基于顶空气相-离子迁移谱技术对不同酵母发酵的百香果果啤香气比较

范威威; 林熙; 龚霄; 周伟; 李积华; 孔智文; 苏波; 李扬宇

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2021080033

基于顶空气相-离子迁移谱技术对不同酵母发酵的百香果果啤香气比较

范威威^{1, 2,},
林熙^3, ,,
龚霄^2, ,,
周伟²,
李积华²,
孔智文³,
苏波⁴,
李扬宇⁴

1.
华中农业大学食品科技学院，湖北武汉 430072
2.
中国热带农业科学院农产品加工研究所，农业农村部热带作物产品加工重点实验室，广东湛江 524001
3.
湛江珠江啤酒股份有限公司，广东湛江 524039
4.
云南农业大学热带作物学院，云南普洱 665000

基金项目: 广东省优稀水果现代农业产业技术体系创新团队项目（2020KJ116）；热带食品精深加工创新团队-特色热带果蔬精深加工项目（1630122017013）。

详细信息

作者简介:
范威威（1998−），女，硕士研究生，研究方向：发酵工程，E-mail：2990767913@qq.com

通讯作者:
林熙（1982−），男，本科，高级工程师，研究方向：啤酒酿造，E-mail：xi.china@139.com

龚霄（1984−），男，博士，副研究员，研究方向：食品代谢组学，E-mail：gongxiaocau@126.com

中图分类号: TS255.3
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出版历程
- 收稿日期: 2021-08-03
- 网络出版日期: 2022-02-10
- 刊出日期: 2022-03-31

Aroma Comparison of Passion Beer Fermented by Different Yeasts Based on Headspace Phase-ion Mobility Spectroscopy Technology

FAN Weiwei^{1, 2,},
LIN Xi^3, ,,
GONG Xiao^2, ,,
ZHOU Wei²,
LI Jihua²,
KONG Zhiwen³,
SU Bo⁴,
LI Yangyu⁴

1.
College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430072, China
2.
Key Laboratory of Tropical Crop Products Processing of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Agricultural Products Processing Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Zhanjiang 524001, China
3.
Zhanjiang Zhujiang Brewery Co., Ltd., Zhanjiang 524039, China
4.
College of Tropical Crops, Yunnan Agricultural University, Puer 665000, China

摘要

摘要: 酵母菌种对啤酒的风味与品质有着重大的影响。本文以皮尔森麦汁、啤酒花、啤酒酵母、百香果原浆和水等为主要原料酿造百香果果啤，采用气相-离子迁移谱（Gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技术测定不同啤酒酵母（S-04、US-05、S-33、CS31和CN36）酿造的百香果果啤中挥发性香气化合物。采用主成分（Principal component analysis，PCA）与正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least-squares discrimination analysis, OPLS-DA），区分不同品种酵母酿造的百香果果啤。结果表明：采用GC-IMS共检测出37种挥发性香气成分，其中酯类16种、醇类8种、醛类6种、酮类4种、酸2种、烯烃类1种；PCA分析结果离散型较好，前两个主成分的累计贡献率为60.6%；OPLS-DA前两种成分总方差之和为68.1%，乙酸、辛酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、己酸乙酯等17种风味化合物贡献率较大（VIP>1）。S-04发酵果啤特征性风味物质为乙酸和2-戊酮，US-05为丁酸甲酯，S-33为3-羟基-2-丁酮，CS31为辛酸乙酯、己酸乙酯、异戊醇和正丁醇，CN36为乙酸异丁酯、乙酸丙酯和丙酸乙酯。研究结果可为筛选适合生产百香果果啤专用酵母提供科学依据。
- 百香果果啤 /
- 气相-离子迁移谱(GC-IMS) /
- 啤酒酵母 /
- 挥发性香气成分
Abstract: Yeast strains have a significant impact on the flavor and quality of beer. In this paper, passion beer was brewed with pearson wort, hops, yeast, passion juice and brewing water as raw materials. The volatile aroma components of passion beer brewed with different yeasts (S-04, US-05, S-33, CS31 and CN36) were analyzed by gas chromatography-ion mobility spectrometry (GC-IMS) technology. Principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least-squares discrimination analysis (OPLS-DA) were used to distinguish passion beer brewed by different yeasts. The results showed that 37 volatile aroma compounds were detected by GC-IMS, including esters (16), alcohols (8), aldehydes (6), ketones (4), acids (2) and olefins (1). PCA showed the cumulative contribution rate of the PC1 and PC2 components was 60.6%. OPLS-DA results showed 68.1% of the total difference, and 17 flavor compounds contributed significantly (VIP>1), including acetic acid, ethyl octanoate, acetion, ethyl hexanoate and so on. The characteristic flavor substances for S-04 fermented fruit beer was acetic acid and 2-pentanone, characteristic flavor substance for US-05 was methyl butyrate, characteristic flavor substance for S-33 was acetoin, characteristic flavor substances for CS31 were ethyl octanoate, ethyl hexanoate, 3-methyl-1-butanol and 1-butanol, and the characteristic flavor substances for CN36 were isobutyl acetate, propyl acetate and ethyl propanoate. The research results can provide a scientific basis for the selection of yeast suitable for the production of passion beer.
- passion beer /
- GC-IMS /
- beer yeast /
- volatile aroma components

HTML全文

果啤是以水、麦芽、啤酒花、酵母等为原料，经糖化、发酵，在酿造过程中加入果汁酿制而成，是近年来较受欢迎的工坊啤酒^[1]。市售的果啤种类有樱桃、葡萄、橙子、苹果、梨子、桃子等^[2]，但多以调制为主，在风味与种类上难以满足众多消费者的需求，真正由发酵而制成的果酿果啤较少^[3]。因此，新型果啤的研发已成为啤酒行业不断奋斗的目标。

