Effects of Different Methods of Inactivating Enzyme on Grain Structure, Nutrient Composition and Antioxidant Activity of Black Highland Barley
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摘要: 为防止青稞氧化哈败，本研究采用微波、炒制及过热蒸汽三种常用的处理方式对黑青稞进行灭酶，考察达到相同的灭酶效果时，不同灭酶方式对黑青稞的微观结构、营养成分、酚类物质及抗氧化能力的影响。结果表明：三种处理后的黑青稞籽粒在表观上均出现不同程度的膨化与褐变，175 ℃下炒制20 min的颜色变化及等效半径最大，微波及过热蒸汽使籽粒膨化程度相似；灭酶处理后青稞在微观上出现出明显的缝隙，甚至孔隙。在微波和过热蒸汽处理组样品的维管束处出现较大的孔洞。青稞在灭酶处理后总酚（降低14.71%~20.52%）和总黄酮（降低11.39%~45.15%）含量均显著下降，其中经150 ℃炒制处理20 min的青稞样品的黄酮和酚类含量最低，而微波处理对总酚含量影响比其他两种处理更低，过热蒸汽处理对总黄酮含量的影响最小。除微波处理外，其他灭酶方式均使青稞的抗氧化能力上升，但不同灭酶处理后青稞抗氧化能力变化与总酚和总黄酮含量的变化趋势不完全一致，在灭酶率50%及60%的处理条件下，抗氧化能力排序均为过热蒸汽处理>炒制处理>微波处理。三种灭酶热处理在灭酶的同时均可有效提高青稞的营养品质，但综合评估，过热蒸汽处理是三种处理中的最优选择。Abstract: In order to prevent the oxidative rancidity of highland barley, three common treatment methods of microwave, roasting and superheated steam were used to inactivate the enzyme of black highland barley. Then the changes of microstructure, nutrient composition, phenolic compounds and antioxidant capacity before and after inactivation of enzymes treatment were evaluated when the same enzyme inactivation effect was achieved. The experimental results showed that different methods of inactivating enzyme resulted in different degrees of expansion and browning of highland barley. The color change and equivalent radius of highland barley roasted at 175 ℃ for 20 min was the largest, the equivalent radius of highland barley grain was similar after microwave and superheated steam treatment. By observing the electron microscope of highland barley treated with different methods of inactivating enzyme, it could be found that there were gaps and pores in the cross section of grain, and even large holes in vascular bundles. In addition, total phenols (decreased by 14.71%~20.52%) and total flavonoids (decreased by 11.39%~45.15%) decreased significantly after three treatments, and the content of flavonoids and phenols in highland barley roasted at 150 ℃ for 20 min was the lowest. While the effect of microwave treatment on the content of total phenols was lower than the other two treatments, and the effect of superheated steam treatment on the content of total flavonoids was the least. But DPPH free radical scavenging rate, ABTS+ scavenging rate and antioxidant activity increased except microwave treatment. However, the change trend of antioxidant capacity of highland barley after different enzyme inactivation treatments was not completely consistent with the change trend of total phenol and total flavonoids. Under the treatment conditions of enzyme inactivation rate of 50% and 60%, the antioxidant capacity of highland barley treated with superheated steam was the highest, followed by roasting treatment, and the antioxidant capacity of microwave treatment was the lowest. In summary, it can be concluded that the three treatments can be used to inactivate enzyme and can effectively improve the nutritional quality of highland barley. However, the comprehensive evaluation shows that superheated steam treatment is the best choice among the three treatments.
