Stability of Citral Sustained-release Preparation and Its Inhibitory Effect on Aspergillus flavus
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摘要: 本文旨在研究柠檬醛脂质体（Citral Liposome，CL）和柠檬醛-壳聚糖复合脂质体(Citral Liposome-Chitosan，CL-CS)这两种柠檬醛缓释制剂的稳定性及对黄曲霉菌（Aspergillus flavus）的抑菌效果、抑菌机理，为后期开发绿色、高效、安全的柠檬醛缓释抑菌剂提供数据支撑。通过设定不同的温度及pH条件，以外观、粒径、Zeta电位和保留率为指标探究储藏稳定性；用孢子计数法测定柠檬醛缓释制剂的瞬时抑菌率，并分析抑菌长效性；根据细胞通透性变化揭示柠檬醛缓释制剂的抑菌机理。结果表明，两种柠檬醛缓释制剂均具有纳米级粒径且粒径均一，经壳聚糖修饰后，体系Zeta电位由−16.63±1.67变为35.72±3.29。4 ℃条件下储藏28 d后粒径和Zeta电位变化较小，保留率更高，且CL-CS比CL更稳定；pH为4~6时，两种柠檬醛缓释制剂更稳定，CL和CL-CS的粒径别在150和200 nm左右。CL、CL-CS在48 h内对黄曲霉菌的瞬时抑菌EC50分别为77.88和68.20 mg·L−1，继续培养48 h后CL和CL-CS的抑制率分别为67.69%和82.89%，而柠檬醛只有30.26%，表明CL-CS具有良好的瞬时抑菌效果和长效抑菌效果。这两种柠檬醛缓释制剂处理后黄曲霉菌的胞外电导率和核酸含量均升高，说明细胞膜通透性增加，且所需要的作用时间比游离柠檬醛更短。综上，两种柠檬醛缓释制剂具有良好的稳定性，能通过改变细胞通透性、使内溶物渗出，从而抑制黄曲霉菌的生长，且具有长效抑菌能力，CL-CS比CL性能更好，具有开发成植物源防霉剂的潜能。Abstract: To provide data support for the development of green, efficient and safe sustained-release bacteriostatic agent of citral, the stability of the two kinds of sustained-release preparation of citral liposome (CL) and citral liposome-chitosan (CL-CS) and the bacteriostatic effect and mechanism of Aspergillus flavus were investigated. Under the condition of different temperature and pH, the appearance, particle size, Zeta potential and retention rate were studied to explore the storage stability. The instantaneous bacteriostasis rate and long-term bacteriostasis rate of citral sustained-release were determined by spore counting method. The bacteriostatic mechanism of citral sustained-release preparations was revealed according to the changes of cell permeability. The results showed that the two citral sustained-release preparations had uniform nano-sized particle sizes. After chitosan modification, the Zeta potential of the system changed from −16.63±1.67 to 35.72±3.29. After 28 days of storage at 4 ℃, the change of particle size and Zeta potential was small, and the retention rate was higher, CL-CS was more stable than CL. At pH4~6, the two sustained-release preparations were more stable, and the particle sizes of CL and CL-CS were about 150 and 200 nm. The instantaneous inhibitory EC50 of CL and CL-CS against Aspergillus flavus within 48 h were 77.88 and 68.20 mg·L−1, respectively. After 48 h of culture, the inhibitory rates of CL and CL-CS were 67.69% and 82.89%, respectively, while citral was only 30.26%. The results showed that CL-CS had good bacteriostatic effect and long-term bacteriostatic effect. The extracellular conductivity and nucleic acid content of Aspergillus flavus both increased after treatment with the two kinds of sustained release preparations, indicating that the permeability of cell membrane increased and the action time was shorter than that of free citral. In conclusion, the two kinds of sustained-release preparations have good stability. They inhibited the growth of Aspergillus flavus by the change of cell permeability and the leak of insoluble substance. The properties of CL-CS was better than CL, and it would have the potential to be developed as plant source mildew inhibitor.