百香果（Passiflora edulia Sims），又名西番莲、蛋黄果，是多年生藤本植物所结的果实，为西番莲科西番莲属，主要集中在广西、广东、海南、云南、福建和贵州等省种植^[4]。百香果果汁色、香、味俱佳，含有人体所需的糖、氨基酸、维生素、蛋白质等多种营养成分，其含有的活性物质如黄酮、多酚、多糖等，具有镇痛、镇静、促进消化、治疗痢疾等功效^[5]。百香果具有多种水果的复合香气，且酯类、醇类化合物的含量较为丰富^[5]，在酿造果啤上具有开发的潜力。果啤在酿造过程中需要加入果汁，而果汁、啤酒花和酵母等都会对啤酒的风味产生一定影响^[6]，因此，果汁、啤酒花和酵母等成为了考察风味变化的主要研究对象^[7]。百香果果啤的制作选择皮尔森麦汁、啤酒花、不同的啤酒酵母和水等为主要的酿酒材料，在发酵中期（第3 d）加入百香果原浆，经发酵成熟、冷储后取成品样进行香气的测定。目前绝大多数用于风味测定的技术预处理较为繁琐，很难达到快速测定的目的^[8]。离子迁移谱（Ion mobility spectrometry, IMS）是一种基于常压电场作用下电离分子气相分离的痕量气体和特征性化学离子物质的快速分析技术。它具有分析速度快、操作简便、耗时少、成本相对较低等诸多优点，特别是无需样品前处理步骤^[9]。气相色谱-离子迁移谱（Gas chromatogra-phy-ion mobility spectrometry，GC-IMS）结合了GC和IMS的特性，逐渐成为了一种新兴的检测技术，在中药、临床、食品、环境等多个领域均有广泛的应用^[9-10]。目前，GC-IMS在白酒、葡萄酒^[11]、啤酒等酒类产品中的应用分析不断深入，如龚霄等^[12]采用GC-IMS区分不同品种的果啤，Yang等^[13]则是对果啤中挥发性化合物进行了分析。

本文选择上面酵母S-04、US-05、S-33、CS31和CN36进行百香果果啤发酵实验探究，采用GC-IMS技术对不同酵母发酵产品挥发性香气物质进行比较，以期为百香果果啤专用酿酒发酵菌种的筛选提供新的思路。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

市售冷冻百香果原浆（糖度14.3^oBrix，pH 2.93）　广西果朝食品有限公司；皮尔森麦汁（13 ^oP初沸）　湛江珠江啤酒有限公司提供；啤酒花　山东博朗生物科技有限公司；酿酒酵母（S-04、US-05和S-33）　济南鲁丰啤酒原料有限公司；酿酒酵母（CS31和CN36）　安琪酵母股份有限公司；水　酿造用水；6 L不锈钢发酵罐　宁波翔盛金属厂；4-甲基-2戊醇（纯度98.5%）　德国Dr. Ehrenstorfer公司；N-ketones C₄~C₉　国药集团化学试剂有限公司。

Flavour Spec®食品风味分析仪　德国G.A.S公司。

1.2 实验方法

1.2.1 百香果果啤制作工艺

工艺流程如图1所示，操作要点：

图 1 百香果果啤制作工艺流程图

Figure 1. Production process flow chart of passion fruit beer

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a. 麦芽粉碎：选择浸出程度较高的麦芽，粉碎时使麦麸尽量完整，内部破碎。

b. 糖化：采用浸出糖化法66 ℃ 1 h，随后升温至 75 ℃ 10 min，进行碘检。

c. 洗糟：根据煮沸蒸发量与原麦汁浓度控制洗糟用水量，洗糟水温70 ℃左右，缓慢下淋。

d. 麦汁煮沸：煮沸时间60 min，在第30 min时加入青岛大花，0.3 g/L，煮沸结束加入西楚酒花，0.2 g/L。

e. 冷却：冷却至20 ℃左右，温度不能过高，接种时会影响酵母活性，pH在5.3～5.4之间。

f. 杀菌：发酵罐在使用前必须清洗干净，采用100 ℃沸水浸泡式杀菌，麦汁装量不能超过80%。

j. 酵母接种：在250 mL锥形瓶中加入10倍干酵母重量的重蒸水，按0.8 g/L的比例添加干酵母，将酵母液摇匀后静置10 min，待麦汁充分冷却后进行接种。

h. 发酵：前期发酵温度18 ℃，3 d后温度升至20 ℃进入主发酵，此时加入10%的百香果原浆，发酵第8 d糖度降至6.5^oBrix左右，双乙酰含量下降至0.05 mg/L以下时，降温至0 ℃冷储7 d。

1.2.2 香气测定

1.2.2.1 气相离子迁移谱（Gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）分析

参考龚霄等^[12]对果啤的测定方法对百香果果啤进行测定，具体测定条件如下：将存放于4 ℃条件下的啤酒样品轻轻打开，在酒体中部快速吸取2 mL并转移至20 mL的顶空进样瓶中，半密封状态于4 ℃超声水浴28 kHz下脱气30 s，1 g样品中加入内标4-甲基-2-戊醇 20 ppm 10 μL，内标用于对检测出的挥发性化合物进行定量。Flavour Spec^®风味分析仪顶空进样体积100 μL；孵育时间10 min；孵育温度60 ℃；进样针温度65 ℃；孵化转速500 r/min；高纯度氮气（≥99.999%）为载气；清洗时间0.5 min。

