Empirical Analysis of QuEChERS Method for New Risks of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Spirulina
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摘要: 目的：本研究旨在系统建立螺旋藻中多环芳烃气相色谱质谱联用仪(GC-MS/MS)分析方法，实证分析螺旋藻中发现的多环芳烃类污染新风险。方法：采用正己烷作为提取剂，超声辅助提取2次，合并提取液经QuEChERS净化，氮吹浓缩过滤后测定。定性和定量：使用DB-5 MS毛细管色谱柱分离，多反应监测模式(MRM)结合基质匹配外标法分析。结果：建立的气相色谱质谱联用方法回收率为68.8%～101.9%，相对标准偏差为1.8%～8.4%（n=6），在1～32 ng/mL线性范围内方程相关系数达到0.999以上，方法的定量限为2 μg/kg。实证结果表明69批市售螺旋藻样品中全部检出多环芳烃，含量分布在2.4～3491 μg /kg范围。结论：本文建立的螺旋藻中15种多环芳烃QuEChERS检测方法快速、准确、灵敏度高，可为日常监管提供科学的技术支撑，通过样品的实证分析研究发现，螺旋藻类产品中多环芳烃的风险需高度关注，并进一步找出污染源建立防控措施。
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关键词:
- 螺旋藻 /
- 多环芳烃 /
- 气相色谱-质谱联用仪 /
- 检测
Abstract: Objective: The purpose of this study was to systematically establish a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS/MS) analysis method for polycyclic aromatic hydrocarbons in Spirulina, and empirically analyze the new risk of polycyclic aromatic hydrocarbons found in Spirulina. Method: The polycyclic aromatic hydrocarbons of the sample were extracted twice with n-hexane ultrasonically, purified by QuEChERS, and tested after being concentrated by nitrogen blowing. Qualitative and quantitative: Separation using DB-5 MS capillary chromatographic column, multiple reaction monitoring mode (MRM) combined with matrix-matched external standard method for analysis. Results: The recovery rate was 68.8%～101.9%, the relative standard deviation was 1.8%～8.4% (n=6), the correlation coefficient of the equation reached above 0.999 within the linear range of 1～32 ng/mL, and the limit of quantitative (LOQ) was 2 μg/kg. Polycyclic aromatic hydrocarbons were detected in all 69 commercially available Spirulina samples, with the content in the range of 2.4 μg/kg to 3491 μg/kg. Conclusion: The QuEChERS detection method for 15 polycyclic aromatic hydrocarbons in Spirulina established in this paper is fast, accurate and highly sensitive, and can provide scientific technical support for daily supervision. It is necessary to pay attention to the risk of polycyclic aromatic hydrocarbons in Spirulina products, and further identify the source of pollution to establish prevention and control measures. -