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Keywords:
- citral /
- liposomes /
- Aspergillus flavus /
- sustained-release /
- stability
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黄曲霉菌（Aspergillus flavus）是自然界中常见的病原真菌，能污染花生、大米、玉米等粮食作物，其产生的次级代谢产物黄曲霉毒素是强致癌物质，被黄曲霉菌污染的食品存在严重的食用安全隐患[1-2]。常用的化学抑菌剂具有毒性且容易产生药剂残留，化学抑菌剂能通过污染粮食等进入食物链，容易危害人体健康[3]。因此，迫切需要找到绿色、高效的方法对黄曲霉菌进行有效防控。
柠檬醛是山苍子精油、柠檬草精油等的主要成分，是开链单萜类化合物最重要的代表之一。柠檬醛具有抑菌、消炎等功能，对细菌、真菌的生长繁殖有高效广谱的抑制作用[4]。目前，研究人员对柠檬醛抑制黄曲霉菌的研究较少，本人前期的研究发现，柠檬醛对黄曲霉菌的生长和产毒表现出良好的抑制能力，EC50为163.65 mg·L−1[5]，柠檬醛可以作为黄曲霉菌抑菌剂开发使用。然而，柠檬醛易分解、易挥发且不溶于水，这些不足限制了柠檬醛在食品、药品等领域的进一步应用和推广[6]。脂质体技术已广泛应用于医药、食品等行业，该技术可以提高活性成分的稳定性，保护其不受外界环境的影响[7]，同时缓慢释放，延长活性成分的作用时间，达到长效抑菌的目的。利用脂质体技术制备柠檬醛缓释制剂能弥补柠檬醛在应用上的不足之处，具有广泛的应用和开发前景。
缓释制剂的稳定性是衡量其好坏的重要指标之一，温度和pH是影响缓释制剂的关键因素[8]。壳聚糖是一种天然的高分子广谱抑菌材料，通过静电吸附包裹在脂质体表面，形成复合结构，能起到保护和抑菌协同双重作用。为此，本研究采用乙醇注入法制备两种缓释制剂，即柠檬醛脂质体（Citral Liposome，CL）和柠檬醛-壳聚糖复合脂质体（Citral Liposome-Chitosan，CL-CS）；重点分析温度和pH对缓释制剂稳定性的影响，同时，以黄曲霉菌为目标菌，研究柠檬醛缓释制剂对其生长的长效抑制作用，并对其抑菌机理做了初步分析，以期为天然柠檬醛缓释制剂的开发应用和对黄曲霉菌的抑制防控奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
卵磷脂（>98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胆固醇（≥99.0%） 北京索莱宝科技有限公司；壳聚糖（<200 mPa.s） 上海麦克林生化科技有限公司；天然柠檬醛（>96%） 江西麻山化工有限公司；黄曲霉菌CGMCC 3.4408 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；醋酸、正己烷等 分析纯，购于西陇科学股份有限公司。
OSB-2200旋转蒸发仪 日本EYELA（东京理化）东京理化器械株式会社；BI-ZR5纳米粒度分析仪 美国布鲁克海文公司；S10-3恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；TU1950紫外分光光度计 上海普析通用仪器有限责任公司；DDS-307电导率仪 上海仪电科学有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 柠檬醛脂质体（CL）和柠檬醛-壳聚糖复合脂质体（CL-CS）的制备
CL的制备：采用乙醇注入法[9]制备。精确称取100 mg卵磷脂和15 mg胆固醇，加入5 mL无水乙醇，完全溶解后加入15 mg柠檬醛，随后将溶液均匀缓慢的滴入20 mL预热温度为50 ℃的0.01 mol·L−1磷酸盐缓冲液PBS（含0.5%的吐温80）中，常温下继续水化30 min。再置于旋转蒸发仪上蒸发除去无水乙醇，即得到柠檬醛脂质体。用等量的蒸馏水代替柠檬醛制备空白柠檬醛脂质体（空白CL）。
CL-CS的制备：参考程铭等[10]的方法，称取0.1 g的壳聚糖粉于100 mL蒸馏水中，一边搅拌一边缓慢滴加醋酸，醋酸的终浓度为0.05 mol·L−1，制备得到1%壳聚糖醋酸溶液，然后缓慢匀速加入到等体积的柠檬醛脂质体中，再缓慢搅拌一段时间，即得柠檬醛-壳聚糖复合脂质体（CL-CS）。将1%壳聚糖醋酸溶液，缓慢匀速加入到等体积的空白柠檬醛脂质体中，得到空白柠檬醛-壳聚糖复合脂质体（空白CL-CS）。
1.2.2 粒径、PDI及Zeta电位的测定
待测物经PBS适当稀释后，用纳米粒度分析仪测定其粒径、多分散性指数（PDI）和Zeta电位。设定纳米粒度分析仪的散射角度为90°，温度为25 ℃，循环测定样品三次。
1.2.3 稳定性实验
1.2.3.1 储存稳定性
将CL、CL-CS分别放置于4和25 ℃条件下，比较储存0、7、14、21、28 d后缓释制剂的外观形态、保留率、粒径和Zeta电位变化情况。
1.2.3.2 pH稳定性
将脂质体溶液的pH分别用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，然后将其放置于4 ℃条件下于24 h后测定平均粒径和保留率变化情况。
1.2.3.3 外观形态
肉眼观察目标物状态，是否发生絮集。
1.2.3.4 粒径和Zeta电位
待测物经PBS适当稀释后，用纳米粒度分析仪测定其粒径、多分散性指数（PDI）和Zeta电位。设定纳米粒度分析仪的散射角度为90°，温度为25 ℃，循环测定样品三次。
1.2.3.5 柠檬醛保留率测定