1.2.2.2 GC条件

WAX 30 m ID：0.53 mm石英毛细管柱，柱温60 ℃；载气：高纯度氮气（≥99.999%）；载气流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min；8 min内，线性增至100 mL/min；10 min内，线性增至150 mL/min，运行时间20 min。

1.2.2.3 IMS条件

漂移管长度98 mm；管内线性电压500 V/cm；漂移管温度45 ℃；漂移气为高纯度氮气（≥99.999%）；漂移气流速150 mL/min；放射源为β射线（氚，³H）；模式：正离子。

1.2.2.4 定性定量分析

由C₄~C₉混合标准样品测定的保留时间，计算测定样品中挥发性香气物质的保留指数RI。

（ ）

$\rm RI=\frac{100（t_x-t_z）}{t_{z+1}-t_z}+100Z$

式中，RI：保留指数；t_x：被测物保留时间；t_z：碳原子数为z的正构烷烃的保留时间；t_z+1：碳原子数为z+1的正构烷烃的保留时间；Z：碳原子个数。

将挥发性化合物的质谱图与NIST及IMS数据库标准谱图进行对比、结合保留指数定性，由定性挥发性风味物质的出峰面积与内标峰面积的比值来计算挥发性风味物质的含量，计算公式如下：

${\rm{C_i=\frac{A_i\times C_{std}\times V_{std}\times \rho}{A_{std}\times m}}}$

式中：C_i：挥发性成分的含量μg/kg；A_i：各物质峰面积；A_std：内标物的峰面积；C_std：内标物的浓度ppm；V_std：内标物体积mL；ρ：内标物密度g/mL；m：加入样品质量g。

1.3 数据处理

仪器配套的分析软件：LAV（Laboratory Analytical Viewer）和三款插件以及 GC×IMS Library Search。LAV 软件：用于气相离子迁移谱图数据分析与信息提取，可在建立标准曲线后可进行定量分析。Reporter 插件：对比样品之间的谱图差异（二维俯视图和三维谱图）。Gallery Plot 插件：指纹图谱对比，直观且定量地比较不同样品之间的挥发性香气成分差异。GC × IMS Library Search：通过软件内置的 NIST 数据库和 IMS 数据库对化合物进行定性分析，每个样品平均测定三次。SPSS 16.0：显著性差异分析（显著性水平0.05），结果以平均值±标准偏差表示；SIMCA 14.1：香气成分进行主成分与正交偏最小二乘分析。

2. 结果与分析

2.1 不同啤酒酵母酿造百香果果啤GC-IMS图谱分析

采用GC-IMS对不同酵母酿造百香果果啤进行挥发性香气化合物进行测定，百香果果啤的三维谱图（保留时间、迁移时间和峰强度）如图2A所示，从图中可以直观看出不同酵母酿造果啤的挥发性有机物存在差异。为了更直观地反映每个样品的风味物质的差异，选择俯视图2B进行比较，这是通过对离子迁移时间和反应离子峰（RIP）的归一化而获得的。横坐标1.0处的红色垂直线是反应离子峰（RIP），并且每个RIP代表一种风味化合物。颜色表示每个化合物的信号强度。红色表示高浓度，白色表示低浓度，颜色越深浓度就越高。根据挥发性香气化合物气相色谱保留时间和离子迁移时间对果啤挥发性香气化合物进行分析，共计定性出37种挥发性化合物（表1），其中酯类16种、醇类8种、醛类6种、酮类4种、酸2种、烯烃类1种，同一种化合物的单体和二聚体视为一种化合物，这与张俊杰等^[14]关于啤酒挥发性化合物图谱分析的报告基本一致（表中未知化合物不进行分析讨论）。啤酒中最丰富的化合物酯类，它能够使啤酒的风味达到平衡^[15]，乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸乙酯是与果味和花香相关的主要酯类化合物^[16]。醇类是糖的代谢或氨基酸的脱氢、脱羧产生的，实验结果表明：乙醇（21338.26～24716.46 μg/kg）、异戊醇（9246.04～11068.25 μg/kg）、异丁醇（5450.48～6712.88 μg/kg）是所有醇类中浓度最高的，赋予啤酒以水果香气和指甲油味^[17]。酯和醇都被认为是啤酒最重要的香气化合物，它们之间的浓度平衡会影响总体香气分布^[18]。乙酸、辛酸在不同程度上会产生酸味和奶酪味^[19]。

图 2 不同酵母酿造百香果果啤中挥发性化合物的GC-IMS图谱

Figure 2. GC-IMS patterns of volatile compounds in passion beer brewed by different yeasts

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表 1 GC-IMS鉴别不同酵母酿造百香果果啤挥发性化合物

Table 1. Identification of volatile compounds in passion beer brewed by different yeasts by GC-IMS

