黄酒清除DPPH自由基的能力
Figure 3. The ability of scavenging DPPH free radical of HFH at different concentrations
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图 4 不同浓度发酵型枳椇子黄酒清除ABTS自由基的能力
Figure 4. The ability of scavenging ABTS free radical of HFH at different concentrations
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图 5 不同浓度发酵型枳椇子黄酒清除羟基自由基的能力
Figure 5. The ability of scavenging OH free radical of HFH at different concentrations
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图 7 不同制备方式对二氢杨梅素和杨梅素含量的影响
注：不同字母代表组间差异显著（P<0.05）。
Figure 7. Effects of different preparation methods on the content of dihydromyricetin and myricetin
表 1 发酵型枳椇子黄酒感官分析标准
Table 1 Sensory analysis criteria of HFH
项目 品评标准 分值（分） 8~10 5~7 1~4 色泽
（20%）1.澄清度 澄清透明 较澄清 浑浊 2.颜色 色泽鲜亮，有喜感 棕黄色 黄色 香气
（20%）3.气味 有黄酒特有香味和淡淡的药味 黄酒香味不协调或药味过重 异常气味 4.程度 喜欢，闻着舒心 不反感也不喜欢 反感 口味
（40%）5.苦味 无苦味 苦味很轻，不影响味道 较苦 6.甜味 甜味适中 较甜 甜味很淡 7.涩味 无涩味 涩味较轻，舌头无厚重感 涩味较重，舌头有厚重感 8.鲜味 鲜爽且入口醇香 比较鲜美 酒体淡薄且不够柔和 口感
（20%）9.持久度 悠长 绵长 短暂 10.丰满度 醇厚 平淡 寡淡 
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表 3 发酵型枳椇子黄酒的理化指标
Table 3 Physical and chemical indexes of HFH
理化指标 国家标准参考值 普通发酵黄酒 发酵型枳椇子黄酒 总糖（g/L） 半干型15.1~40.0 16.62±0.12 16.14±0.15 非糖固形物（g/L） 一级≥16.0 17.72±0.45 18.20±0.78 酒精度（%vol） ≥8.0 10.79±0.01 10.79±0.01 总酸（g/L） 3.0~7.5 6.87±0.12 7.42±0.11 氨基酸态氮（g/L） 优级≥0.40 0.70±0.06 0.62±0.06 pH 3.5~4.6 4.30±0.05 4.38±0.07
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表 4 酒样中抗氧化物质含量
Table 4 Antioxidant content in wine samples
样品 总酚（mg/L） 总黄酮（mg/L） 普通发酵黄酒 794.86±11.79c 111.66±6.91e 发酵型枳椇子黄酒 1120.20±26.18a 217.20±1.40c 市售黄酒1 568.07±8.71e 86.60±2.09f 市售黄酒2 276.73±2.31g 72.67±2.72f 市售黄酒3 564.13±17.08e 91.13±8.38f 市售黄酒4 696.53±4.94d 144.53±4.46d 市售黄酒5 503.40±0.60f 112.07±14.44e 浸泡型枳椇子黄酒 901.40±4.00b 275.47±11.87b 枳椇子泡10.79%乙醇 774.00±5.20c 371.80±19.44a 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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