柠檬醛含量标准曲线绘制：配制柠檬醛-二氯甲烷溶液，以二氯甲烷为空白参比，精确称取一定量的柠檬醛并置于50 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容。分别吸取10、20、30、40、50 μL稀释液移入另一个10 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容，通过紫外可见分光光度计分别测定不同浓度柠檬醛-乙醇溶液在最大吸收波长处的吸光度根据各吸光度数值，可得到浓度与吸光度的关系方程，即柠檬醛的标准曲线方程y=70.28x+0.0169，R2=0.9991。
柠檬醛含量的测定：取1 mL样品，加入5 mL二氯甲烷，振荡3 min，4000 r/min离心10 min，用紫外分光光度计测量其在最大吸收波长处的吸光度，再根据标准曲线方程计算柠檬醛含量。
保留率（%）=储存一段时间后柠檬醛含量/初期柠檬醛含量×100
1.2.4 体外抑菌性能研究
采用孢子计数法[5]比较游离柠檬醛（C）、柠檬醛脂质体（CL）、柠檬醛-壳聚糖脂质体（CL-CS）、壳聚糖（CS）对黄曲霉菌的抑制强弱。将C、CL、CL-CS和CS分别加入培养基中，其中保持柠檬醛添加量一致，分为90、180、360、720和1440 mg·L−1，不封口26 ℃条件下培养48 h，孢子计数，计算EC50。为研究抑菌的长效性，在培养48 h后，在含有360 mg·L−1的培养基上再涂布黄曲霉菌孢子，不封口48 h后观察孢子生长情况。
1.2.5 抑菌机理研究
1.2.5.1 菌丝胞外电导率的测定
取对数期的黄曲霉菌菌丝2 g，用去离子水冲洗后，分别加入到C、CL、CL-CS和CS中（保持柠檬醛添加量一致，浓度为360 mg·L−1），分别每隔10 min后用电导率仪测定菌丝的相对渗透率，每个样品重复3次，以无菌水作为对照。
计算公式：相对渗漏（%）=（Ct−C0）/C×100
式中：Ct-t时间时溶液的电导率值；C0-初始电导率值；C-热处理后溶液的电导率值。
1.2.5.2 菌丝胞外核酸含量的测定
参照Pereira等[11]的方法。取对数期的黄曲霉菌菌丝2 g，用去离子水冲洗后，分别加入到C、CL、CL-CS和CS（保持柠檬醛添加量浓度均为360 mg·L−1），分别每隔10 min，取部分溶液离心（3000 r/min，5 min），收集上清液，在260 nm下检测其吸光值。
1.3 数据处理
实验结果数据取3个平行实验的平均值，采用Microsofe Excel 2007和DSP7.05建立毒力回归方程。采用T检验分析差异性，显著性水平设置为P<0.05，通过SPSS 20.0程序完成统计分析。
2. 结果与分析
2.1 脂质体结构表征
用紫外分光光度计对柠檬醛200~600 nm范围进行扫描，获得柠檬醛的最大吸收波长为238 nm，如图1。
粒径的大小及分布是衡量纳米脂质体质量优劣及稳定性的重要指标，通常用平均粒径来表示，粒径的分布情况用PDI来表示，PDI数值在0~0.3之间表明体系具有均匀的分散性，数值越小，分散性越好，粒径分布越集中[12]。脂质体粒径大小和分布的结果如表1所示，CL和CL-CS的粒径分别为127.63±2.06和200.33±9.96 nm，均为纳米级别。CL和CL-CS的平均粒径比空白组大，这是由于脂质体内包埋了柠檬醛。实验组的PDI均比空白对照组大，可能是由于脂质体形成过程中由于柠檬醛的插入导致粒径不均匀，粒径分布范围较宽，体系稳定性相对较差。
表 1 平均粒径、PDI以及Zeta电位Table 1. Average particle size, PDI and Zeta potential样品 平均粒径（nm） PDI Zeta电位（mV） 空白柠檬醛脂质体（空白CL） 104.69±3.38 0.074±0.009 −15.31±1.72 柠檬醛脂质体（CL） 127.63±2.06 0.137±0.039 −16.63±1.67 空白柠檬醛-壳聚糖复合脂质体（空白CL-CS） 137.29±7.15 0.197±0.066 38.31±2.18 柠檬醛-壳聚糖复合脂质体（CL-CS） 200.33±9.96 0.241±0.024 35.72±3.29 壳聚糖带正电荷，修饰后体系电位由负变为正，且大于30 mV，表明壳聚糖使体系的稳定性增加。
2.2 储藏稳定性结果
2.2.1 储藏中外观形态的变化
表2显示的是CL和CL-CS的储藏情况，CL和CL-CS分别在4和25 ℃下放置28 d。结果显示，在4 ℃条件下储藏的整体稳定性相对较好，CL-CS能稳定储藏28 d，CL在28 d（第4周）出现少量沉淀和絮凝，经振摇可复原，均匀性良好。而CL在25 ℃条件下第二周就出现絮状物，比4 ℃条件下提早半个月出现不稳定情况。CL-CS的储藏情况比CL稳定一些，25 ℃下能稳定储藏21 d（3周）。
表 2 储藏期间外观观察Table 2. Appearance observation during storage样品 储藏时间（d） 0 7 14 21 28 4 ℃ CL 澄清 澄清 澄清 澄清 絮状物，
振摇可复原。4 ℃ CL-CS 澄清 澄清 澄清 澄清 澄清 25 ℃ CL 澄清 澄清 絮状物，
振摇可复原絮状物，
振摇可复原底部有沉淀 25 ℃ CL-CS 澄清 澄清 澄清 澄清 絮状物 储藏期间外观观察的实验结论是：总体上看，4 ℃条件比25 ℃条件储藏更稳定，CL-CS比CL更稳定；但是在4 ℃条件储藏时两者稳定性相差不大。
2.2.2 储藏中粒径和Zeta电位的变化