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Keywords:
- black highland barley /
- methods of inactivating enzyme /
- phenols /
- flavonoids /
- antioxidant capacity
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青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook f.）属禾本科小麦族大麦属一年生草本植物，因其内外颖壳分离，籽粒裸露也称为裸大麦。青稞是我国青藏高原地区最主要的作物，主要分布在4200~4500 m的高寒地区，包括西藏、青海、甘肃省（甘南）、四川（甘孜州和阿坝州）和云南（迪庆）。作为我国产量最小的主食粮和产量最大的粗粮，青稞因其较高的营养价值受到消费者的广泛认可[1]。青稞具有“三高两低”的营养特性，即高蛋白、高纤维、高维生素和低脂肪、低糖，是一种优质的谷类作物。黑青稞因富含多酚类物质具有较好的自由基清除和抗氧化作用，其多酚类物质主要包括酚酸、类黄酮、聚黄酮等几大类，其中酚酸、黄酮是抗氧化能力的主要来源[2]。多酚类化合物的类型、含量和活性因青稞颜色、基因型的不同而有较大差异，黑色青稞含有最多的酚类化合物，对细胞增殖的抑制作用最强[2]。
青稞脂酶活性较高，在青稞的贮藏和加工过程，易导致脂质氧化和水解，发挥主要作用的脂酶包括脂肪酶和过氧化物酶[3]。青稞的不稳定性是制约青稞高效利用的重要因素，因此需要通过灭酶处理来降低脂肪酶活性防止脂质水解，延长储藏时间。热处理利用高温破坏酶的高级结构，导致酶活性降低甚至失活，是谷物常用的灭酶处理方法[4]，包括炒制、蒸煮、微波、红外以及过热蒸汽等。炒制处理作为一种较为传统的热处理方法，操作简单，设备成本较低，但加热时间长，对谷物籽粒结构破坏严重；微波技术的加热机制是是将电磁能转化为热能，均匀快速地加热食品基质，有效缩短加工时间[5]；过热蒸汽处理作为一种新型的热稳定技术，在加热时将对流干燥室中的热空气替换为过热蒸汽，所以，在相同压力下，过热蒸汽的温度更高，焓值更低，比饱和蒸汽或热空气的加热效率更高[6]。其次，过热蒸汽处理创造一个无氧环境，显著降低样品在处理过程中发生的氧化降解。这三种处理均已应用于燕麦[7]、麦麸[8]、大米[9]和青稞[10]等谷物的脂酶的灭活。
然而，青稞在热处理过程中会发生复杂的化学变化，包括美拉德反应和热解反应，这些反应产物会影响谷物色泽和结构，同时，加热会对青稞中的热敏性的功能性成分产生影响，比如酚类物质[11]。系统了解不同的灭酶方式对青稞中酚类物质等功能性成分的影响，对于青稞功能特性的发挥及产业应用具有十分重要的意义。由于微波处理、炒制处理及过热蒸汽处理加热机制不同，达到相同灭酶效果时所需热处理的时间及温度也各不相同。目前对比分析微波处理、炒制处理及过热蒸汽处理对青稞的总酚、总黄酮及其抗氧化能力的影响程度的相关研究还未见发表。
因此，本研究以富含酚类物质的黑青稞籽粒为原料，采用炒制、微波和过热蒸汽处理对青稞进行灭酶处理。考察青稞脂肪酶和过氧化物酶的失活效果达到相同水平时，三种灭酶方式处理的青稞其籽粒结构、营养组成、多酚类物质及其抗氧化能力的差异，以期为青稞营养健康食品的开发、活性成分在加工中的保持提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
实验所用青稞 由西藏农业科学院提供，品种：芶芒紫，2019年收获，初始水分含量为10.34%；总淀粉试剂盒 购自爱尔兰Megazyme公司；硫酸铜、硫酸钾 购自上海麦克林生化科技有限公司；硼酸 购自江苏艾康生物医药研发有限公司；氯化钠、氢氧化钠、碳酸钠、硫酸、酚酞、甲醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、正己烷、三氯化铝、过硫酸钾 均购自国药集团化学试剂北京有限公司；乙醇 购自北京化工厂；甲醇 购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；福林酚 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯仿 购自西陇化工股份有限公司；没食子酸、芦丁、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、ABTS标品 均购自美国Sigma公司；过氧化物酶试剂盒 购自北京佰凯生物科技有限公司；总抗氧化能力试剂盒 购自北京雪杰特科技有限公司。
EM-L520P微波炉 惠而浦（中国）股份有限公司；CER-101咖啡烘焙机 韩国GENE CAFÉ公司；KQ-500DE超声仪 江苏昆山市超声仪器有限公司；DHP-9502电热鼓风干燥箱 上海左科仪器设备有限公司；TU-1900紫外可见分光光度计 北京普析仪器有限公司；GABA mill精米机 日本佐竹机械有限公司；GL-20G-II离心机 上海安亭科学仪器厂；SKD-1000自动定氮仪 上海沛欧分析仪器有限公司；SZC-C脂肪测定仪 上海纤检仪器有限公司；Stemi 508体式显微镜 卡尔·蔡司股份公司；SCIENTZ-10N冻干机 宁波新芝生物科技有限公司；SU8010扫描电子显微镜 日本日立高科技公司；RETSCH MM400冷冻研磨机 德国Retsch技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