序号	英文名称	中文名称	RI	Rt（s）	相对含量（μg/kg）
序号	英文名称	中文名称	RI	Rt（s）	S-04	US-05	S-33	CS31	CN36
酯类
1	Ethyl octanoate-M	辛酸乙酯	1457.70	1086.14	753.28±33.28^e	813.21±5.07^d	964.40±40.71^b	1329.29±19.58^a	876.58±31.65^c
2	Ethyl octanoate-D	辛酸乙酯	1455.50	1082.11	80.88±4.77^c	91.43±10.17b^c	97.99±7.35^b	182.30±5.02^a	94.84±1.83^b
3	Ethyl hexanoate	己酸乙酯	1240.10	712.16	234.14±9.32^c	162.99±10.03^d	349.04±31.20^b	402.15±14.05^a	237.42±14.83^c
4	Isoamyl acetate	乙酸异戊酯	1128.00	534.92	5163.44±262.66^a	1759.04±122.57^d	4186.62±157.41^c	5445.26±149.78^a	4734.52±88.14^b
5	Ethyl butanoate	丁酸乙酯	1039.60	416.01	852.73±72.49^a	747.9±55.01^b	838.26±45.63^ab	811.23±33.63^ab	897.34±21.09^a
6	Isobutyl acetate	乙酸异丁酯	1017.20	390.28	467.80±42.01^a	70.46±6.97^d	181.67±11.57^c	156.70±7.79^c	395.41±15.21^b
7	Propyl acetate	乙酸丙酯	981.10	355.89	73.03±4.74^bc	24.59±0.50^d	76.76±4.03^b	89.02±3.27^a	66.82±1.93^c
8	Ethyl isobutyrate	异丁酸乙酯	968.80	347.53	67.78±5.76^a	38.33±2.20^b	16.94±1.75^d	30.70±0.86^c	31.91±1.27^c
9	Ethyl propanoate	丙酸乙酯	961.60	342.62	411.23±25.96^c	213.45±15.16^e	337.41±11.15^d	524.54±17.75^b	591.15±11.49^a
10	Ethyl Acetate	乙酸乙酯	893.60	296.43	4610.27±63.96^b	3836.32±57.80^e	4312.85±42.85^d	4913.04±28.59^a	4508.77±24.35^c
11	Ethyl formate	甲酸乙酯	880.20	287.30	637.56±12.98^b	662.00±12.96^a	617.71±10.64^bc	598.10±8.14^c	577.46±3.02^d
12	Methyl acetate	乙酸甲酯	846.50	264.42	211.31±8.20^c	255.14±7.11^a	232.37±11.86^b	211.25±8.66^c	187.10±3.67^d
13	Methyl butanoate	丁酸甲酯	989.60	361.66	67.35±1.23^b	75.44±3.23^a	54.11±1.79^c	45.94±1.21^d	28.44±1.14^e
14	Butyl acetate	乙酸丁酯	1075.40	457.11	21.71±0.48^b	17.52±1.45^c	27.78±1.92^a	27.68±2.20^a	22.23±3.33^b
15	3-methylbutanoate 3-methylbutanoate	3-甲基丁酸乙酯	1063.30	443.17	16.68±2.16^b	12.14±1.43^c	25.06±2.69^a	21.51±2.87^a	14.28±0.78^bc
16	Ethyl pentanoate	戊酸己酯	1138.40	552.76	73.96±4.01^b	26.96±1.32^d	64.55±2.47^c	86.82±5.28^a	70.54±5.08^bc
17	Hexyl acetate	乙酸己酯	1278.50	765.88	61.74±3.41^b	55.32±5.54^b	76.55±4.11^a	53.11±4.78^b	60.77±4.04^b
醇类
18	Linalool	芳樟醇	1712.50	1551.27	136.27±10.30^a	112.27±2.57^b	135.60±17.59^a	106.10±1.91^b	116.89±7.43^ab
19	1-Hexanol	正己醇	1360.70	908.95	266.25±11.28^c	248.94±12.79^bc	284.72±11.83^b	247.34±10.92^a	237.36±8.93^b
20	3-Methyl-1-butanol	异戊醇	1216.30	678.68	9729.67±100.34^b	9246.04±29.67^c	9721.91±45.34^b	11068.25±50.32^a	9781.02±12.56^b
21	1-Butanol-M	正丁醇	1148.10	569.38	222.95±9.69^e	172.00±8.27^d	292.76±17.25^b	378.00±3.50^a	239.15±3.26^c
22	1-Butanol-D	正丁醇	1147.50	568.40	146.78±7.24^c	77.95±7.17^e	177.15±4.00^b	277.33±3.70^a	124.22±4.54^d
23	2-Methyl-1-propanol	异丁醇	1094.40	478.79	6712.88±32.10^a	6184.84±26.96^c	5450.48±37.32^e	5723.61±18.32^d	6570.46±39.39^b
24	1-Propanol	丙醇	1039.60	416.01	1804.84±54.07^ab	1790.85±40.21^b	1795.18±1.50^b	1861.75±18.04^a	1630.42±2.96^c
25	Ethanol	乙醇	934.10	323.95	23925.31±114.53^b	24716.46±32.21^a	22447.37±581.48^c	21650.22±95.40^d	21338.26±66.74^d
26	2-Ethyl-1-hexanol	2-乙基己醇	1552.60	1259.39	77.01±2.16^a	79.08±8.34^a	84.79±7.96^a	87.58±3.79^a	87.50±4.86^a
醛类
27	Octanal	正辛醛	1292.50	785.59	94.83±5.19^b	74.23±9.68^c	123.08±8.87^a	95.68±4.43^b	74.26±4.35^c
28	3-Methylbutanal	异戊醛	920.40	314.61	490.70±16.43^b	678.98±3.33^a	695.52±9.47^a	300.68±6.32^d	435.26±17.74^c
29	2-Methyl propanal	2-甲基丙醛	846.00	264.06	203.22±22.01^c	309.08±15.19^a	243.66±23.98^b	208.32±15.32^bc	159.75±9.85^d
30	Propanal-M	丙醛	834.40	256.20	244.19±33.89^c	302.42±4.18^b	374.96±14.14^a	358.86±11.39^a	308.13±3.39^b
31	Propanal-D	丙醛	835.50	256.91	184.69±13.40^b	186.32±4.12^b	233.67±2.04^a	194.45±2.03^b	134.73±14.67^c
32	Acetaldehyde	乙醛	806.00	236.89	3241.54±191.33^ab	3330.85±92.88^a	3231.91±202.59^ab	2999.86±58.01^b	3014.84±66.26^b
33	Butanal	丁醛	908.10	306.25	101.31±1.99^a	93.98±3.87^b	97.39±3.75^ab	79.55±2.57^c	99.00±1.16^ab
酸类
34	Butanoic acid	丁酸	1799.70	1710.34	139.99±20.59^a	146.65±11.66^a	103.05±9.82^b	107.84±4.96^b	110.05±2.41^b
35	Acetic acid-M	乙酸	1509.60	1180.78	2457.57±189.63^a	2180.72±13.33^b	2043.42±74.19^b	2165.97±72.51^b	2018.87±37.91^b
36	Acetic acid-D	乙酸	1511.80	1184.80	337.07±91.73^a	217.54±4.22^b	165.53±22.97^b	178.71±12.76^b	139.11±16.29^b
酮类
37	Acetoin	3-羟基-2-丁酮	1291.50	784.14	128.73±11.77^b	116.78±6.69^bc	246.15±19.99^a	134.27±13.99^b	102.42±9.54^c
38	2-Pentanone	2-戊酮	989.10	361.29	353.05±11.25^a	162.21±12.11^c	212.05±7.38^b	173.35±11.42^c	139.29±6.81^d
39	Acetone	丙酮	849.20	266.21	1162.51±27.02^ab	1085.08±65.59^b	1244.31±95.75^a	1200.64±84.56^ab	1199.87±42.07^ab
40	2-Butanone-M	丁酮	854.20	269.64	98.76±1.32^b	101.30±2.59^b	106.19±6.46^ab	113.66±4.57^a	114.49±4.43^a
41	2-Butanone-D	丁酮	853.60	269.19	24.94±1.22^b	31.75±1.11^a	24.77±3.24^b	22.18±1.56^bc	20.59±0.80^c
烯类
42	Limonene	柠檬烯	1191.20	643.24	84.55±1.66^c	63.40±2.95^e	69.21±4.13^d	114.73±2.59^b	142.03±2.38^a
未知物
	Unknown 1	未知物1	1039.60	416.01	534.46±14.89^a	473.12±11.38^b	447.47±23.43^bc	422.94±7.30^cd	404.35±9.58^cd
	Unknown 2	未知物2	1018.70	392.07	380.35±22.35^a	150.11±8.57^d	191.30±16.16^c	162.98±3.96^d	240.66±9.58^b
	Unknown 3	未知物3	991.20	362.74	474.97±12.23^a	313.66±8.12^c	334.64±15.62^b	303.79±6.39^c	282.10±5.11^d
	Unknown 4	未知物4	1146.80	567.18	529.38±22.44^b	410.44±9.95^e	504.99±10.76^c	601.45±3.77^a	439.46±8.79^d
	Unknown 5	未知物5	982.60	356.87	121.29±5.08^a	56.68±3.19^c	87.79±9.60^b	90.51±2.43^b	87.65±3.24^b
	Unknown 6	未知物6	960.90	342.13	336.77±11.79^a	235.61±9.30^cd	227.54±17.28^d	253.27±2.60^c	274.04±8.40^b
	Unknown 7	未知物7	966.70	346.06	70.35±6.15^a	36.88±2.33^c	24.48±2.01^d	51.84±5.36^b	51.80±2.45^b
	Unknown 8	未知物8	801.80	234.03	213.12±1.46^b	228.34±1.68^a	223.14±10.38^a	210.92±0.86^b	175.99±2.65^c
注：RI为保留指数，Rt为保留时间；同一行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

