Simultaneous Quantitative Determination of Three Flavonoids in Aspalathus linearis and Its Products by QAMS Method
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摘要: 目的：建立同时测定线叶金雀花及其制品中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀3种黄酮类成分含量的一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）。方法：采用高效液相色谱法，以乙腈-醋酸水溶液为流动相，梯度洗脱，以异荭草苷为内参物，建立其与荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子（relative correction factor, F），并对方法进行验证；同时分别采用QAMS法和外标法计算线叶金雀花及其制品中3个成分的含量，比较2种测定方法所得结果的差异，验证QAMS法的准确性和可行性。结果：3个成分在线性范围内线性关系良好，R2>0.999，重复性RSD值均小于3%，回收率在97.4%～101.8%之间；该方法在不同实验条件下均有良好的重复性（RSD<3%），耐用性良好。外标法测得值和QAMS法计算值所得含量之间无显著性差异（P>0.05）。结论：建立的QAMS法简便可行、准确可靠，可作为线叶金雀花及其制品中多指标质量控制方法。Abstract: Objective: To establish a quantitative analysis of multi-components by single-marker (QAMS) method for simultaneous determination of isoorientin, orientin and aspalathin in Aspalathus linearis and its products. Methods: HPLC was used with acetonitrile-acetic acid aqueous solution as mobile phase, gradient elution and isoorientin as reference substance to establish its relative correction factors with orientin and aspalathin, and the method was verified. QAMS method and external standard method were used to calculate the contents of three components in Aspalathus linearis and its products. The differences of the results obtained by the two methods were compared to verify the accuracy and feasibility of QAMS method. Results: The linear relationship of the three components was good within a certain linear range, R2>0.999, the repeatability RSD value was less than 3%, and the recovery was in the range of 97.4%~101.8%. The method had good repeatability and good durability under different experimental conditions (RSD<3%). There was no significant difference between the content measured by external standard method and that calculated by QAMS method (P>0.05). Conclusion: The QAMS method for simultaneously measuring the content of three components was accurate and reliable to evaluate the quality of Aspalathus linearis and its products.