黑青稞预先进行挑选除杂，称取400 g饱满均匀的青稞籽粒。为降低调质润水时间，使用精米机进行适度碾磨去皮处理。通过控制碾磨次数来调整青稞碾磨度，分离皮层粉和青稞，由于水分活度高物料的酶失活率更高，一般为了达到更好的灭酶效果，需要经调质后增加水分活度，前期预实验结果显示，25%的水分既能高效灭酶又降低能耗。另外，为了减少过长时间的调质造成谷物微生物污染以及减少前处理时间，通过前期的预实验发现，碾磨掉5%的外皮层的可显著降低调质时间（6±0.5 h）；因此，将碾磨度5%的青稞进行润麦，调整籽粒水分至25%之后进行后续不同灭酶处理，并将未润麦青稞设为对照组（Untreated）。根据前期的预实验，获得可使脂肪酶和过氧化物酶的失活效果达到相同水平的处理参数，具体操作如下。
微波处理：将100 g样品平铺于保鲜盒中，放于微波炉中，采用600 W微波分别处理2.5和3 min，分别标记为M-600-2.5和M-600-3，晾至室温后装袋密封保存。
炒制处理：将200 g青稞放入咖啡豆焙炒机，分别于150 和175 ℃处理20 min，分别标记为R-150-20和R-175-20，晾至室温后装袋密封。
过热蒸汽处理：过热蒸汽加工设备由中国农业大学谷物科学实验室提供。首先将处理室预热至160 ℃，蒸汽速度设为15.0 m3/h，将150 g青稞均匀铺于进样器的金属网上，当处理室温度达到设定温度后将装有青稞样品的进样器传送至处理室，立刻开始计时，处理完毕后取出晾至室温，装袋密封保存。经过160 ℃处理9和12 min的青稞分别标记为SS-160-9和SS-160-12。
经上述热处理的黑青稞籽粒在阴凉处风干至青稞籽粒原始水分含量水平（9.98%±0.05%，DW），4 ℃冰箱储存备用。另取200 g青稞使用冷冻研磨机粉碎后过60目筛，4 ℃保存用于后续指标测定。每个实验条件进行两次平行处理。
1.2.2 脂肪酶及过氧化物酶活性测定
根据GB/T 5523-2008《粮油检验 粮食、油料的脂肪酶活动度的测定》测定青稞的脂肪酶活。青稞脂肪酶灭酶率的计算方法见式（1）：
灭酶率(%)=处理前酶活−处理后酶活处理前酶活×100 (1) 使用过氧化物酶试剂盒进行过氧化物酶活测定，具体测定方法见试剂盒说明书。过氧化物酶灭活率计算方法同式（1）。
1.2.3 籽粒几何参数及微观结构观察
使用游标卡尺确定青稞的尺寸，在测量前选择粒径较统一的青稞进行测量，记录 5 次观测的平均值。图1显示了青稞的几何尺寸，籽粒长、宽和厚度分别标记为l，w和d。考虑到青稞籽粒的非球形性，在计算中使用了等效半径。其算术平均直径（Am）、几何平均直径（Gm）、平方平均直径（Sm）和等效半径（r）使用计算公式获得，见公式（2）~公式（5）：
Gm=3√l×w×d (2) Am=l+w+d3 (3) Sm=3√l×w+w×d+l×d3 (4) r=12×Gm+Am+Sm3 (5) 选取有代表性的青稞籽粒在体式显微镜观察不同处理后表观形态变化并拍照。参照Nair等[12]的方法观察处理前后的青稞微观结构，用剃须刀片将冷冻干燥后的青稞籽粒沿其横截面轴分开，尽量避免刀片与内部胚乳组织接触。使用双面胶将其固定在铝条上，断裂面朝上，经过镀膜处理后使用扫描电子显微镜（SEM）在10 kV观察其微观结构，与未处理组进行对照。
1.2.4 基本营养成分测定
青稞籽粒水分含量依据GB 5009.3-2016的方法进行测定；蛋白质含量按照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行测定；样品中脂肪含量按照GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法进行测定；样品中总淀粉含量采用Megazyme试剂盒测定。
1.2.5 酚类物质提取
酚类物质的提取参考张芯蕊等[13]的方法并做部分调整。准确称取1.00 g青稞粉置入30 mL 70% 酸化甲醇（0.1% HCl，v/v）中，超声提取1 h，超声过程中放置冰块防止提取液升温，12000 r/min 离心30 min，收集上清液，残渣使用相同的提取方法重复提取，合并上清液进行总酚、总黄酮及抗氧化能力分析。
1.2.6 总酚含量测定
总酚含量采用福林酚比色法测定[13]。分别吸取200 μL上述提取物和不同浓度没食子酸标准液添加到1.5 mL新鲜稀释（10倍）的Folin-Ciocalteu试剂中。混合物平衡5 min后与1.5 mL碳酸钠溶液（60 g/L）混合，25 ℃下避光培养90 min后，在725 nm处读取混合物的吸光度。以酸化甲醇为空白，计算各样品的总酚含量（TPC）含量，结果表示为每mg没食子酸当量/g青稞粉干重（mg GAE/g DW）。以质量浓度C（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。标准曲线：y=5.5360x−0.0246，R2=0.998。
1.2.7 总黄酮含量的测定