图2显示，在储存期间缓释制剂的粒径有不同程度的变大，这是因为缓释制剂颗粒发生了聚集融合现象，这主要集中在贮藏初期。在前7 d里，CL-CS的粒径变化比CL明显，从200 nm左右增大至280 nm左右，结合Zeta电位变化图，在这期间里Zeta电位下降明显，从35 mV的稳定态降至20 mV左右的不稳定状态，这可能是由于游离的壳聚糖继续包裹在脂质体表面，壳聚糖分子间缠绕增多、摩擦力增大形成无规则线圈，脂质体之间由范德华力导致的引力位能大于静电斥力导致的斥力位能，体系稳定性降低，两个或更多的小脂质体聚集形成大脂质体[13]，而7 d后Zeta电位有稍许下降，但是粒径却基本维持不变，没有继续增大，可能是体系里面存在吐温80，它作为非离子型表面活性剂，在脂质体表面产生空间位阻效应，在一定程度上维持了体系的稳定[14]。
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图 2 储藏期间的粒径和Zeta电位变化情况注：不同小写字母表示缓释制剂在不同储藏时间的粒径和电位差异显著（P<0.05）。Figure 2. Variation of particle size and Zeta potential during storageCL的储藏期间，粒径基本保持在150 nm以下，前7 d内粒径小范围增大，随后基本保持稳定，在第21~28 d里25 ℃储藏的CL粒径稍许增加，这可能和粒径以及温度有关。因为CL的粒径比CL-CS小，粒径越小，曲率半径越大，此时会暴露较多的磷脂的酰基链，体系中的吐温能通过头部基团的疏水作用促进磷脂双分子层的融合，温度越高，所需能量越小，有利于融合，因此温度高时粒径小的CL后期变化程度较大[15]。而同条件下的CL-CS未出现该情况，原因可能是通过壳聚糖大分子与脂质体表面膜的电荷作用，在膜表面可形成具有一定结构的保护层，可控制囊泡之间的胶体相互作用，提高脂质体的动力学稳定性，显著改善脂质体的体外稳定性[16]。
2.2.3 储藏中保留率的变化
储藏期间柠檬醛的保留率如图3所示，总体上看，随着储藏时间的延长，CL和CL-CS的保留率持续下降，7 d后保留率已降至90%以下，28 d后保留率不足20%。此外，温度越高，柠檬醛泄露越快，储藏14 d里，25 ℃条件下的保留率降低较快，柠檬醛的保留量仅为初始的一半。因为温度越高，双分子层的流动性越强，通透性也相应增大，导致柠檬醛泄漏更快。从图3中还可以看出，经壳聚糖修饰的脂质体内柠檬醛的保留率相对较高，但是效果不明显，原因可能是壳聚糖在脂质体表面形成了保护层，使体系更稳定。
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图 3 不同温度下柠檬醛的保留率注：不同小写字母表示同一时间不同缓释制剂的保留率差异显著（P<0.05）。Figure 3. Retention rate of citral at different temperatures综合粒径、Zeta电位和保留率的结果来看，4 ℃条件下储藏能最大程度保证其稳定性。
2.3 pH稳定性结果
环境中的pH会影响磷脂的水解，改变脂膜的通透性，同时会影响粒子表面电荷，引起聚集，影响脂质体的稳定性，导致活性物质的泄露[17]。实验结果如图4A所示，CL在pH为2.0时溶液出现絮凝沉淀，因为环境中H+过多时会中和CL表面的负电荷，破坏磷脂双分子层结构，体系不稳定[18]。随着pH的增大，CL越稳定，但是粒径逐渐增大。而CL-CS在pH为2~4时表现出良好的分散性，可能是因为壳聚糖表面带正电，更稳定。但是当pH大于6时，粒径变大，出现聚集。当溶液pH为6时，达到壳聚糖的等电点，粒子表面的静电作用不足以维持结构稳定[19]。根据保留率的结果，过酸、过碱都会使得CL和CL-CS发生泄漏，保留率均比较低（图4B）。因此，在柠檬醛缓释制剂的实际应用过程中要注意环境的pH，过酸、过碱会影响缓释制剂的作用效果。
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图 4 不同pH条件下的稳定性结果注：不同小写字母表示同种缓释制剂在不同pH条件下的粒径和保留率差异显著（P<0.05）。Figure 4. Stability results under different pH conditions2.4 CL和CL-CS的体外抑菌性能结果
为考察缓释制剂的速效性和长效性，本实验将黄曲霉菌孢子悬浮液分别涂抹在含不同浓度的C、CL、CL-CS的培养皿内，培养48 h考察抑菌速效性，然后在不长黄曲霉菌的培养皿里继续涂抹孢子悬浮液，考察抑菌长效性。
表3是C、CL、CL-CS在48 h内瞬时抑菌结果，EC50分别为163.65、77.88和68.20 mg·L−1。当浓度为90 mg·L−1时，游离柠檬醛（C）的抑菌率仅为3.82%±2.28%，缓释制剂的抑菌率明显更强，抑菌率达到50%左右；当浓度为360 mg·L−1时，CL和CL-CS能完全抑制黄曲霉菌孢子的生长，而游离柠檬醛的培养基上依然还有若干菌落生长。低浓度时，CL和CL-CS对黄曲霉菌的抑制率高于柠檬醛，说明柠檬醛缓释制剂能更好地作用于黄曲霉菌，原因可能是缓释制剂的溶解度更高，生物亲和性高。CL-CS与CL相比抑菌效果更好，可能是由于壳聚糖的抑菌协同作用造成的。成方圆[20]研究了肉桂醛脂质体及其壳聚糖修饰物的抑菌能力，结果发现经过壳聚糖修饰后体系的抑菌速率加快，且第5 d时，向体系中继续加入目标菌后，壳聚糖修饰的肉桂醛脂质体体系的抑菌能力未减弱，本实验的分析结果与该结果一致。