螺旋藻是一种光自养原核低等水生植物，属于蓝藻纲颤藻科。因在显微镜下呈螺旋丝状而得名，广泛分布于热带和亚热带地区，如海洋、湖泊、温泉，特别是碱性湖。在人工控制下可在大型室外或温室中进行商业化生产，目前大规模人工培育的螺旋藻品种主要有钝顶螺旋藻、极大螺旋藻和印度螺旋藻三种[1-3]。螺旋藻营养丰富全面且均衡，富含蛋白质、多肽、多糖、γ-亚麻酸、维生素以及微量元素，脂肪和胆固醇含量较低[4-6]。研究表明螺旋藻具有抗氧化[7-8]、抗肿瘤[9]、降血脂[10-11] 、抗病毒[12]及降血糖[13]等多种生物学活性，近年来螺旋藻作为一种潜在的药食两用资源受到越来越多的关注。
螺旋藻生长过程可能受水体环境的污染，特别容易吸收富集水体中的多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs） [14-15]。多环芳烃是一类含有两个或两个以上苯环或杂环以线状、角状或者簇状排列的中等级性或非极性有机化合物，自然界中广泛存在，具有疏水亲脂特性，易与矿物质、有机质结合，吸附在悬浮物和沉积物中，也易在生物体脂类中富集。PAHs进入生物体后会经过一系列的代谢过程产生活性氧类物质，可与DNA、蛋白质等形成化合物，破坏生物体的氧化防御系统而产生重大损伤，具有很强的致畸、致癌、致突变作用，已被世界各国列为优先控制污染物 [16-20]。目前多环芳烃的检测方法较多，主要涉及水产品[21]、植物油[22-23]、水果和蔬菜[24]、肉制品[25-26]、土壤[27]和中药材[28]等领域，检测技术多采用索氏提取、液液萃取、固相萃取、固相微萃取、QuEChERS 技术、凝胶渗透色谱净化结合高效液相色谱仪或气相色谱质谱联用仪等方式[29-35]。但目前关于螺旋藻中多环芳烃检测方法研究很少，特别是多种多环芳烃化合物同时测定技术更鲜见报道。进出口预警信息跟踪过程中发现螺旋藻类产品多次由于苯并[a]芘或多环芳烃被通报或召回的信息，2015年10月EFSA再次修订食品中的BaP（苯并[a]芘）和PAH4（苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽和 䓛 ）的最大限值规定（苯并[a]芘限量修订为10 μg/kg，PAH4限量修订为50 μg/kg），增列含有螺旋藻的食品补充剂中多环芳烃的限量要求。随着螺旋藻功能因子深入研究，相关保健食品的开发应用也呈现爆发式增长（自1997年至2019年，已批准藻类保健食品342个，占总批准产品数量的1.9%[36]），因此非常有必要系统性的开展螺旋藻中多环芳烃方法研究和含量分析，及时准确地获得多环芳烃风险暴露情况，为消费者合理膳食消费提供指导。
本研究旨在通过对提取试剂、净化条件及色谱质谱分析条件的选择和优化，建立QuEChERS-GC-MS/MS对螺旋藻中15种多环芳烃的检测方法，并结合基质匹配外标法分析消除基质效应，实现准确定量。使用QuEChERS前处理快速高效，能够满足实验室快速检测分析的需要，可为螺旋藻多环芳烃污染的质量安全监管提供便利。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
螺旋藻保健品、螺旋藻原料 购自全国各地药店；多环芳烃 标准品（浓度100 μg/mL），天津阿尔塔科技有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）吸附剂、十八烷基键合硅胶吸附剂（C18） 天津博纳艾杰尔科技公司；二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、环己烷、乙腈、正己烷 色谱纯，美国Fisher Che-mical公司。
TQ 8050气相色谱-质谱联用仪 日本SHIMADZU公司；ML-204 电子天平 METTLER TOLEDO公司；KQ-500DE 超声仪 江苏昆山超声仪器公司；MULTIFUGEX3R 离心机 美国Thermo Fisher公司；N1全自动氮吹浓缩仪 上海屹尧仪器科技发展有限公司；T25 Digital 涡旋振荡仪 德国IKA公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理
1.2.1.1 提取
称取1 g粉碎研细的样品于50 mL离心管中，准确加入10 mL正己烷，涡旋振荡提取10 min，超声提取10 min，以8000 r/min离心5 min，收集上清液；再加入10 mL正己烷重复以上步骤提取1次，合并2次上清液，混匀后待净化。
1.2.1.2 QuEChERS净化
精密吸取上述提取液5 mL于10 mL离心管中，加入100 mg C18和100 mg PSA粉末，涡旋60 s后8000 r/min离心5 min，吸取所有上清液在氮吹浓缩仪上以40 ℃的温度氮吹至近干，正己烷准确定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜待气相色谱-串联质谱分析。
1.2.2 标准溶液的配制