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线叶金雀花（Aspalathus Linearis （Brum.f.） R.Dahlgren）是仅产于南非西开普顿地区的一种豆科针状灌木，又称南非茶、博士茶[1]，于2014年批准为新食品原料[2]。研究表明，线叶金雀花富含黄酮类、多酚类、酚酸类和多糖类化合物[3]，具有抗氧化[4-6]、保护心血管[7]、降血糖[8-10]、抗炎[11-12]等作用。一般认为，黄酮类成分对抗氧化应激、解痉、抗病毒等作用具有重要意义[13]，线叶金雀花中黄酮类化合物主要为荭草苷、异荭草苷、阿司巴汀和异槲皮苷等[14]。线叶金雀花中荭草苷、异荭草苷中的含量较高，同时，阿司巴汀是至今发现唯一存在于线叶金雀花的生物类黄酮[15]。阿司巴汀是一种天然的二氢查尔酮，具有较强的抗氧化特性，被认为是线叶金雀花对健康有益的主要成分[16]，不同加工工艺对阿司巴汀、荭草苷和异荭草苷的含量影响较大[17-18]。因此，通过测定荭草苷、异荭草苷和阿司巴汀的含量对线叶金雀花及其制品进行质量控制具有积极作用。
目前，文献报道一般采用外标法测定线叶金雀花中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的含量[18-23]。传统的外标法需要使用异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀三种对照品，但阿司巴汀对照品不稳定、较难获得且价格昂贵，大大增加了检测成本。一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single-marker, QAMS）是一种多指标质量评价模式[24]，通过选用1种廉价易得的对照品为参照，建立其他待测成分与该对照品的相对校正因子（relative correction factor, F），来计算其待测他成分的含量[25]，已广泛应用于食品、保健食品、中药和化妆品的多成分质量评价中[26-30]。因此，本研究采用一测多评技术，选取价廉易得的异荭草苷为参照物，建立其与荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子，实现通过只测定异荭草苷的含量，用校正因子计算出荭草苷和阿司巴汀的含量，从而简便快捷、全面准确地对线叶金雀花及其制品进行多指标的质量评价，有助于保证产品的质量可控，节约检测成本和时间。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
线叶金雀花、线叶金雀花提取物、线叶金雀花茶、按处方比例和工艺制成的不含线叶金雀花提取物的阴性对照样品 均由完美（广东）日用品有限公司提供；异荭草苷（批号111974-201401，纯度94.0%）、荭草苷（批号111777-201302，纯度97.9%） 中国食品药品检定研究院；阿司巴汀（批号HWI00319，纯度94.84%） HWI Pharma services GmbH；乙醇、甲醇、冰醋酸、甲酸 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈 色谱纯，德国默克公司。
1260高效液相色谱仪（配置二极管阵列检测器） 安捷伦科技有限公司；e2695高效液相色谱仪（配置二极管阵列检测器）、ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪（配置双波长紫外检测器） 沃特世科技（上海）有限公司；ML204/02型电子天平（感量为0.1 mg）、MS205DU型电子天平（感量为0.01 mg） 梅特勒-托利多有限公司；P180H超声波清洗仪 德国Elma公司；Milli-Q超纯水仪 德国默克密理博公司。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液的配制
1.2.1.1 对照品溶液的配制
精密称取异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀对照品适量，加含0.2%维生素C的60%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含异荭草苷质量浓度为4.8、9.5、23.8、47.6、95.2、142.8 μg/mL，荭草苷质量浓度为4.4、8.9、22.2、44.4、88.8、133.2 μg/mL，阿司巴汀质量浓度为1.8、3.7、9.1、18.2、36.5、54.8 μg/mL的混合对照品溶液，并于4 ℃冰箱中避光保存，备用。
1.2.1.2 供试品溶液的制备
取线叶金雀花提取物0.2 g、线叶金雀花0.5 g以及线叶金雀花茶0.3 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液约20 mL，超声处理（37 kHz，500 W）30 min，放冷，用60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45 μm有机滤膜滤过，取续滤液，即得。
1.2.1.3 阴性对照溶液的制备
按配方比例和工艺，制成不含线叶金雀花提取物的阴性样品，按“1.2.1.2”项下方法制备阴性对照溶液。