表 3 CL和CL-CS对黄曲霉菌的瞬时抑制作用Table 3. Instantaneous inhibition of CL and CL-CS on Aspergillus flavus化合物 抑菌率（%） 毒力方程 EC50(mg·L−1) 90 mg·L−1 180 mg·L−1 360 mg·L−1 720 mg·L−1 1440 mg·L−1 C 3.82±2.28 60.23±9.21 97.2±2.74 100 100 y=6.0740x−8.4473 163.65 CL 41.82±2.03 85.51±2.26 100 100 100 y=4.7684x−4.019 77.88 CL-CS 51.12±2.11 90.66±1.69 100 100 100 y=4.5256x−3.299 68.20 图5显示的是首次培养48 h后，在抑菌物质浓度为360 mg·L−1的培养皿上再接种黄曲霉菌孢子悬浮液，然后继续培养48 h后的结果。C、CL和CL-CS的抑制率分别为30.26%、67.69%和82.89%，实验过程中没有密封培养皿，柠檬醛会挥发出去，由于缓释制剂的缓释性质，柠檬醛被缓慢释放，含CL和CL-CS的培养皿内的柠檬醛含量能较长时间维持抑菌浓度，具有良好抑菌长效性。此外，壳聚糖的抑菌率约为15%左右，由于抑菌协同效应，CL-CS的抑菌能力更高。
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图 5 不同抑菌剂对黄曲霉菌的长效抑制作用注：A：不处理CK；B：壳聚糖；C：柠檬醛；D：CL；E：CL-CS。Figure 5. Long-term inhibitory effect of different antibacterial agents on Aspergillus flavus2.5 CL和CL-CS对黄曲霉菌电导率的影响
通透性的异常是细胞壁（膜）受损的表现，菌体被抑菌物质处理导致细胞壁（膜）遭到破坏，则其内部的胞液和核酸等物质会泄漏到胞外溶液中，从而导致胞外溶液电导率发生变化。因此，溶液电导率的变化反映了细胞壁（膜）的破坏程度，间接反映抑菌物质对菌体的作用情况。溶液电导率随时间的变化情况如图6所示，实验组随着作用时间的增加，溶液电导率逐渐增大，说明柠檬醛能破坏菌体的通透性。同一作用时间内，C、CL、CL-CS处理组的电导率呈递增趋势，且CL-CS处理组的电导率更快达到稳定，可能是由于脂质体膜的生物亲和度高，与细胞膜融合后，柠檬醛直接进入到细胞内，使得细胞内容物流出，时间越长，效果越明显，作用60 min后基本达到稳定状态。在40 min时，CL-CS处理组溶液的相对电导率达到稳定状态，而C和CL处理组需要更长的时间（60 min）,可能是因为壳聚糖的氨基阳离子能吸附聚集细胞膜表面带负电荷的粒子，引起细胞膜穿孔，加速细胞内容物外流和细胞死亡[21]。郭丹等[22]研究发现油茶炭疽病菌和水稻稻瘟病菌经化合物处理后，菌体的相对渗透率增大，表明细胞膜发生了破坏，与本研究结果相似。
2.6 CL和CL-CS对黄曲霉菌胞外核酸的影响
核酸的最大吸收峰在260 nm左右，因此测定胞外溶液在260 nm处的吸光度能间接反映胞外核酸含量的变化情况[23]。结果（图7）表明，和对照组相比，处理组的孢子悬浮液在260 nm处的吸光度值均有明显增加，说明胞内核酸发生了泄露。作用一段时间后，CL-CS处理组和CL处理组对菌体的作用效果较强。
综合胞外液电导率和胞外核酸的测定结果，实验组的胞外液电导率和胞外核酸含量均有所升高，CL-CS处理组和CL处理组比游离柠檬醛处理组的作用效果更明显，说明缓释制剂能改变细胞膜（壁）的通透性来达到抑菌的目的。
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图 7 CL和CL-CS对黄曲霉菌胞外核酸的影响Figure 7. Effects of CL and CL-CS on extracellular nucleic acid of Aspergillus flavus3. 结论
本研究采用乙醇注入法制备两种柠檬醛缓释制剂，并对柠檬醛缓释制剂的稳定性、抑菌性、抑菌机理做了初步研究。稳定性研究结果表明，4 ℃条件有利于柠檬醛缓释制剂的储藏。此外，相同条件下，CL-CS的稳定性优于CL，这是由于壳聚糖通过静电吸附包裹在脂质体表面，形成一层保护膜，防止活性成分的泄露，增强柠檬醛脂质体稳定性。从结果还可看出，过酸、过碱都会使得柠檬醛缓释制剂发生泄漏，柠檬醛保留率均比较低。因此，在缓释制剂的制备和使用过程中最好低温，且要注意环境酸碱条件。
相比于游离柠檬醛，柠檬醛缓释制剂在抑菌速效和长效方面均具有一定优势，CL-CS的抑菌效果更佳。C、CL、CL-CS在48 h内瞬时抑菌的EC50分别为163.65、77.88和68.20 mg·L−1；在抑菌物质浓度为360 mg·L−1的培养皿上再接种黄曲霉菌孢子悬浮液，然后继续培养48 h后，C、CL和CL-CS的抑制率分别为30.26%、67.69%和82.89%。在实际应用中，柠檬醛缓释制剂在抑制目标菌生长时可以通过缓释作用达到长效抑菌的目的，在生产实践中具有重要的指导意义。
此外，本研究发现柠檬醛缓释制剂处理能引起菌体胞外相对电导率的变化和核酸的泄露，表明通过改变膜通透性来抑制黄曲霉菌是柠檬醛缓释制剂的抑菌机理之一。柠檬醛缓释制剂处理比游离柠檬醛处理效果更明显，脂质体包埋柠檬醛能增强柠檬醛进入目标菌菌体的能力。然而，柠檬醛对黄曲霉菌的抑菌机理包括破坏细胞壁和细胞膜的完整性、影响核酸和蛋白质的表达和合成、影响真菌细胞的能量代谢和呼吸代谢等方面。本研究仅对细胞壁（膜）的通透性做了分析，未涉及到核酸和蛋白质合成表达以及能量代谢等方面，今后还需对柠檬醛缓释制剂的抑菌机理做深入研究，有利于缓释制剂的合理应用。
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图 2 储藏期间的粒径和Zeta电位变化情况
注：不同小写字母表示缓释制剂在不同储藏时间的粒径和电位差异显著（P<0.05）。