多环芳烃储备液：精密吸取多环芳烃标准品1 mL至25 mL容量瓶中，正己烷定容至刻度，摇匀即得多环芳烃储备液（浓度为4000 ng/mL）。
多环芳烃使用液：精密吸取多环芳烃储备液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀后即得多环芳烃使用液（浓度为40 ng/mL）。
1.2.3 仪器条件
1.2.3.1 气相色谱条件
色谱柱：Agilent J&W DB-5 MS 石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；进样口温度：300 ℃；升温程序：70 ℃保持2 min，以35 ℃/min升至160 ℃，以10 ℃/min升至260 ℃，以6 ℃/min升至310 ℃，保持5 min；载气（He）流速：1.5 mL/min，进样量：1 µL；不分流进样。
1.2.3.2 质谱条件
电子轰击离子源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度：310 ℃；溶剂延迟时间：4 min；数据采集采用多反应监测模式（MRM）。
1.2.3.3 定性及定量方法
准确吸取上述1.2.2中多环芳烃使用液适量，用同法处理的阴性样品基质溶液配制成1～32 ng/mL的系列标准溶液（现配现用），GC-MS/MS气相色谱-质谱联用仪多反应监测模式测定，以多环芳烃浓度（ng/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.4 样品测定
将1.2.1中处理的试样待测液注入气相色谱-质谱仪中，测得相应的峰面积，根据标准曲线得到试样待测液中多环芳烃的质量浓度。如果试样待测液中多环芳烃化合物的响应值超出仪器检测的线性范围，可适当稀释后测定。
1.3 数据处理
使用仪器自带数据处理软件（GCMS solution版本4.45）定性定量。
2. 结果与分析
2.1 质谱参数优化
优化碰撞能量，筛选高响应特异离子（例如部分样品中苯并（a）蒽226.10>224.10峰前有明显杂质干扰，影响定性结果，优化为228.10>224.10），采用多反应监测模式23 min内完成对15种多环芳烃目标物的同时测定。具体优化后的15种多环芳烃总离子流图见图1，质谱参数结果见表1。
表 1 15种多环芳烃的质谱参数Table 1. Mass spectrometric parameters for 15 PAHs序号 化合物 CAS 定量离子对 定性离子对1 定性离子对2 保留时间（min） m/z 碰撞能量（eV） m/z 碰撞能量（eV） m/z 碰撞能量（eV） 1 苊烯 208-96-8 152.10>150.10 28 152.10>126.10 28 152.10>102.10 28 6.692 2 苊 83-32-9 153.10>151.10 28 153.10>127.10 28 151.10>77.00 20 6.930 3 芴 86-73-7 165.10>163.10 28 165.10>115.10 28 165.10>139.10 28 7.723 4 菲 85-01-8 178.10>152.10 20 178.10>176.10 28 176.10>150.10 20 9.476 5 蒽 120-12-7 178.10>152.10 20 178.10>176.10 28 176.10>150.10 20 9.579 6 荧蒽 206-44-0 202.10>200.10 30 200.10>198.10 30 202.10>152.10 28 12.021 7 芘 129-00-0 202.10>200.10 30 202.10>152.10 28 200.10>198.10 30 12.517 8 苯并（a）蒽 56-55-3 228.10>226.10 32 228.10>224.10 32 228.10>202.10 60 15.381 9 䓛 218-01-9 228.10>226.10 32 226.10>224.10 32 228.10>202.10 60 15.466 10 苯并（b）荧蒽 205-99-2 252.10>250.10 36 250.10>248.10 36 252.10>226.10 60 18.195 11 苯并（k）荧蒽 207-08-9 252.10>250.10 36 250.10>248.10 36 252.10>248.10 60 18.272 12 苯并（a）芘 50-32-8 252.10>250.10 36 250.10>248.10 36 252.10>226.10 60 19.046 13 茚并（1，2，3-cd）芘 193-39-5 276.10>274.10 36 276.10>272.10 60 274.10>272.10 36 21.975 14 二苯并（a，h）蒽 53-70-3 278.10>276.10 36 278.10>274.10 60 276.10>274.10 36 22.081 15 苯并（g，h，i）苝 191-24-2 276.10>274.10 36 274.10>272.10 36 276.10>272.10 60 22.608 ![]()