1.2.2 高效液相色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为A：1%冰醋酸，B：乙腈；梯度洗脱程序：0~12 min，12% B；12~25 min，12%~20% B；25~28 min，20% B；28~28.01 min，20%~100% B；28.01~38 min，100% B；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：288 nm（阿司巴汀）和350 nm（异荭草苷、荭草苷）；进样量：5 μL。
1.2.3 色谱条件考察
1.2.3.1 检测波长的选择
分别取异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀对照品适量，加入60%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度约为10 μg/mL的溶液。按“1.2.2”色谱条件，同时设置二极管阵列检测器在210~400 nm范围内进行光谱扫描，取上述对照品溶液注入液相色谱仪，记录各对照品溶液的光谱扫描图，考察各对照品溶液的最佳检测波长。
1.2.3.2 流动相的优化
分别采用乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液和乙腈-1%冰醋酸水溶液进行流动相的筛选，考察对待测成分与相邻未知成分分离度的影响。
1.2.3.3 色谱柱的选择
分别使用Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Diamonsil C18（2） （4.6 mm×250 mm，5 μm）四种不同型号的色谱柱对供试品溶液进行检测，考察对待测成分与相邻未知成分分离度的影响。
1.2.4 一测多评法的方法学考察
参考文献[31]进行实验。
1.2.4.1 专属性试验
按“1.2.2”色谱条件，取提取溶剂（60%乙醇溶液）、“1.2.1.1”项下混合对照品溶液、“1.2.1.2”项下供试品溶液、“1.2.1.3”项下阴性对照溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
1.2.4.2 线性关系、检出限和定量限考察
分别精密吸取6个系列浓度的混合对照品溶液，按“1.2.2”色谱条件测定。以各溶液质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行回归处理，绘制标准曲线。取异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀对照品溶液，逐级稀释，依照“1.2.2”色谱条件测定，计算信噪比（S/N），以S/N=3时对应的待分析物浓度为检出限，S/N=10时对应的待分析物浓度为定量限。
1.2.4.3 仪器精密度试验
精密吸取“1.2.1.1”项下混合对照品溶液，按“1.2.2”色谱条件，连续测定6次，记录异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰面积，计算峰面积和保留时间的RSD值。
1.2.4.4 稳定性试验
取同一对照品溶液和供试品溶液，按“1.2.2”色谱条件，分别于0、8、16、24 h进样测定。记录异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰面积，计算峰面积的RSD值。
1.2.4.5 重复性试验
取线叶金雀花茶（批号为20180531-1）、线叶金雀花提取物（批号为20151022）以及线叶金雀花（批号为TLE6124847），按照“1.2.1.2”项下方法分别平行制备供试品溶液6份，按照“1.2.2”色谱条件测定，计算各试样中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的含量和RSD值。
1.2.4.6 加标回收率试验
分别取已测定的样品（批号为20180531-1、20151022及TLE6124847）9份，精密称定，分别精密加入相当于供试品中待测成分含量的80%、100%、120%的混合对照品溶液，按照“1.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.2”色谱条件测定，计算试样中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的回收率和RSD值。
1.2.4.7 相对校正因子（F）和相对保留时间（RRT）的计算
在“1.2.2”色谱条件下，取按“1.2.1.1”项下方法配制的三份6个浓度的混合对照品溶液，分别在不同时间注入不同液相色谱仪，记录保留时间和峰面积，并绘制标准曲线。以异荭草苷为参照物，通过计算标准曲线斜率的比值，计算荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子；通过计算荭草苷、阿司巴汀与异荭草苷的保留时间的比值，计算荭草苷和阿司巴汀的相对保留时间。
1.2.4.8 F及RRT的耐用性考察