Figure 2. Variation of particle size and Zeta potential during storage
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图 3 不同温度下柠檬醛的保留率
注：不同小写字母表示同一时间不同缓释制剂的保留率差异显著（P<0.05）。
Figure 3. Retention rate of citral at different temperatures
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图 4 不同pH条件下的稳定性结果
注：不同小写字母表示同种缓释制剂在不同pH条件下的粒径和保留率差异显著（P<0.05）。
Figure 4. Stability results under different pH conditions
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图 5 不同抑菌剂对黄曲霉菌的长效抑制作用
注：A：不处理CK；B：壳聚糖；C：柠檬醛；D：CL；E：CL-CS。
Figure 5. Long-term inhibitory effect of different antibacterial agents on Aspergillus flavus
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图 7 CL和CL-CS对黄曲霉菌胞外核酸的影响
Figure 7. Effects of CL and CL-CS on extracellular nucleic acid of Aspergillus flavus
表 1 平均粒径、PDI以及Zeta电位
Table 1 Average particle size, PDI and Zeta potential
样品 平均粒径（nm） PDI Zeta电位（mV） 空白柠檬醛脂质体（空白CL） 104.69±3.38 0.074±0.009 −15.31±1.72 柠檬醛脂质体（CL） 127.63±2.06 0.137±0.039 −16.63±1.67 空白柠檬醛-壳聚糖复合脂质体（空白CL-CS） 137.29±7.15 0.197±0.066 38.31±2.18 柠檬醛-壳聚糖复合脂质体（CL-CS） 200.33±9.96 0.241±0.024 35.72±3.29 
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表 2 储藏期间外观观察
Table 2 Appearance observation during storage
样品 储藏时间（d） 0 7 14 21 28 4 ℃ CL 澄清 澄清 澄清 澄清 絮状物，
振摇可复原。4 ℃ CL-CS 澄清 澄清 澄清 澄清 澄清 25 ℃ CL 澄清 澄清 絮状物，
振摇可复原絮状物，
振摇可复原底部有沉淀 25 ℃ CL-CS 澄清 澄清 澄清 澄清 絮状物
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表 3 CL和CL-CS对黄曲霉菌的瞬时抑制作用
Table 3 Instantaneous inhibition of CL and CL-CS on Aspergillus flavus
化合物 抑菌率（%） 毒力方程 EC50(mg·L−1) 90 mg·L−1 180 mg·L−1 360 mg·L−1 720 mg·L−1 1440 mg·L−1 C 3.82±2.28 60.23±9.21 97.2±2.74 100 100 y=6.0740x−8.4473 163.65 CL 41.82±2.03 85.51±2.26 100 100 100 y=4.7684x−4.019 77.88 CL-CS 51.12±2.11 90.66±1.69 100 100 100 y=4.5256x−3.299 68.20
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[1] 杨博磊, 耿海荣, 王刚, 等. 我国花生土壤黄曲霉菌分布与产后花生黄曲霉毒素污染相关性研究[J]. 核农学报,2021,35(4):863−869. [YANG B L, GENG H R, WANG G, et al. The relationship between Asperillus flavus in peanut soil and aflatoxin contamination of peanut in China[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2021,35(4):863−869. doi: 10.11869/j.issn.100-8551.2021.04.0863 [2] 胡佳哲, 赖宇红, 陈浩桉. 中药材中常见真菌毒素污染状况及分析方法研究进展[J]. 海峡药学,2019,31(1):1−5. [HU J Z, LAI Y H, CHEN H A. Research progress of the pollution status and analysis methods of common fungal toxins in chinese medicinal herbs[J]. Strait Pharmaceutical Journal,2019,31(1):1−5. doi: 10.3969/j.issn.1006-3765.2019.01.001 [3] 贾睿, 蔡丹, 刘景圣, 等. 