图 1 15种多环芳烃化合物的总离子流图注：图中1~15对应的化合物与表1中相同。Figure 1. Total ion chromatograms of 15 PAHs2.2 提取试剂和提取次数优化
PAHs极性较弱，为脂溶性化合物，螺旋藻基质复杂，干扰物质（如：蛋白质、色素、脂肪等大分子物质）较多。为尽可能降低基质干扰，实验对比了环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、乙腈和丙酮6种有机试剂对提取效果的影响。在螺旋藻样品中加入多环芳烃混标溶液模拟阳性质控样，称取1 g试样分别使用上述6种有机试剂提取。10 mL提取一次时，二氯甲烷提取效率最高，但提取溶液颜色最深且提取液不易分层。当采用10 mL试剂提取两次时，丙酮、正己烷、乙酸乙酯、环己烷的提取效率与二氯甲烷接近，乙腈提取效率相对偏低（见图2）。同时比较提取液颜色深浅和提取效率，最终选用正己烷作为提取试剂。
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图 2 不同溶剂对螺旋藻中多环芳烃的提取效率Figure 2. Different solvents extraction efficiency of PAHs in Spirulina2.3 超声辅助提取优化
为了考察超声提取技术对提取效率的影响，本实验在螺旋藻样品中加入多环芳烃混标溶液模拟阳性质控样，称取1 g试样采用正己烷10 mL分别超声和未超声提取两次（见图3），结果显示䓛、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）芘、茚并（1，2，3-cd）芘、二苯并（a，h）蒽和苯并（g，h，i）苝等化合物在超声辅助提取条件下的提取效果优于未超声提取。
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图 3 超声提取对螺旋藻中多环芳烃的提取效率影响Figure 3. Effect of ultrasonic extraction on the extraction efficiency of PAHs in Spirulina2.4 净化方式优化
2.4.1 固相萃取和QuEChERS净化
通过查阅文献[15,37-38]和参考GB 5009.265-2016《食品安全国家标准食品中多环芳烃的测定》，本实验选用了中性氧化铝、亲水亲脂平衡HLB萃取柱、C18、高分子印迹多环芳烃专用萃取柱MIPs、Florsil固相萃取小柱和QuEchERS共6种净化方式（见图4）。结果显示，C18和中性氧化铝基本对15种多环芳烃没有保留能力，HLB、多环芳烃专用萃取柱MIPs、Florsil固相萃取小柱和QuEchERS净化具有较好的回收率，但HLB和多环芳烃专用萃取柱MIPs对色素净化效果较差，净化后的上机溶液色素依然较多，对GC-MS/MS系统的耐用性提出挑战。Florsil固相萃取小柱和QuEchERS净化回收率较高，除去杂质尤其是色素能力强，满足实验要求，考虑到方法的操作方便性和耗材成本，最终选用操作更简便、成本更低廉的QuEchERS净化方式。
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图 4 不同方式对螺旋藻中多环芳烃的净化效率Figure 4. Purification efficiency of PAHs in Spirulina by different methods2.4.2 QuEChERS填料含量优化
目前QuEChERS法中常用的吸附净化剂有PSA（N-丙基乙二胺）、C18（十八烷基键合硅胶吸附剂）和 GCB（石墨碳黑粉）3 种。GCB的表面具有正六元环结构，对平面分子有极强的亲和力，能有效去除螺旋藻基质中的色素和甾醇类干扰物，但由于多环芳烃结构中含有平面芳香环，也会被不同程度吸附，导致PAHs加标回收率降低，实际检测中无法实现准确定量。PSA结构中含有两个氨基，通过氢键的形成或离子交换作用，可有效去除样品中糖、色素、脂肪酸及其它有机酸等；C18主要去除非极性干扰物，例如油脂。本实验对比了不同含量的PSA粉和C18粉对螺旋藻中多环芳烃净化的效果（见图5）。结果显示，QuEChERS净化没有带来多环芳烃化合物明显的损失，PSA粉和C18粉对色素的净化效果比较明显，随着二者含量的增加，色素含量逐步降低。但同时菲的响应值逐步升高，引入了对菲的二次污染，考虑到除杂和二次污染之间的平衡，最终选用了PSA粉和C18粉各100 mg的含量作为净化方式。
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图 5 不同含量的PSA和C18对螺旋藻中多环芳烃的净化效率Figure 5. Purification efficiency of PAHs in Spirulina by different contents of PSA and C182.5 方法的基质效应评估