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2.2 不同啤酒酵母酿造百香果果啤挥发性化合物指纹图谱比较

百香果果啤的挥发性化合物的指纹图谱如图3所示，指纹图谱能够快速对比出不同样品风味物质之间的差异，图中每一行代表一个酵母果啤风味物质的全部信号峰，每一列反应同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰强度。从图中可以看出每种样品的完整挥发性有机物信息以及样品之间挥发性有机物的差异，样品大量共有化合物有异戊醇、异丁醇、乙醇、异戊醛、丙酮、丁醛、乙酸甲酯、乙酸乙酯等，其中异戊醇、乙醇、酯类化合物对啤酒风味影响较为突出^[20]。S-04酵母酿造的果啤乙酸异丁酯（水果、苹果、香蕉）、异丁酸乙酯（甜味、橡胶味）等物质的含量较高，其中乙酸异丁酯（467.80 μg/kg）约是US-05酵母的6倍，S-33和CS31酵母的2倍，异丁酸乙酯（67.78 μg/kg）约是其它样品的2倍；US-05酵母酿造的果啤中丁酸（油脂臭味、奶酪味）、丁酸甲酯（酯味、水果、甜味）、甲酸乙酯（辛辣味）等物质的含量较其它样品较高；S-33酵母酿造的果啤中异戊醛（苹果、桃子香气）、丙醛（辛辣味）、正辛醛（柠檬、生青味）、乙酸己酯（水果味、香草味）、3-甲基丁酸乙酯（水果）、乙酸丁酯（梨子味）等物质的含量较高，其中异戊醛（695.52 μg/kg）的含量约是S-04样品的1.5倍，是CS31样品的2倍；CS31酵母酿造的果啤中乙酸异戊酯（水果味、香蕉味）、辛酸乙酯（水果味、脂肪味）、己酸乙酯（苹果皮、水果味）、乙酸丙酯（水果味）等物质的含量较高，其中乙酸异戊酯（5445.26 μg/kg）含量约是US-05样品的3倍，辛酸乙酯（1329.29 μg/kg）约是S-04和US-05样品的1.5倍，乙酸丙酯（89.02 μg/kg）是US-05样品的3倍；CN35酵母酿造的果啤柠檬烯（柠檬、橘子味）、丙酸乙酯（梨子、草莓香味）等物质的含量较高，且柠檬烯（142.03 μg/kg）与丙酸乙酯（591.15 μg/kg）含量约是US-05、S-33样品的2倍。但化合物的含量越高，并不代表香气越浓郁，同一物质在不同浓度下散发出的香气会有所不同^[21-22]，香气的协调性才是啤酒酿造的关键。