总黄酮含量采用三氯化铝比色法测定[14]。分别吸取2.4 μL上述提取物和芦丁标准溶液与28 μL 25% NaNO2混合，混匀后反应6 min，加入28 μL 10% AlCl3·6H2O反应5 min，加入120 μL 1 mol/L NaOH，25 ℃下避光培养20 min，在510 nm处测定吸光度。以酸化甲醇为空白，计算各样品的总黄酮含量（TFC）含量，结果表示为每mg芦丁当量/g青稞粉（mg RE/g DW）。根据测量标准使用液所产生吸光度，求得吸光度与浓度关系的一元线性回归方程。以质量浓度C（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。标准曲线：y=0.4826x+0.0138，R2=0.998。
1.2.8 抗氧化能力测定
1.2.8.1 DPPH自由基清除率测定
参照秦晶晶等[15]的方法，取1 mL样品提取物与1 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液混合，室温下避光静置30 min，在517 nm处测定吸光度。同时以等量乙醇溶液作为空白对照（即1 mL的0.2 mmol/L DPPH溶液与1 mL的无水乙醇溶液混合后反应），并测定1 mL的无水乙醇溶液与1 mL不同浓度的样品液的混合液的吸光度为A0。根据下面的公式计算清除率：
清除率(%)=(1−A1−A0A2)×100 (6) 式中：A2表示1 mL DPPH中加入1 mL的无水乙醇的吸光度；A1表示1 mL DPPH中加入1 mL 各样品溶液的吸光度；A0表示1 mL无水乙醇中加入1 mL各样品液的吸光度。
1.2.8.2 ABTS自由基清除率测定
将7.4 mmol/L ABTS溶液与2.6 mmol/L过硫酸钾溶液按体积比1:1混合，室温避光静置12~16 h，用乙醇稀释至在734 nm处吸光度值为0.70±0.02，备用。取50 μL样品溶液与200 μL ABTS自由基溶液混合，避光静置30 min，于420 nm 处测定吸光值[16]，清除率计算方法同式（6）。
1.2.8.3 总抗氧化能力测定
采用抗氧化试剂盒（ELISA Kit）测定不同灭酶处理后黑青稞提取物的总抗氧化能力，具体操作方法参见试剂盒说明书。
1.3 数据处理
试验中每个处理均重复3次，数据以均值±标准差的形式表示。利用Excel、SPSS 22软件进行数据分析处理、Tukey方法多重比较和Pearson相关分析，采用Origin 2018软件制图。
2. 结果与分析
2.1 不同灭酶方式对青稞脂肪酶及过氧化物酶灭活率的影响
青稞在加工及贮藏过程中易由内源酶引发脂质氧化和水解导致产品迅速变质。为了保持青稞及其产品的品质稳定，需要对引起哈败的酶类进行钝化处理。酶作为一种蛋白质，其失活的主要原因是由于非共价键（如氢键、疏水相互作用和三级蛋白质结构的离子键）的重排或破坏而引起的变性[17]。如图2所示，热处理对脂肪酶和过氧化物酶影响显著（P<0.05），但是不同处理方式、时间和温度的变化导致灭酶效果的差异。温度越高、时间越长越有利于将青稞中脂肪酶灭活。600 W微波处理2.5 min、150 ℃炒制20 min及160 ℃过热蒸汽处理9 min的样品灭酶率均达到50%左右，而继续增加处理强度时，即600 W微波处理3 min、175 ℃炒制20 min及160 ℃过热蒸汽处理12 min的样品灭酶率均达到60%左右。微波钝化酶的机制主要是通过降低谷物的水分活度，抑制脂肪酶的催化活力[4]，延长微波处理时间后脂肪酶灭活率从48.61%增加到60.41%。在过热蒸汽处理过程中，过热蒸汽均匀喷洒在物料表面，与物料接触进行热交换达到钝化酶的目的，过热蒸汽处理后青稞的脂肪酶活性显著降低，酶灭活率范围从48.19%增加到59.76%。然而，这三种处理都没有完全钝化脂肪酶，可能是部分脂肪酶类，比如磷脂酶、脂酶、糖酶等耐热性极强，难以钝化[10]。另一方面，青稞中的脂肪酶活性较低，无法完全灭活。这与荞麦脂肪酶含量过低不能完全灭活的研究结果一致[18]。
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图 2 不同灭酶方式对青稞脂肪酶（A）及过氧化物酶（B）灭活率的影响Figure 2. Effect of different methods of inactivating enzyme on inactivation rate of lipase （A） and peroxidase （B） of highland barley相较于脂肪酶，过氧化物酶对热更加敏感并易于灭活，图2B显示了在不同温度和处理时间下，用微波、炒制及过热蒸汽处理青稞的过氧化物酶的灭活率。除在600 W微波处理2.5 min样品有酶活残余之外，其他处理后青稞过氧化物酶灭活率均达100%。这与Wang等[10]的研究结果一致，过热蒸汽处理6 min即可使过氧化物酶全部失活。Head等[19]还报道了低温过热蒸汽（110~160 ℃）可有效灭活燕麦碎粒中的过氧化物酶，并且过热蒸汽处理的燕麦碎粒具有良好的储存稳定性。另外，在实验室前期的研究中发现，在炒制处理及微波处理的最适条件（180 ℃，20 min；700 W，120 s）下进行灭酶处理，青稞过氧化物酶的失活率均达到100%[20]。
2.2 不同灭酶方式对青稞籽粒形态及微观结构的影响