气相色谱-质谱联用分析过程中会遇到基质效应，样品中除目标物之外的其他成分对目标物的响应带来抑制或增强，最终影响结果的准确性。本实验通过基质匹配法考察基质效应，取螺旋藻（阴性样品）按照1.2.1节前处理，使用提取净化后的空白基质溶液配制基质标准曲线，同时使用正己烷溶剂配制同样浓度的标准曲线。将所得两条校准曲线的斜率按下式计算得到绝对基质效应：
式中：Sm为基质配制的校准曲线斜率；Ss为纯溶剂配制的校准曲线斜率。若基质效应小于100%，则存在基质抑制效应，若基质效应大于100%，则存在基质增强效应。
由表2可以看出，出峰较早的苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽和芘的基质效应偏差均在10%以内，响应受到基质影响较小，定量准确性较为稳定；但出峰较晚的苯并（a）蒽、 䓛 、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）芘、茚并（1，2，3-cd）芘、二苯并（a，h）蒽和苯并（g，h，i）苝的响应受到基质影响较大，具有明显的基质增强效应，因此定量时需要采用空白基质匹配外标法定量，以此消除基质效应带来的定量偏差，保证结果的准确性。
表 2 螺旋藻中多环芳烃定量分析的基质效应Table 2. Matrix effect of quantitative analysis of PAHs in Spirulina编号 化合物 基质配制的校准
曲线斜率：Sm纯溶剂配制的校准
曲线斜率：Ss基质效应
（%）1 苊烯 2501.933 2535.003 98.7 2 苊 1900.358 1966.806 96.6 3 芴 2774.097 2892.63 95.9 4 菲 6055.434 6205.823 97.6 5 蒽 5083.664 4952.53 102.6 6 荧蒽 7182.905 6885.475 104.3 7 芘 7077.939 6834.102 103.6 8 苯并（a）蒽 9363.846 8455.756 110.7 9 䓛 9606.246 8885.886 108.1 10 苯并（b）荧蒽 6486.13 5615.74 115.5 11 苯并（k）荧蒽 5986.21 5182.756 115.5 12 苯并（a）芘 5349.769 4507.589 118.7 13 茚并（1，2，3-cd）芘 3385.811 2921.115 115.9 14 二苯并（a，h）蒽 3932.203 3074.073 127.9 15 苯并（g，h，i）苝 4065.72 3569.786 113.9 2.6 方法的线性范围、定量限结果
由于螺旋藻样品测定过程中存在明显基质效应，本方法以阴性螺旋藻样品提取液作为溶剂，采用基质匹配外标法定量。配制1、2、4、8、16、32 ng/mL基质混合标准液，GC-MS/MS采集数据并以多环芳烃浓度（ng/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。如表3所示，15种多环芳烃在1~32 ng/mL含量范围内，质量浓度与其峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数均在0.999以上。定量限为2 μg/kg。
表 3 15种多环芳烃的回归方程、相关系数、定量限Table 3. Regression equation, correlation coefficient and LODs of 15 PAHs编号 化合物 回归方程 相关系数r 定量限
（μg/kg）1 苊烯 Y=2501.933X+1344.625 0.99997 2 2 苊 Y=1900.358X+7235.572 0.99972 2 3 芴 Y=2774.097X+6584.985 0.99971 2 4 菲 Y=6055.434X+30892.78 0.99966 2 5 蒽 Y=5083.664X+4820.363 0.99969 2 6 荧蒽 Y=7182.905X+8168.333 0.99989 2 7 芘 Y=7077.939X+6622.308 0.99980 2 8 苯并（a）蒽 Y=9363.846X+4511.279 0.99981 2 9 䓛 Y=9606.246X+9947.418 0.99984 2 10 苯并（b）荧蒽 Y=6486.13X+3258.801 0.99986 2 11 苯并（k）荧蒽 Y=5986.21X+2883.791 0.99995 2 12 苯并（a）芘 Y=5349.769X+1798.592 0.99986 2 13 茚并（1，2，3-cd）芘 Y=3385.811X+2306.985 0.99961 2 14 二苯并（a，h）蒽 Y=3932.203X+1914.04 0.99976 2 15 苯并（g，h，i）苝 Y=4065.72X+1157.607 0.99993 2 2.7 方法的回收率与精密度