天然植物源抑菌活性成分研究进展[J]. 食品工业,2020,41(10):283−287. [JIA R, CAI D, lIU J S, et al. Research progress of antibacterial active components from natural plants[J]. The Food Industry,2020,41(10):283−287. [4] 王龑, 林威, 俞根荣, 等. 植物精油在食品防霉保质中应用的研究进展[J]. 核农学报,2021,35(5):1170−1177. [WANG Y, LIN W, YU G R, et al. Advance in anti-fungus application of plant essential oil in food preservation[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2021,35(5):1170−1177. doi: 10.11869/j.issn.100-8551.2021.05.1170 [5] XIA S Q, LIN H, ZHU P L, et al. Inhibitory effects of Litsea cubeba oil and its active components on Aspergillus flavus[J]. Journal of Food Quality,2020:1−9.
[6] 向俊, 樊蕊, 王磊, 等. 柠檬醛微胶囊化研究进展[J]. 中国食品添加剂,2014(9):176−183. [XIANG J, FAN R, WANG L, et al. Research progress of citral microencapsulation[J]. China Food Additives,2014(9):176−183. doi: 10.3969/j.issn.1006-2513.2014.09.020 [7] MIRANDA-CADEN K, DIAS M, COSTA-BARBOSA A, et al. Development and characterization of monoolein-based liposomes of carvacrol, cinnamaldehyde, citral or thymol with anti-candida activities[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2021,65(6):1−21.
[8] 徐伟丽, 朱元昊, 张玉琪, 等. α-生育酚脂质体的配方优化及其稳定性分析[J]. 哈尔滨工业大学学报,2020,52(12):116−125. [XU W L, ZHU Y H, ZHANG Y Q, et al. Formulation optimization and stability analysis of α-tocopherol liposomes[J]. Journal of Harbin Institute of Technology,2020,52(12):116−125. doi: 10.11918/201907024 [9] 郝静梅, 孙志高, 盛冉, 等. 柠檬烯纳米脂质体的制备及其性质测定[J]. 食品与发酵工业,2018,44(4):173−179. [HAO J M, SUN Z G, PENG R, et al. Preparation and characterization of limonene nanoliposomes[J]. Food and Fermentation Industries,2018,44(4):173−179. [10] 程铭, 焦文佳, 陶冶, 等. 壳聚糖修饰植物甾醇脂质体的制备及稳定性研究[J]. 中国粮油学报,2018,33(8):75−80,86. [CHENG M, JIAO W J, TAO Y, et al. Effects of CL and CL-CS on extracellular nucleic acid of Aspergillus flavus[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2018,33(8):75−80,86. doi: 10.3969/j.issn.1003-0174.2018.08.013 [11] PEREIRA O, MENDES J M, LIMA I O, et al. Antifungal activity of geraniol and citronellol, two monoterpenes alcohols, against Trichophyton rubrum involves inhibition of ergosterol biosynthesis[J]. Pharmaceutical Biology,2015,53(2):228−234. doi: 10.3109/13880209.2014.913299
[12] 张雪婧. 刺激释放型豆蔻精油纳米脂质体的制备及在肉类食品中的应用[D]. 苏州: 江苏大学, 2016. ZHANG X J. Preparation of Stimulus-releasing nano-liposomes of cardamom essential oil and its application in meat products[D]. Suzhou: Jiangsu University, 2016.