图 3 不同酵母酿造百香果果啤挥发性化合物的指纹图谱

Figure 3. Fingerprint of volatile compounds in passion beer brewed by different yeasts

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2.3 主成分与正交偏最小二乘判别分析

采用PCA对不同酿酒酵母酿造百香果果啤进行分析，得分图如图4A所示，PC1和PC2分别解释了总方差的36.7%和23.9%，两者贡献率之和可达60.6%，表明它们能够很好的代表大部分数据。从PC1角度分析，S-04、US-05和S-33、CS31、CN35可有效地分离开来（S-04、US-05在PC1的正半轴，S-33、CS31、CN35在负半轴）。从PC2角度分析，US-05、S-33、CS31与S-04、CN35可有效地分离开来（US-05、S-33、CS31在PC2的正半轴，S-04、CN35在PC2的负半轴）。综合来看，S-33、CS-31样品在PC1与PC2上并不能完全分离开来，表明了这两种啤酒样品的香气成分差异性不显著。载荷图如图4B所示，展示了每种风味化合物的相对重要性以及风味化合物与各样品之间的关系（风味化合物序号与表1一致）。得分图与载荷图表明，S-04样品与其它样品分离主要与丁酸和乙醇有关，US-05样品的分离主要与甲酸乙酯、乙酸甲酯、丁酸甲酯、丁酮有关，S-33、CS31样品的分离主要与己酸乙酯、异戊醇、正丁醇有关，CN35样品的分离主要与乙酸异戊酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯相关。

图 4 不同酵母酿造百香果果啤主成分分析图

注：a: S-04、b: US-05、c: S-33、d: CS31、e: CN35。

Figure 4. Principal component analysis of passion beer brewed by different yeasts

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为确定每个样品的特征性香气成分贡献并建立分类模型。使用OPLS-DA对不同样品中特定挥发性化合物进行建模，如图5，前两个成分总差异之和是68.1%，R²X = 41.3%，R²Y = 26.8%。在图中六边形代表不同的样品，三个相近六边形为同一酒样的平行处理，圆点代表挥发性化合物（与表1序号一致）。S-04样品的风味与乙酸、2-戊酮相关性较强，US-05样品的风味与丁酸甲酯具有较强的相关性，S-33样品的风味与3-羟基-2-丁酮具有较强的相关性，CS31样品与辛酸乙酯、己酸乙酯、异戊醇、正丁醇具有较强的相关性，其中辛酸乙酯与己酸乙酯都有近似苹果的香味，由脂肪酸与乙醇产生^[23]，CN35样品的风味与乙酸异丁酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯相关性较强，这些酯类分别具有苹果、香蕉、梨子等水果的香气^[24]。

图 5 不同百香果果啤的OPLS-DA示意图

Figure 5. OPLS-DA diagram of different passion beers

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为了验证模型的有效性，用OPLS-DA模型相同的主成分的数据经过模型置换交叉检验（200次交叉验证），验证结果如图6所示。R²绿色与真实模型的R²Y值的一条回归线截距为0.185，Q²蓝色与真实模型Q²Y的一条回归线截距为-0.883（<0.05），结果显示模型未出现过度拟合现象，该模型具有显著的统计学意义。VIP通常用于评估代谢组学中X变量对OPLS-DA模型的贡献率，一般将VIP值>1表示为关键变量，结果如图7所示。在OPLS-DA的模型中共有17种化合物的VIP值>1，它们依次为乙酸、辛酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、己酸乙酯、异戊醇、柠檬烯、正丁醇、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、2-戊酮、乙酸丙酯、2-甲基丙酸乙酯、丙酸乙酯、异戊醛、2-甲基丙醛、乙酸甲酯、丁酸甲酯，而己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸甲酯和乙酸辛酯等化合物与消费者的消费欲望有一定关联^[25]，是促进消费者购买的重要化合物。

图 6 200个样本随机排列的置换测试

Figure 6. Permutation test with random arrangement of 200 samples

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图 7 VIP结果

Figure 7. VIP results

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3. 结论

本文选用皮尔森麦汁、啤酒花、不同啤酒酵母等主要原料进行百香果果啤的酿造，成品酒挥发性化合物采用GC-IMS进行分析，获得了样品挥发性化合物的指纹谱图，由指纹图谱筛选出辛酸乙酯、己酸乙酯、异戊醇、柠檬烯、正丁醇、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、2-戊酮、乙酸丙酯、丙酸乙酯等37种挥发性化合物，PCA图中不同酵母酿造果啤能够很好的分离，两个主成分累积贡献率达到60.6%，能够在较大程度上反映出果啤之间的差异，结合OPLS-DA分析可分析出不同百香果果啤主要差异香气物质，其中S-04样品的特征性风味物质为乙酸、2-戊酮，US-05样品为丁酸甲酯，S-33样品为3-羟基-2-丁酮，CS31样品为辛酸乙酯、己酸乙酯、异戊醇、正丁醇，CN35样品为乙酸异丁酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯。

啤酒品质不仅受酵母等酿造原料的影响，也受到发酵工艺的影响，本实验选取五种酵母进行挥发性香气化合物进行评估，以期为百香果果啤菌种筛选提供数据支持。但由于此次试验样本量有限，且对酵母的考察角度过于单一，不能全面展现酵母与果啤品质的关系。后期应将感官品评、理化指标、香气等指标结合，全面考察酵母对果啤酿造的影响，以期为果啤产业菌株提供一种新的比较途径。