按照4倍定量限和10倍定量限的添加水平，在螺旋藻中添加适当体积的多环芳烃混合标准溶液，采用1.2.1节前处理方法平行测定6次，计算回收率和RSD（见表4）。15种多环芳烃添加量为8和20 μg/kg时，回收率范围在68.8%～101.9%，相对标准偏差在1.8%～8.4%（n=6）之间，方法具有较好的回收率和重复性。
表 4 15种多环芳烃的回收率与精密度（n=6）Table 4. Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of 15 PAHs(n=6)化合物 加标水平（μg/kg） 平均回收率（%） RSD（%） 苊烯 8 83.2 3.3 20 71.2 2.7 苊 8 89.6 5.5 20 80.9 5.2 芴 8 89.7 8.4 20 83.6 4.2 菲 8 89.7 5.5 20 95.0 6.8 蒽 8 86.7 3.9 20 91.1 3.8 荧蒽 8 94.9 4.3 20 101.2 2.3 芘 8 92.5 3.2 20 99.4 4.0 苯并（a）蒽 8 89.6 2.4 20 99.6 2.6 䓛 8 93.2 3.1 20 101.9 3.3 苯并（b）荧蒽 8 88.2 5.5 20 93.5 2.8 苯并（k）荧蒽 8 85.9 7.2 20 94.4 3.1 苯并（a）芘 8 87.2 3.4 20 93.7 2.5 茚并（1，2，3-cd）芘 8 68.8 7.3 20 82.8 4.0 二苯并（a，h）蒽 8 86.5 3.5 20 88.3 3.4 苯并（g，h，i）苝 8 83.4 6.2 20 85.0 1.8 2.8 实际样品测定结果
运用建立的检测方法，对实际样品进行分析。从市场随机抽取螺旋藻类保健品69批次，含量分析见表5。结果显示15种多环芳烃在69批次螺旋藻中均有检出，检出率为100%，含量分布在2.4 ~3491 μg/kg范围内，特别是菲、蒽、荧蒽、芘、苯并（a）蒽、䓛、苯并（b）荧蒽和苯并（a）芘等化合物检出率较高，含量比其他多环芳烃相比也明显偏高。全试剂空白总离子流图和螺旋藻中多环芳烃总离子流图分别见图6和图7。
表 5 69批次螺旋藻中15种多环芳烃检测结果汇总Table 5. Summary of analytical results for the determination of 15 PAHs in 69 batches of Spirulinas编号 化合物 检出批次 检出率（%） 检出范围（μg/kg） 1 苊烯 41 59 5.9~542 2 苊 69 100 8.4~48.5 3 芴 65 94 3.0~374 4 菲 67 97 4.8~2418 5 蒽 63 91 2.4~786 6 荧蒽 63 91 4.6~3390 7 芘 63 91 3.3~3491 8 苯并（a）蒽 48 70 2.4~932 9 䓛 59 86 2.6~893 10 苯并（b）荧蒽 59 86 2.5~975 11 苯并（k）荧蒽 27 39 2.6~370 12 苯并（a）芘 36 52 2.6~744 13 茚并（1，2，3-cd）芘 28 41 3.2~584 14 二苯并（a，h）蒽 16 23 3.2~56.9 15 苯并（g，h，i）苝 35 51 3.8~633 3. 结论
本研究通过对提取试剂、净化条件及色谱质谱分析条件的选择和优化，建立了QuEChERS-GC-MS/MS对螺旋藻中15种多环芳烃的检测方法。最终采用正己烷结合超声辅助提取2次，使用QuEChERS（100 mg PSA和100 mg C18）方式净化，氮吹浓缩后多反应监测模式（MRM）测定。结合基质匹配外标法分析消除基质效应，实现了准确定量。该方法回收率为68.8%～101.9%，相对标准偏差为1.8%～8.4%（n=6），在1～32 ng/mL线性范围内方程相关系数达到0.999以上，精密度和准确性良好，使用QuEChERS前处理快速高效，节省了检测成本和检测时间，能够满足实验室快速检测分析的需要，可为螺旋藻多环芳烃污染的质量安全监管提供便利。同时，运用建立的方法对市售69批次螺旋藻样品进行了测定，结果显示多环芳烃检出率和含量水平均处于较高水平，这需要引起广大生产企业、监管者以及消费者的高度重视，在加工原料和生产工艺等环节进一步找出污染源并建立防控措施。
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图 1 15种多环芳烃化合物的总离子流图
注：图中1~15对应的化合物与表1中相同。
Figure 1. Total ion chromatograms of 15 PAHs
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图 2 不同溶剂对螺旋藻中多环芳烃的提取效率
Figure 2. Different solvents extraction efficiency of PAHs in Spirulina