谷物的外观是与商品消费直接相关的重要的参数之一，可用青稞籽粒的几何特征（长轴、短轴和等效半径）表示（表1）。结果显示三种灭酶处理均使籽粒的几何尺寸显著增加（P<0.05）。除了过热蒸汽处理外，其他处理籽粒膨胀的程度均随着处理强度的增加而逐渐增加，在脂肪酶灭活率为50%的三种处理样品中，三种处理无显著性差异；而在脂肪酶灭活率为60%的三种处理中，R-175-20的等效半径最大。谷物膨化的原理是物料内部的液体成分（主要是水）汽化，在压力差作用下，使物料膨胀，高分子物质结构变性，形成疏松的网络骨架组织结构，最终定型为多孔状物质[21]，这也说明炒制处理温度最高且处理时间最长，水蒸气在籽粒内部充分汽化，导致籽粒膨胀程度最大。
表 1 不同灭酶方式对青稞的几何参数的影响Table 1. Effects of different methods of inactivating enzyme on geometric parameters of highland barley组别 l（mm） w（mm） d（mm） Am（mm） Gm（mm） Sm（mm） r（mm） Untreated 5.88±0.24a 3.54±0.28a 2.21±0.18a 3.88±0.12a 3.58±0.12a 2.4±0.05a 1.64±0.05a M-600-2.5 6.44±0.26bcd 4.16±0.12b 2.92±0.21bc 4.50±0.06b 4.27±0.04b 2.68±0.02b 1.91±0.02b M-600-3 6.33±0.06b 4.35±0.09c 3.03±0.05bc 4.57±0.04bc 4.37±0.02bc 2.71±0.01b 1.94±0.01b R-150-20 6.58±0.34cd 4.11±0.12b 2.77±0.17b 4.49±0.17b 4.21±0.15b 2.66±0.06b 1.89±0.06b R-175-20 6.82±0.46d 4.42±0.21c 3.06±0.12bc 4.77±0.18c 4.52±0.13d 2.78±0.06c 2.01±0.06c SS-160-9 6.23±0.25ab 4.40±0.04c 3.18±0.19c 4.6±0.12bc 4.43±0.13c 2.73±0.05bc 1.96±0.05bc SS-160-12 6.42±0.25bcd 4.20±0.18b 3.07±0.15bc 4.56±0.15bc 4.36±0.15bc 2.71±0.06b 1.94±0.06b 注：同列数值后不同字母表示不同组之间差异显著（P<0.05）；表2~表3同。 食品体系包含蛋白质、碳水化合物等多种成分，热处理导致食品样品水分活度降低，成分间相互作用加剧，极易发生美拉德和焦糖化反应，导致类棕色甚至黑色的类黑素物质形成，这使得青稞灭酶后可能产生不同程度的褐色。美拉德反应和焦糖化反应程度和速度取决于底物的类型，以及反应时间、温度、水活度等因素[22]。图3A显示了不同灭酶方式青稞色泽与表观形态的变化。脂肪酶灭活率达50%的处理样品中，色泽变化程度无明显差异，而当继续增加处理强度时，R-175-20样品的颜色的变化最为明显。其主要原因是，炒制灭酶过程中，物料受热温度高、加热时间长，发生的美拉德反应程度更加明显。
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图 3 不同灭酶方式对青稞表观形态（A）和微观结构（B）的影响注：A：表面形态，B：微观结构；1~7分别代表未处理青稞、M-600-2.5、M-600-3、R-150-20、R-175-20、SS-160-9、SS-160-12。Figure 3. Effects of different methods of inactivating enzyme on apparent morphology (A) and microstructure (B) of highland barley图3B显示了灭酶处理前后青稞籽粒横截面的微观结构图像。未处理的青稞结构完整光滑，胚乳没有空隙，而经过不同的灭酶加热处理后，截面出现明显缝隙（蓝色箭头），孔隙（红色圈注）及较大的孔洞（黄色箭头），这种结构上变化与热处理过程中水分的汽化密切相关。由于青稞籽粒表面（果皮）无气孔，种皮上有不透水的厚壁组织，胚乳中的水分只能通过维管束中的导管外排[23]，所以此处集中水分汽化引起了孔洞的出现。在脂肪酶灭活率为50%的样品，SS-160-9样品的微管束出现明显凹槽，而M-600-2.5及R-150-20变化较小（图3B）；而当灭酶率达到60%时，除了炒制处理外，M-600-3和SS-160-12样品中均观察到维管处出现明显的孔洞。主要是因为炒制处理加热是一个缓慢加热的过程，物料水分也在缓慢汽化，所以维管束未出现明显凹槽，这也说明维管束导管外排不是炒制处理过程中水分主要散失途径。另外，M-600-3的孔隙由籽粒中心向外周组织逐渐缩小，而炒制处理及过热蒸汽处理相反，这种现象发生的主要原因是微波干燥原理不同，微波作为一种非电离能，它通过交变电磁场中的“分子摩擦”在被穿透的介质内部深处产生热量，促使物料温度升高导致水分由内而外离开物料[24]，而炒制和过热蒸汽处理主要引起青稞表面热诱导变化，籽粒内部水分散失较少。
2.3 不同灭酶方式对青稞基本营养组分的影响