取按“1.2.1.2”项下方法制备的供试品溶液，分别考察流速（0.9和1.1 mL/min）、柱温（23、25和30 ℃）、不同批次色谱柱（批号分别为0314380961、0309372961和0313380991）和不同仪器（Agilent 1260、Waters e2695和 Waters UPLC H-Class）等条件的变化对对荭草苷及阿司巴汀F和RRT的影响。
1.2.5 QAMS法与外标法结果比较研究
采用HPLC法，以异荭草苷作为“一测多评法”的参照成分测定其在线叶金雀花及其制品中的含量，并通过荭草苷和阿司巴汀的F，分别计算出这两种成分的含量。同时，使用外标法测定线叶金雀花及其制品中荭草苷和阿司巴汀的含量，从而验证QAMS法用于测定线叶金雀花及其制品中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀结果的准确性。
1.3 数据处理
通过Agilent 1260仪器配套的Agilent OpenLAB色谱处理软件和Waters e2695以及Waters ACQUITY UPLC H-Class仪器配套的Empower色谱处理软件完成数据采集、处理和计算，Microsoft Excel 2010软件进行数据汇总和分析。
2. 结果与分析
2.1 色谱条件的优化结果
2.1.1 检测波长的选择
通过二极管阵列检测器对对照品溶液在210~400 nm范围内的光谱扫描，结果见图1，其中异荭草苷和荭草苷的最大吸收波长约为350 nm，阿司巴汀的最大吸收波长约为288 nm。因此，选择在288 nm波长下测定阿司巴汀，在350 nm波长下测定异荭草苷和荭草苷。
2.1.2 流动相的优化
当使用乙腈−0.1%冰醋酸水溶液或乙腈−0.2%甲酸水溶液作为流动相时，在350 nm下异荭草苷峰与相邻未知峰的分离度小于1.5，在288 nm下阿司巴汀峰与相邻未知峰的分离度小于1.5。而当使用乙腈−1%冰醋酸水溶液作为流动相时，3种待测成分峰与相邻色谱峰的分离度良好、峰型良好，且保留时间适中（见图2）。因此本实验选用乙腈−1%冰醋酸水溶液作为异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀含量测定的流动相。
2.1.3 色谱柱的选择
本实验使用了四种不同型号的C18色谱柱进行测定，结果发现3种待测成分色谱峰的出峰顺序、保留时间、峰型和分离度均有较大差异，这会影响相对校正因子和相对保留时间的计算。当使用Waters Symmetry C18色谱柱时，3种待测成分峰与相邻色谱峰的分离度良好、峰型良好，保留时间适中（见图2）。因此，本实验选择Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行测定。
2.2 一测多评法的方法学考察结果
2.2.1 专属性试验
测得提取溶剂色谱图、阴性对照溶液色谱图、对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图，结果如图3所示，从图中可以看出，提取溶剂色谱图以及阴性对照溶液色谱图中均未见与对照品溶液色谱图中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀相同保留时间的色谱峰，证明提取溶剂以及阴性无干扰。
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图 3 288与350 nm下各测试溶液的色谱图注：A：阴性对照溶液；B：提取溶剂；C：供试品溶液；D：对照品溶液。Figure 3. Chromatogram of each solution at 288 and 350 nm2.2.2 线性关系、检出限和定量限考察
通过各对照品溶液质量浓度对峰面积的回归处理，各物质的回归方程、相关系数和线性范围结果见表1。结果表明，异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀这三种成分在线性范围内与峰面积线性关系良好，R2>0.9990。以S/N=3时计算得出检出限（LOD）为4.6～34.5 ng/mL，S/N=10时计算得出定量限（LOQ）为23.2～137.9 ng/mL（见表1）。
表 1 对照品的线性关系、检出限与定量限Table 1. Linear relationships, LODs and LOQs of reference substance成分 回归方程 R2 线性范围（μg/mL） 检出限（ng/mL） 定量限（ng/mL） 异荭草苷 Y=14.86X+5.36 0.99992 4.8～142.8 4.9 24.6 荭草苷 Y=13.80X+5.29 0.99992 4.4～133.2 4.6 23.2 阿司巴汀 Y=12.34X+0.84 0.99997 1.8～54.8 34.5 137.9 2.2.3 仪器精密度试验
测定结果见表2。结果表明，3种待测成分的保留时间与峰面积的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。