图 1 百香果果啤制作工艺流程图

Figure 1. Production process flow chart of passion fruit beer

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图 2 不同酵母酿造百香果果啤中挥发性化合物的GC-IMS图谱

Figure 2. GC-IMS patterns of volatile compounds in passion beer brewed by different yeasts

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图 3 不同酵母酿造百香果果啤挥发性化合物的指纹图谱

Figure 3. Fingerprint of volatile compounds in passion beer brewed by different yeasts

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图 4 不同酵母酿造百香果果啤主成分分析图

注：a: S-04、b: US-05、c: S-33、d: CS31、e: CN35。

Figure 4. Principal component analysis of passion beer brewed by different yeasts

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图 5 不同百香果果啤的OPLS-DA示意图

Figure 5. OPLS-DA diagram of different passion beers

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图 6 200个样本随机排列的置换测试

Figure 6. Permutation test with random arrangement of 200 samples

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图 7 VIP结果

Figure 7. VIP results

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表 1 GC-IMS鉴别不同酵母酿造百香果果啤挥发性化合物

Table 1 Identification of volatile compounds in passion beer brewed by different yeasts by GC-IMS

序号	英文名称	中文名称	RI	Rt（s）	相对含量（μg/kg）
序号	英文名称	中文名称	RI	Rt（s）	S-04	US-05	S-33	CS31	CN36
酯类
1	Ethyl octanoate-M	辛酸乙酯	1457.70	1086.14	753.28±33.28^e	813.21±5.07^d	964.40±40.71^b	1329.29±19.58^a	876.58±31.65^c
2	Ethyl octanoate-D	辛酸乙酯	1455.50	1082.11	80.88±4.77^c	91.43±10.17b^c	97.99±7.35^b	182.30±5.02^a	94.84±1.83^b
3	Ethyl hexanoate	己酸乙酯	1240.10	712.16	234.14±9.32^c	162.99±10.03^d	349.04±31.20^b	402.15±14.05^a	237.42±14.83^c
4	Isoamyl acetate	乙酸异戊酯	1128.00	534.92	5163.44±262.66^a	1759.04±122.57^d	4186.62±157.41^c	5445.26±149.78^a	4734.52±88.14^b
5	Ethyl butanoate	丁酸乙酯	1039.60	416.01	852.73±72.49^a	747.9±55.01^b	838.26±45.63^ab	811.23±33.63^ab	897.34±21.09^a
6	Isobutyl acetate	乙酸异丁酯	1017.20	390.28	467.80±42.01^a	70.46±6.97^d	181.67±11.57^c	156.70±7.79^c	395.41±15.21^b
7	Propyl acetate	乙酸丙酯	981.10	355.89	73.03±4.74^bc	24.59±0.50^d	76.76±4.03^b	89.02±3.27^a	66.82±1.93^c
8	Ethyl isobutyrate	异丁酸乙酯	968.80	347.53	67.78±5.76^a	38.33±2.20^b	16.94±1.75^d	30.70±0.86^c	31.91±1.27^c
9	Ethyl propanoate	丙酸乙酯	961.60	342.62	411.23±25.96^c	213.45±15.16^e	337.41±11.15^d	524.54±17.75^b	591.15±11.49^a
10	Ethyl Acetate	乙酸乙酯	893.60	296.43	4610.27±63.96^b	3836.32±57.80^e	4312.85±42.85^d	4913.04±28.59^a	4508.77±24.35^c
11	Ethyl formate	甲酸乙酯	880.20	287.30	637.56±12.98^b	662.00±12.96^a	617.71±10.64^bc	598.10±8.14^c	577.46±3.02^d
12	Methyl acetate	乙酸甲酯	846.50	264.42	211.31±8.20^c	255.14±7.11^a	232.37±11.86^b	211.25±8.66^c	187.10±3.67^d
13	Methyl butanoate	丁酸甲酯	989.60	361.66	67.35±1.23^b	75.44±3.23^a	54.11±1.79^c	45.94±1.21^d	28.44±1.14^e
14	Butyl acetate	乙酸丁酯	1075.40	457.11	21.71±0.48^b	17.52±1.45^c	27.78±1.92^a	27.68±2.20^a	22.23±3.33^b
15	3-methylbutanoate 3-methylbutanoate	3-甲基丁酸乙酯	1063.30	443.17	16.68±2.16^b	12.14±1.43^c	25.06±2.69^a	21.51±2.87^a	14.28±0.78^bc
16	Ethyl pentanoate	戊酸己酯	1138.40	552.76	73.96±4.01^b	26.96±1.32^d	64.55±2.47^c	86.82±5.28^a	70.54±5.08^bc
17	Hexyl acetate	乙酸己酯	1278.50	765.88	61.74±3.41^b	55.32±5.54^b	76.55±4.11^a	53.11±4.78^b	60.77±4.04^b
醇类
18	Linalool	芳樟醇	1712.50	1551.27	136.27±10.30^a	112.27±2.57^b	135.60±17.59^a	106.10±1.91^b	116.89±7.43^ab
19	1-Hexanol	正己醇	1360.70	908.95	266.25±11.28^c	248.94±12.79^bc	284.72±11.83^b	247.34±10.92^a	237.36±8.93^b