表2显示了黑青稞灭酶处理前后的主要营养组分的变化。由于灭酶是物料的热处理过程，因此，水分含量变化最为显著。为提高青稞灭酶效果，灭酶前青稞的水分含量均被调节为25%。当脂肪酶灭活率为50%时，相比调质后青稞（水分含量为25%），微波、炒制和过热蒸汽处理后青稞的最终含水量分别降低了41.12%、71.28%和50.40%；继续增加处理强度，脂肪酶灭活率达到60%时，炒制处理样品（R-175-20）的水分含量最低（下降至5.23%），微波处理（M-600-2.5）水分降低的最少，其水分含量为14.72%。当达到相同灭酶效率时，微波处理时间最短，因此更长时间的炒制和过热蒸汽对水分的影响远大于微波处理。
表 2 不同灭酶方式对青稞水分、蛋白、脂肪、总淀粉含量的影响Table 2. Effects of different methods of inactivating enzyme on moisture, protein, fat and total starch content of highland barley组别 水分含量（%） 蛋白质含量（%） 脂肪含量（%） 总淀粉含量（%） Untreated 9.98±0.33c 10.43±0.30ab 2.07±0.14a 70.27±0.51ab M-600-2.5 14.72±0.07e 10.36±0.02a 2.05±0.10a 66.34±0.97a M-600-3 14.18±0.17e 10.33±0.07a 2.15±0.23b 69.25±0.88ab R-150-20 7.18±0.17b 10.50±0.37ab 2.14±0.03b 70.88±0.72ab R-175-20 5.23±0.22a 10.77±0.56b 2.18±0.94b 80.72±0.86c SS-160-9 12.40±0.08d 10.44±0.35ab 1.99±0.16a 72.11±0.32b SS-160-12 8.94±0.09bc 10.36±0.18a 2.04±0.04a 71.98±0.46b 对于三大营养物质，当脂肪酶灭活率达50%时，除炒制处理提高了脂肪含量之外（提高了3.38%），其余处理均对三大营养物质无显著影响；当脂肪酶灭活率达60%时，依旧是炒制处理的影响最显著，经175℃炒制处理20 min的青稞蛋白质，脂肪和淀粉含量相较未处理样品分别升高3.26%、5.31%和14.87%，另外，600 W下微波处理3 min使脂肪含量增加了3.86%，而其他处理均对蛋白质，脂肪及淀粉含量无显著影响。这几类营养成分含量的变化主要是因为水分含量的变化导致了蛋白、脂肪和总淀粉在籽粒中占比的变化。与其它两种灭酶方式相比，过热蒸汽处理作为一种湿热处理方法，能较好地保持青稞的成分，这与前人的研究结果一致，这可能是因为设备中的空气被过热蒸汽取代，在相同温度下过热蒸汽具有优于空气的热性能，过热蒸汽的热传导系数和热容量均较高，对样品的热渗透力更强，可实现快速加热[18]，因此在较短时间内，物料温度即可达到过热蒸汽的平衡温度，脂肪酶与过氧化物酶快速失活，在这一过程中营养成分受热的作用时间较短，此外在饱和水蒸气的低氧作用下，营养成分变化程度较低。
2.4 不同灭酶方式对青稞总酚和总黄酮含量的影响
如图4所示，灭酶处理之后青稞总酚含量显著减少，但总酚含量并不随处理强度增加而持续降低。当脂肪酶灭活率达到50%时，微波、炒制和过热蒸汽处理后下降幅度分别为14.71%，20.52%和19.89%；当脂肪酶灭活率升高至60%时，炒制及过热蒸汽处理后下降幅度为19%左右，而微波处理后下降幅度较小（16.52%）。总酚含量的下降主要有三个方面的原因，其一，酚类物质是热敏类物质，热处理使部分酚类物质发生降解[25]；其二，酚类物质的分子结构发生改变，而聚合度的改变会使可萃取能力下降；其三，热处理过程会导致部分青稞淀粉糊化，糊化后的淀粉可能会与酚类物质结合，导致溶出率下降[26]。然而也有研究表明热处理并不总是造成谷物中酚类物质含量下降，热处理会使结合酚类转化为游离酚，从而提高了总酚可检测量[27]。并且具有抗氧化特性的蛋白质-酚类复合产物和美拉德反应产物（MRP，例如吡咯和呋喃）与福林酚试剂发生反应，也可导致测定结果的增加[28]。这也是三种处理青稞总酚含量并未随着处理强度的增加而持续下降的主要原因。
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图 4 不同灭酶方式对青稞总酚（A）和总黄酮（B）的影响Figure 4. Effect of different methods of inactivating enzyme on total phenols content (A) and total flavonoids content (B) of highland barley黄酮也是热敏类成分之一，在处理过程中可能会被破坏。相较未处理青稞，灭酶处理之后总黄酮含量不同程度地降低，三种处理中，过热蒸汽处理对于总黄酮含量的影响最小。在脂肪酶灭活率为50%的样品中，150 ℃炒制处理20 min青稞的总黄酮含量降低的最多（45.15%），其次是微波处理（19.41%）。随着处理强度增加，当脂肪酶灭活率增加至60%时，过热蒸汽处理样品总黄酮含量无明显变化，微波处理继续下降了16.45%，炒制处理青稞的总黄酮含量略有增加。这种变化可能是由于长时间的高温热诱导导致细胞结构降解，游离黄酮类化合物得以释放以及炒制时美拉德反应产物的综合结果。Babiker等[29]研究发现，随着炒制处理时间的延长，大麻种子的总黄酮含量降低后也出现上升的趋势。与炒制处理相比，微波和过热蒸汽处理保留了更多的黄酮类物质，主要原因是微波处理过程时间短，从而降低了样品暴露在氧气中的时间以及受热时间，而过热蒸汽处理过程处理室中无氧状态也可有效减少对黄酮类化合物的损害[30]。