表 2 仪器精密度试验结果Table 2. Results of instrument precision test成分 进样次数 1 2 3 4 5 6 RSD（%） 异荭草苷 峰面积 358.5 359.1 359.4 357.5 357.8 358.0 0.21 保留时间（min） 20.771 20.892 20.929 20.951 20.878 20.914 0.30 荭草苷 峰面积 307.7 308.1 308.2 306.1 306.6 307.0 0.28 保留时间（min） 22.122 22.231 22.259 22.280 22.220 22.252 0.25 阿司巴汀 峰面积 90.5 90.2 90.4 89.7 89.9 90.0 0.34 保留时间（min） 24.214 24.317 24.335 24.352 24.304 24.329 0.20 2.2.4 稳定性试验
测定结果见表3。结果表明，3种待测成分的峰面积RSD均小于2%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
表 3 稳定性试验结果Table 3. Results of stability test试液 待测成分 峰面积 RSD（%） 0 h 8 h 16 h 24 h 对照品溶液 异荭草苷 345.9 352.0 354.5 352.7 1.1 荭草苷 303.3 301.0 304.8 302.5 0.5 阿司巴汀 89.3 90.0 90.7 90.5 0.7 线叶金雀花溶液 异荭草苷 811.3 818.1 815.5 814.5 0.3 荭草苷 616.2 623.5 621.5 621.0 0.5 阿司巴汀 290.4 288.3 285.7 283.1 1.1 线叶金雀花提取物溶液 异荭草苷 722.1 727.3 725.8 720.9 0.4 荭草苷 813.6 820.6 817.5 813.5 0.4 阿司巴汀 183.9 181.8 180.6 177.8 1.4 线叶金雀花茶溶液 异荭草苷 858.9 861.5 855.4 862.2 0.4 荭草苷 968.5 970.0 964.1 972.4 0.4 阿司巴汀 218.7 220.5 215.7 214.4 1.3 2.2.5 重复性试验
测定结果见表4。结果表明，各测试结果的RSD均小于2%，表明本法具有较好的重复性。
表 4 重复性试验结果Table 4. Results of repeatability test试样 待测成分 含量（%） 平均含量（%） RSD（%） 1 2 3 4 5 6 线叶金雀花 异荭草苷 0.271 0.268 0.260 0.266 0.266 0.271 0.27 1.6 荭草苷 0.221 0.219 0.212 0.217 0.217 0.220 0.22 1.5 阿司巴汀 0.113 0.113 0.110 0.112 0.113 0.112 0.11 1.0 线叶金雀花提取物 异荭草苷 0.600 0.597 0.600 0.602 0.595 0.600 0.60 0.5 荭草苷 0.729 0.725 0.729 0.731 0.722 0.729 0.73 0.5 阿司巴汀 0.182 0.180 0.181 0.182 0.180 0.182 0.18 0.5 线叶金雀花茶 异荭草苷 0.481 0.481 0.477 0.475 0.477 0.479 0.48 0.5 荭草苷 0.583 0.583 0.578 0.575 0.579 0.581 0.58 0.5 阿司巴汀 0.146 0.146 0.144 0.143 0.144 0.145 0.14 0.7 2.2.6 加标回收率试验
测定结果见表5。结果表明，回收率在97.4%～101.8%之间，RSD均小于3%，表明本法具有较好的准确度。
表 5 加标回收率试验结果Table 5. Results of spiked recovery test试样 待测成分 低浓度 中浓度 高浓度 平均回收率（%） RSD（%） 加入量（ug） 回收率（%） 加入量（ug） 回收率（%） 加入量（ug） 回收率（%） 线叶金雀花 异荭草苷 558.6 102.3 670.3 101.7 782.0 101.5 101.8 1.6 荭草苷 443.7 98.4 532.4 99.4 621.2 100.7 99.5 1.6 阿司巴汀 227.0 99.2 272.5 98.2 317.9 97.8 98.4 1.8 线叶金雀花提取物 异荭草苷 446.9 103.7 614.5 102.0 782.0 98.5 101.4 2.5 荭草苷 532.4 101.2 709.9 99.3 887.4 97.0 99.2 2.0 阿司巴汀 136.2 102.9 181.6 100.9 227.0 98.0 100.6 2.2 线叶金雀花茶 异荭草苷 558.6 98.8 726.2 97.5 893.8 97.6 98.0 0.9 荭草苷 709.9 98.6 887.4 96.9 1064.8 96.8 97.4 1.2 阿司巴汀 170.3 101.8 215.7 100.2 261.1 99.5 100.5 1.2 2.2.7 相对校正因子（F）和相对保留时间（RRT）的计算