20	3-Methyl-1-butanol	异戊醇	1216.30	678.68	9729.67±100.34^b	9246.04±29.67^c	9721.91±45.34^b	11068.25±50.32^a	9781.02±12.56^b
21	1-Butanol-M	正丁醇	1148.10	569.38	222.95±9.69^e	172.00±8.27^d	292.76±17.25^b	378.00±3.50^a	239.15±3.26^c
22	1-Butanol-D	正丁醇	1147.50	568.40	146.78±7.24^c	77.95±7.17^e	177.15±4.00^b	277.33±3.70^a	124.22±4.54^d
23	2-Methyl-1-propanol	异丁醇	1094.40	478.79	6712.88±32.10^a	6184.84±26.96^c	5450.48±37.32^e	5723.61±18.32^d	6570.46±39.39^b
24	1-Propanol	丙醇	1039.60	416.01	1804.84±54.07^ab	1790.85±40.21^b	1795.18±1.50^b	1861.75±18.04^a	1630.42±2.96^c
25	Ethanol	乙醇	934.10	323.95	23925.31±114.53^b	24716.46±32.21^a	22447.37±581.48^c	21650.22±95.40^d	21338.26±66.74^d
26	2-Ethyl-1-hexanol	2-乙基己醇	1552.60	1259.39	77.01±2.16^a	79.08±8.34^a	84.79±7.96^a	87.58±3.79^a	87.50±4.86^a
醛类
27	Octanal	正辛醛	1292.50	785.59	94.83±5.19^b	74.23±9.68^c	123.08±8.87^a	95.68±4.43^b	74.26±4.35^c
28	3-Methylbutanal	异戊醛	920.40	314.61	490.70±16.43^b	678.98±3.33^a	695.52±9.47^a	300.68±6.32^d	435.26±17.74^c
29	2-Methyl propanal	2-甲基丙醛	846.00	264.06	203.22±22.01^c	309.08±15.19^a	243.66±23.98^b	208.32±15.32^bc	159.75±9.85^d
30	Propanal-M	丙醛	834.40	256.20	244.19±33.89^c	302.42±4.18^b	374.96±14.14^a	358.86±11.39^a	308.13±3.39^b
31	Propanal-D	丙醛	835.50	256.91	184.69±13.40^b	186.32±4.12^b	233.67±2.04^a	194.45±2.03^b	134.73±14.67^c
32	Acetaldehyde	乙醛	806.00	236.89	3241.54±191.33^ab	3330.85±92.88^a	3231.91±202.59^ab	2999.86±58.01^b	3014.84±66.26^b
33	Butanal	丁醛	908.10	306.25	101.31±1.99^a	93.98±3.87^b	97.39±3.75^ab	79.55±2.57^c	99.00±1.16^ab
酸类
34	Butanoic acid	丁酸	1799.70	1710.34	139.99±20.59^a	146.65±11.66^a	103.05±9.82^b	107.84±4.96^b	110.05±2.41^b
35	Acetic acid-M	乙酸	1509.60	1180.78	2457.57±189.63^a	2180.72±13.33^b	2043.42±74.19^b	2165.97±72.51^b	2018.87±37.91^b
36	Acetic acid-D	乙酸	1511.80	1184.80	337.07±91.73^a	217.54±4.22^b	165.53±22.97^b	178.71±12.76^b	139.11±16.29^b
酮类
37	Acetoin	3-羟基-2-丁酮	1291.50	784.14	128.73±11.77^b	116.78±6.69^bc	246.15±19.99^a	134.27±13.99^b	102.42±9.54^c
38	2-Pentanone	2-戊酮	989.10	361.29	353.05±11.25^a	162.21±12.11^c	212.05±7.38^b	173.35±11.42^c	139.29±6.81^d
39	Acetone	丙酮	849.20	266.21	1162.51±27.02^ab	1085.08±65.59^b	1244.31±95.75^a	1200.64±84.56^ab	1199.87±42.07^ab
40	2-Butanone-M	丁酮	854.20	269.64	98.76±1.32^b	101.30±2.59^b	106.19±6.46^ab	113.66±4.57^a	114.49±4.43^a
41	2-Butanone-D	丁酮	853.60	269.19	24.94±1.22^b	31.75±1.11^a	24.77±3.24^b	22.18±1.56^bc	20.59±0.80^c
烯类
42	Limonene	柠檬烯	1191.20	643.24	84.55±1.66^c	63.40±2.95^e	69.21±4.13^d	114.73±2.59^b	142.03±2.38^a
未知物
	Unknown 1	未知物1	1039.60	416.01	534.46±14.89^a	473.12±11.38^b	447.47±23.43^bc	422.94±7.30^cd	404.35±9.58^cd
	Unknown 2	未知物2	1018.70	392.07	380.35±22.35^a	150.11±8.57^d	191.30±16.16^c	162.98±3.96^d	240.66±9.58^b
	Unknown 3	未知物3	991.20	362.74	474.97±12.23^a	313.66±8.12^c	334.64±15.62^b	303.79±6.39^c	282.10±5.11^d
	Unknown 4	未知物4	1146.80	567.18	529.38±22.44^b	410.44±9.95^e	504.99±10.76^c	601.45±3.77^a	439.46±8.79^d
	Unknown 5	未知物5	982.60	356.87	121.29±5.08^a	56.68±3.19^c	87.79±9.60^b	90.51±2.43^b	87.65±3.24^b
	Unknown 6	未知物6	960.90	342.13	336.77±11.79^a	235.61±9.30^cd	227.54±17.28^d	253.27±2.60^c	274.04±8.40^b
	Unknown 7	未知物7	966.70	346.06	70.35±6.15^a	36.88±2.33^c	24.48±2.01^d	51.84±5.36^b	51.80±2.45^b
	Unknown 8	未知物8	801.80	234.03	213.12±1.46^b	228.34±1.68^a	223.14±10.38^a	210.92±0.86^b	175.99±2.65^c
注：RI为保留指数，Rt为保留时间；同一行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

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