2.5 不同灭酶方式对青稞抗氧化能力的影响
抗氧化能力采用了DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率及总抗氧化能力进行综合判定（见表3）。三种测定方法均表明，除了微波处理，炒制处理和过热蒸汽处理与未处理样品相比，抗氧化性能均显著上升，并随着热处理温度和时间的增加，抗氧化能力逐渐升高。样品中的酚类物质是青稞抗氧化活性的主要来源，但灭酶处理之后TPC和抗氧化能力的相关性下降。这可能是因为灭酶处理过程中发生美拉德反应的产物（MRP）及非酶褐变反应产生的类黑素也具有较强的抗氧化性能[31]。另一方面热改性酚与其他植物化学成分发生的协同效应增加了抗氧化能力，且抗氧化剂和DPPH、ABTS自由基的反应程度取决于抗氧化剂的结构构象，热处理改变了酚类结构，从而改善抗氧化能力[32]。随着处理强度的增加，三种方式处理样品的抗氧化能力显著上升。同时与未处理组相比，不论是脂肪酶灭活率达到50%还是60%，三种灭酶方式处理后的抗氧化能力排序均为过热蒸汽处理>炒制处理>微波处理。过热蒸汽处理12 min后青稞的抗氧化能力增加最多，DPPH和ABTS自由基清除率分别增加了4.94%和23.95%，总抗氧化能力增加了20.73 μmol/g。过热蒸汽处理青稞的抗氧化能力最高的主要原因是，过热蒸汽处理给样品制造一个无氧的加热或干燥环境，避免抗氧化剂在加工过程中被氧化[25]。与微波处理相比，炒制处理表现出更高的抗氧化能力，主要因为炒制处理发生美拉德反应以及酶促褐变程度更高，尤其是在高温下有助于抗氧化活性的类黑素产生的更多，从而抵消了酚类物质降低导致的抗氧化能力的损失[33]，与表观形态和微观结构呈现结果一致。
表 3 不同灭酶方式对青稞的抗氧化能力的影响Table 3. Effect of different methods of inactivating enzyme on antioxidant capacity of highland barley组别 DPPH自由基清除率（%） ABTS自由基清除率（%） 总抗氧化能力（μmol/g） Untreated 92.99±0.11a 6.99±0.11a 137.16±1.72b M-600-2.5 92.99±0.18a 6.41±0.11a 126.34±4.2a M-600-3 94.56±0.26b 10.66±0.3b 139.03±5.09b R-150-20 94.10±0.22b 25.35±0.13c 140.07±8.71b R-175-20 94.50±0.18b 28.01±0.53cd 150.33±8.74bc SS-160-9 97.52±0.06c 28.02±0.76cd 158.35±7.33c SS-160-12 97.93±0.11c 30.94±0.11d 157.89±2.88c 3. 结论
本文比较了不同灭酶方式对黑青稞灭酶效果的影响，考察了达到相同灭酶效果时，不同处理方式对黑青稞的微观结构、营养组成及抗氧化能力的影响。结果表明，脂肪酶相较过氧化物酶更难灭活，过氧化物酶完全失活的处理条件使脂肪酶活性最多降低60%，随着处理强度的增加，脂肪酶灭活率持续上升。在达到相同灭酶效果时，青稞微观结构和物理性质的变化受到灭酶方式影响显著，三种处理中，炒制处理的表观结构及蛋白质、淀粉和脂肪含量最大；微波处理的水分变化最小（降低了41.12%和43.28%）；过热蒸汽处理对蛋白质、淀粉和脂肪含量的影响最小。三种处理后青稞的总酚和总黄酮含量均下降，过热蒸汽处理对总黄酮的影响远小于微波及炒制处理，炒制处理（R-150-20）导致总酚和总黄酮的含量下降的最多，分别下降了20.52%和45.15%。灭酶处理后青稞抗氧化能力有所上升，过热蒸汽灭酶处理的青稞相较其它灭酶方式有更高的抗氧化活性。因此，过热蒸汽处理在稳定化青稞的同时保持了其营养品质，可作为青稞灭酶处理方式的首选。
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图 2 不同灭酶方式对青稞脂肪酶（A）及过氧化物酶（B）灭活率的影响
Figure 2. Effect of different methods of inactivating enzyme on inactivation rate of lipase （A） and peroxidase （B） of highland barley
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图 3 不同灭酶方式对青稞表观形态（A）和微观结构（B）的影响
注：A：表面形态，B：微观结构；1~7分别代表未处理青稞、M-600-2.5、M-600-3、R-150-20、R-175-20、SS-160-9、SS-160-12。
Figure 3. Effects of different methods of inactivating enzyme on apparent morphology (A) and microstructure (B) of highland barley