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图 3 超声提取对螺旋藻中多环芳烃的提取效率影响
Figure 3. Effect of ultrasonic extraction on the extraction efficiency of PAHs in Spirulina
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图 4 不同方式对螺旋藻中多环芳烃的净化效率
Figure 4. Purification efficiency of PAHs in Spirulina by different methods
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图 5 不同含量的PSA和C18对螺旋藻中多环芳烃的净化效率
Figure 5. Purification efficiency of PAHs in Spirulina by different contents of PSA and C18
表 1 15种多环芳烃的质谱参数
Table 1 Mass spectrometric parameters for 15 PAHs
序号 化合物 CAS 定量离子对 定性离子对1 定性离子对2 保留时间（min） m/z 碰撞能量（eV） m/z 碰撞能量（eV） m/z 碰撞能量（eV） 1 苊烯 208-96-8 152.10>150.10 28 152.10>126.10 28 152.10>102.10 28 6.692 2 苊 83-32-9 153.10>151.10 28 153.10>127.10 28 151.10>77.00 20 6.930 3 芴 86-73-7 165.10>163.10 28 165.10>115.10 28 165.10>139.10 28 7.723 4 菲 85-01-8 178.10>152.10 20 178.10>176.10 28 176.10>150.10 20 9.476 5 蒽 120-12-7 178.10>152.10 20 178.10>176.10 28 176.10>150.10 20 9.579 6 荧蒽 206-44-0 202.10>200.10 30 200.10>198.10 30 202.10>152.10 28 12.021 7 芘 129-00-0 202.10>200.10 30 202.10>152.10 28 200.10>198.10 30 12.517 8 苯并（a）蒽 56-55-3 228.10>226.10 32 228.10>224.10 32 228.10>202.10 60 15.381 9 䓛 218-01-9 228.10>226.10 32 226.10>224.10 32 228.10>202.10 60 15.466 10 苯并（b）荧蒽 205-99-2 252.10>250.10 36 250.10>248.10 36 252.10>226.10 60 18.195 11 苯并（k）荧蒽 207-08-9 252.10>250.10 36 250.10>248.10 36 252.10>248.10 60 18.272 12 苯并（a）芘 50-32-8 252.10>250.10 36 250.10>248.10 36 252.10>226.10 60 19.046 13 茚并（1，2，3-cd）芘 193-39-5 276.10>274.10 36 276.10>272.10 60 274.10>272.10 36 21.975 14 二苯并（a，h）蒽 53-70-3 278.10>276.10 36 278.10>274.10 60 276.10>274.10 36 22.081 15 苯并（g，h，i）苝 191-24-2 276.10>274.10 36 274.10>272.10 36 276.10>272.10 60 22.608 
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表 2 螺旋藻中多环芳烃定量分析的基质效应
Table 2 Matrix effect of quantitative analysis of PAHs in Spirulina
编号 化合物 基质配制的校准
曲线斜率：Sm纯溶剂配制的校准
曲线斜率：Ss基质效应
（%）1 苊烯 2501.933 2535.003 98.7 2 苊 1900.358 1966.806 96.6 3 芴 2774.097 2892.63 95.9 4 菲 6055.434 6205.823 97.6 5 蒽 5083.664 4952.53 102.6 6 荧蒽 7182.905 6885.475 104.3 7 芘 7077.939 6834.102 103.6 8 苯并（a）蒽 9363.846 8455.756 110.7 9 䓛 9606.246 8885.886 108.1 10 苯并（b）荧蒽 6486.13 5615.74 115.5 11 苯并（k）荧蒽 5986.21 5182.756 115.5 12 苯并（a）芘 5349.769 4507.589 118.7 13 茚并（1，2，3-cd）芘 3385.811 2921.115 115.9 14 二苯并（a，h）蒽 3932.203 3074.073 127.9 15 苯并（g，h，i）苝 4065.72 3569.786 113.9