[13] MA Y F, WANG Z, ZHAO W, et al. Enhanced bactericidal potency of nanoliposomes by modification of the fusion activity between liposomes and bacterium[J]. Int J Nanomed,2013,8:2351−2360.
[14] JOSHI O, CHU L, MC G J, et al. Adsorption and function of recombinant Factor VIII at the air-water interface in the presence of Tween 80[J]. J Pharm Sci,2009,98(9):3099−3107. doi: 10.1002/jps.21569
[15] TASI L, LIU D, CHEN W. Microcalorimetric Investigation of the interaction of polysorbate surfactants with unilamellar phosphatidylcholines liposomes[J]. Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2003,213(1):7.
[16] PUSK I, CSEMPESZ F. Influence of cyclodextrins on the physical stability of DPPc-liposomes[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2007,58(2):218−224. doi: 10.1016/j.colsurfb.2007.03.011
[17] 刘丽. 肉桂醛脂质体的制备与稳定性研究[D]. 无锡: 江南大学, 2017. LIU L. Preparation and stability of cinnamaldehyde liposomes[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2017.
[18] CHEN E, WU S, MCCLEMENTS C D, et al. Influence of pH and cinnamaldehyde on the physical stability and lipolysis of whey protein isolate-stabilized emulsions[J]. Food Hydrocolloids,2017(69):103−110.
[19] ZIDOVSKA A, EWERT K, QUISPE J, et al. The effect of salt and ph on block liposomes studied by cryogenic transmission electron microscopy[J]. Biochimica et Biophysica Acta: Biomembranes,2009,1788(9):1869−1876. doi: 10.1016/j.bbamem.2009.06.013
[20] 成方圆. 肉桂醛脂质体及其壳聚糖修饰物的制备与抑菌性研究[D]. 无锡: 江南大学, 2018. CHEN F Y. Preparation and antibacterial activity of cinnamaldehyde liposome and its chitosan modifier[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2018.
[21] 蓝蔚青, 杨歆, 王蒙, 等. 壳聚糖对腐生葡萄球菌的作用机制[J]. 广东海洋大学学报,2021,41(1):63−71. [LAN W Q, YANG X, WANG M, et al. Mechanism of chitosan against Staphylococcus saprophytic[J]. Journal of Guangdong Ocean University,2021,41(1):63−71. doi: 10.3969/j.issn.1673-9159.2021.01.001 [22] 郭丹, 雷潇, 王鹏, 等. 山苍子油主成分及其衍生物对植物病原菌的抑制作用[J]. 江西农业大学学报,2016,38(2):283−289. [GUO D, LEI X, WANG P, et al. Inhibition of main components and derivatives of Litsea cubeba oil on plant pathogens[J]. Journal of Jiangxi Agricultural University,2016,38(2):283−289. [23] 魏娟. 柠檬醛和肉桂醛抑制接骨木镰刀菌生长和产毒的机理[D]. 兰州: 甘肃农业大学, 2020. WEI J. Mechanism of citral and cinnamaldehyde inhibiting the growth and toxicity of Fusarium elderium[D]. Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2020.
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期刊类型引用(5)
1. 杨雅煊，郭晓彤，傅璇，汤尚文，李欢欢，豁银强，刘传菊. 壳聚糖修饰辅酶Q_(10)脂质体的制备与性能研究. 食品科技. 2024(08): 39-47 . 
百度学术
2. 张艳芳，胡炜东，曹晓娟，武俊英. 植物乳杆菌产抑霉菌活性物质对黄曲霉抑菌机制的研究. 食品科技. 2023(03): 24-29 . 百度学术
3. 杨水兵，刘丽，易国富，余海霞. 鱼油DHA脂质体的制备及稳定性. 肉类研究. 2022(09): 32-36 . 百度学术
4. 程旺开 ，李囡囡 ，胡剑峰 ，张强 . 壳聚糖复合纳米膜的制备及其抗菌性能分析. 武汉轻工大学学报. 2022(05): 21-25 . 百度学术
5. 黄亚茹，高芳，迟韵阳，廖圣良，刘新亮，杨海宽，华小菊，龚岚，王宗德，高伟. 天然柠檬醛提取方法与生物活性研究进展. 南方农业学报. 2022(11): 3217-3228 . 百度学术
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