相对校正因子常用计算方法有多点法、斜率法和过原点的曲线斜率法[32]，本实验采用斜率法。本实验分别测得异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的标准曲线斜率，以异荭草苷为参照物，通过计算其与荭草苷和阿司巴汀的标准曲线斜率的比值，得出荭草苷的相对校正因子为1.068，阿司巴汀的相对校正因子为1.165；通过计算其与荭草苷和阿司巴汀的保留时间的比值，得出荭草苷的相对保留时间为1.066，阿司巴汀的相对保留时间为1.168，结果见表6。
表 6 相对校正因子和相对保留时间的计算结果Table 6. Results of relative correction factor and relative retention time序号 标准曲线 相对校正因子（F） 相对保留时间（RRT） 荭草苷 阿司巴汀 荭草苷 阿司巴汀 1 异荭草苷：y=14.86237x+5.36195（R2=0.99992）
荭草苷：y=13.79783x+5.29306（R2=0.99992）
阿司巴汀：y=12.34226x+0.844934（R2=0.99997）1.077153 1.204185 1.06495 1.16552 2 异荭草苷：y=14.92209x+5.52461（R2=0.99993）
荭草苷：y=13.88435x+5.32661（R2=0.99992）
阿司巴汀：y=12.30972x+1.16918（R2=0.99995）1.074742 1.21222 1.06459 1.16503 3 异荭草苷：y=14.63282x−7.23765（R2=0.99990）
荭草苷：y=13.68416x−6.36172（R2=0.99991）
阿司巴汀：y=12.48093x−2.08913（R2=0.99999）1.069325 1.172414 1.06509 1.16617 4 异荭草苷：y=14.82194x−7.63723（R2=0.99992）
荭草苷：y=13.87472x−6.79603（R2=0.99992）
阿司巴汀：y=12.53474x−1.92227（R2=0.99998）1.068269 1.182469 1.06512 1.16585 5 异荭草苷：y=5719.998x−7810.512（R2=0.99993）
荭草苷：y=5406.353x−6654.474（R2=0.99947）
阿司巴汀：y=5102.911x−1624.948（R2=0.99997）1.058014 1.120928 1.06657 1.16725 6 异荭草苷：y=6203.96x−2848.603（R2=0.99996）
荭草苷：y=5812.418x−2381.947（R2=0.99996）
阿司巴汀：y=5458.746x−1695.764（R2=0.99996）1.067363 1.136517 1.06536 1.1673 7 异荭草苷：y=6012.082x−1183.434（R2=0.99983）
荭草苷：y=5663.921x−6606.421（R2=0.99994）
阿司巴汀：y=5339.457x−2372.324（R2=0.99997）1.06147 1.125973 1.06851 1.17561 平均 1.068 1.165 1.066 1.168 RSD（%） 0.63 3.21 0.13 0.31 2.2.8 F及RRT的耐用性考察
2.2.8.1 不同流动相流量对F及RRT的影响
考察了不同流量（0.9、1.0、1.1 mL/min）对各成分F及RRT的影响。结果见表7，各成分F的RSD分别为0.44%、2.64%，各成分RRT的RSD分别为0.24%、0.86%。结果表明体积流量的微小变化对荭草苷及阿司巴汀的F及RRT均无明显影响。
表 7 不同流量对F和RRT的影响Table 7. F and RRT factors of different flow rates流量（mL/min） 荭草苷 阿司巴汀 F RRT F RRT 0.9 1.077 1.064 1.223 1.159 1.0 1.068 1.066 1.165 1.168 1.1 1.075 1.069 1.216 1.179 均值 1.073 1.066 1.201 1.179 RSD（%） 0.44 0.24 2.64 0.86 2.2.8.2 不同色谱柱温度对F及RRT的影响
考察了不同色谱柱温度（23、25和30 ℃）对各成分F及RRT的影响。结果见表8，各成分F的RSD分别为0.28%、2.60%，各成分RRT的RSD分别为0.58%、1.63%。结果表明色谱柱温度的微小变化对荭草苷及阿司巴汀的F及RRT均无明显影响。