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表 3 15种多环芳烃的回归方程、相关系数、定量限
Table 3 Regression equation, correlation coefficient and LODs of 15 PAHs
编号 化合物 回归方程 相关系数r 定量限
（μg/kg）1 苊烯 Y=2501.933X+1344.625 0.99997 2 2 苊 Y=1900.358X+7235.572 0.99972 2 3 芴 Y=2774.097X+6584.985 0.99971 2 4 菲 Y=6055.434X+30892.78 0.99966 2 5 蒽 Y=5083.664X+4820.363 0.99969 2 6 荧蒽 Y=7182.905X+8168.333 0.99989 2 7 芘 Y=7077.939X+6622.308 0.99980 2 8 苯并（a）蒽 Y=9363.846X+4511.279 0.99981 2 9 䓛 Y=9606.246X+9947.418 0.99984 2 10 苯并（b）荧蒽 Y=6486.13X+3258.801 0.99986 2 11 苯并（k）荧蒽 Y=5986.21X+2883.791 0.99995 2 12 苯并（a）芘 Y=5349.769X+1798.592 0.99986 2 13 茚并（1，2，3-cd）芘 Y=3385.811X+2306.985 0.99961 2 14 二苯并（a，h）蒽 Y=3932.203X+1914.04 0.99976 2 15 苯并（g，h，i）苝 Y=4065.72X+1157.607 0.99993 2
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表 4 15种多环芳烃的回收率与精密度（n=6）
Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of 15 PAHs(n=6)
化合物 加标水平（μg/kg） 平均回收率（%） RSD（%） 苊烯 8 83.2 3.3 20 71.2 2.7 苊 8 89.6 5.5 20 80.9 5.2 芴 8 89.7 8.4 20 83.6 4.2 菲 8 89.7 5.5 20 95.0 6.8 蒽 8 86.7 3.9 20 91.1 3.8 荧蒽 8 94.9 4.3 20 101.2 2.3 芘 8 92.5 3.2 20 99.4 4.0 苯并（a）蒽 8 89.6 2.4 20 99.6 2.6 䓛 8 93.2 3.1 20 101.9 3.3 苯并（b）荧蒽 8 88.2 5.5 20 93.5 2.8 苯并（k）荧蒽 8 85.9 7.2 20 94.4 3.1 苯并（a）芘 8 87.2 3.4 20 93.7 2.5 茚并（1，2，3-cd）芘 8 68.8 7.3 20 82.8 4.0 二苯并（a，h）蒽 8 86.5 3.5 20 88.3 3.4 苯并（g，h，i）苝 8 83.4 6.2 20 85.0 1.8
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表 5 69批次螺旋藻中15种多环芳烃检测结果汇总
Table 5 Summary of analytical results for the determination of 15 PAHs in 69 batches of Spirulinas
编号 化合物 检出批次 检出率（%） 检出范围（μg/kg） 1 苊烯 41 59 5.9~542 2 苊 69 100 8.4~48.5 3 芴 65 94 3.0~374 4 菲 67 97 4.8~2418 5 蒽 63 91 2.4~786 6 荧蒽 63 91 4.6~3390 7 芘 63 91 3.3~3491 8 苯并（a）蒽 48 70 2.4~932 9 䓛 59 86 2.6~893 10 苯并（b）荧蒽 59 86 2.5~975 11 苯并（k）荧蒽 27 39 2.6~370 12 苯并（a）芘 36 52 2.6~744 13 茚并（1，2，3-cd）芘 28 41 3.2~584 14 二苯并（a，h）蒽 16 23 3.2~56.9 15 苯并（g，h，i）苝 35 51 3.8~633
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