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图 4 不同灭酶方式对青稞总酚（A）和总黄酮（B）的影响
Figure 4. Effect of different methods of inactivating enzyme on total phenols content (A) and total flavonoids content (B) of highland barley
表 1 不同灭酶方式对青稞的几何参数的影响
Table 1 Effects of different methods of inactivating enzyme on geometric parameters of highland barley
组别 l（mm） w（mm） d（mm） Am（mm） Gm（mm） Sm（mm） r（mm） Untreated 5.88±0.24a 3.54±0.28a 2.21±0.18a 3.88±0.12a 3.58±0.12a 2.4±0.05a 1.64±0.05a M-600-2.5 6.44±0.26bcd 4.16±0.12b 2.92±0.21bc 4.50±0.06b 4.27±0.04b 2.68±0.02b 1.91±0.02b M-600-3 6.33±0.06b 4.35±0.09c 3.03±0.05bc 4.57±0.04bc 4.37±0.02bc 2.71±0.01b 1.94±0.01b R-150-20 6.58±0.34cd 4.11±0.12b 2.77±0.17b 4.49±0.17b 4.21±0.15b 2.66±0.06b 1.89±0.06b R-175-20 6.82±0.46d 4.42±0.21c 3.06±0.12bc 4.77±0.18c 4.52±0.13d 2.78±0.06c 2.01±0.06c SS-160-9 6.23±0.25ab 4.40±0.04c 3.18±0.19c 4.6±0.12bc 4.43±0.13c 2.73±0.05bc 1.96±0.05bc SS-160-12 6.42±0.25bcd 4.20±0.18b 3.07±0.15bc 4.56±0.15bc 4.36±0.15bc 2.71±0.06b 1.94±0.06b 注：同列数值后不同字母表示不同组之间差异显著（P<0.05）；表2~表3同。 
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表 2 不同灭酶方式对青稞水分、蛋白、脂肪、总淀粉含量的影响
Table 2 Effects of different methods of inactivating enzyme on moisture, protein, fat and total starch content of highland barley
组别 水分含量（%） 蛋白质含量（%） 脂肪含量（%） 总淀粉含量（%） Untreated 9.98±0.33c 10.43±0.30ab 2.07±0.14a 70.27±0.51ab M-600-2.5 14.72±0.07e 10.36±0.02a 2.05±0.10a 66.34±0.97a M-600-3 14.18±0.17e 10.33±0.07a 2.15±0.23b 69.25±0.88ab R-150-20 7.18±0.17b 10.50±0.37ab 2.14±0.03b 70.88±0.72ab R-175-20 5.23±0.22a 10.77±0.56b 2.18±0.94b 80.72±0.86c SS-160-9 12.40±0.08d 10.44±0.35ab 1.99±0.16a 72.11±0.32b SS-160-12 8.94±0.09bc 10.36±0.18a 2.04±0.04a 71.98±0.46b
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表 3 不同灭酶方式对青稞的抗氧化能力的影响
Table 3 Effect of different methods of inactivating enzyme on antioxidant capacity of highland barley
组别 DPPH自由基清除率（%） ABTS自由基清除率（%） 总抗氧化能力（μmol/g） Untreated 92.99±0.11a 6.99±0.11a 137.16±1.72b M-600-2.5 92.99±0.18a 6.41±0.11a 126.34±4.2a M-600-3 94.56±0.26b 10.66±0.3b 139.03±5.09b R-150-20 94.10±0.22b 25.35±0.13c 140.07±8.71b R-175-20 94.50±0.18b 28.01±0.53cd 150.33±8.74bc SS-160-9 97.52±0.06c 28.02±0.76cd 158.35±7.33c SS-160-12 97.93±0.11c 30.94±0.11d 157.89±2.88c
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