表 8 不同色谱柱温度对F和RRT的影响Table 8. F and RRT factors of different column temperatures色谱柱温度（℃） 荭草苷 阿司巴汀 F RRT F RRT 23 1.074 1.063 1.221 1.158 25 1.068 1.066 1.165 1.168 30 1.071 1.075 1.217 1.195 均值 1.071 1.068 1.201 1.174 RSD（%） 0.28 0.58 2.60 1.63 2.2.8.3 不同批次色谱柱和不同仪器对F及RRT的影响
在色谱条件的优化试验中，确定了采用Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行测定。因此，本试验在1.2.2色谱条件下，考察了不同批次色谱柱（批号分别为0314380961、0309372961和0313380991）和不同仪器（Agilent 1260、Waters e2695和 Waters UPLC H-Class）对各成分F及RRT的影响，结果见表9，各成分F的RSD分别为0.53%、1.74%，各成分RRT的RSD分别为0.25%、0.22%。结果表明荭草苷及阿司巴汀的F及RRT在不同批次色谱柱上的重现性较好，仪器的更换对荭草苷及阿司巴汀的F及RRT均无明显影响。
表 9 不同批次色谱柱和不同仪器对F和RRT的影响Table 9. F and RRT factors of columns in different batches and different instruments不同批次色谱柱和仪器 荭草苷 阿司巴汀 F RRT F RRT 安捷伦1260
（色谱柱批号0314380961）1.071 1.065 1.206 1.166 Waters UPLC H-Class
（色谱柱批号0309372961）1.068 1.066 1.165 1.168 Waters e2695
（色谱柱批号0313380991）1.062 1.061 1.189 1.171 均值 1.067 1.064 1.187 1.168 RSD（%） 0.53 0.25 1.74 0.22 2.3 QAMS 法与外标法结果比较研究
采用QAMS法和外标法测定线叶金雀花及其制品中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的含量结果见表10，将2种方法所得含量经秩和检验[33]分析二者差异，结果荭草苷两组数据间P值为0.739，阿司巴汀两组数据间P值为0.075，均大于0.05，故荭草苷、阿司巴汀外标法实测值与一测多评法计算值间无显著性差异，表明建立的QAMS法准确可行。
表 10 QAMS法与外标法测定线叶金雀花及其制品中3种成分的比较Table 10. Comparison of three components in Aspalathus linearis and its products by QAMS and external standard method样品及批号 异荭草苷（g/100 g） 荭草苷（g/100 g） 阿司巴汀（g/100 g） 外标法 QAMS 外标法 QAMS 外标法 线叶金雀花 TLE6124846 0.24±0.002 0.19±0.005 0.19±0.005 0.060±0.001 0.055±0.001 TLE6124847 0.28±0.006 0.22±0.005 0.22±0.006 0.11±0.001 0.10±0.001 TLE6124848 0.23±0.002 0.17±0.009 0.17±0.010 1.53±0.048 1.35±0.051 线叶金雀花提取物 20151022 0.64±0.002 0.75±0.003 0.75±0.003 0.19±0.002 0.17±0.002 20150203 0.85±0.007 0.89±0.001 0.89±0.002 5.15±0.050 5.29±0.053 20171011-1 0.81±0.001 0.94±0.004 0.93±0.004 0.21±0.001 0.19±0.002 20171011-2 0.84±0.006 0.83±0.001 0.82±0.001 4.46±0.036 4.33±0.038 20171010 0.91±0.002 1.09±0.002 1.10±0.003 0.14±0.001 0.15±0.001 20180205 0.85±0.006 0.99±0.004 0.99±0.005 0.32±0.001 0.28±0.001 20180424 0.95±0.002 0.96±0.003 0.96±0.003 0.47±0.002 0.42±0.003 20180525 0.78±0.007 0.79±0.002 0.79±0.002 0.29±0.002 0.32±0.003 18-190 0.61±0.002 0.79±0.002 0.78±0.002 0.19±0.001 0.17±0.001 18-071 0.59±0.001 0.63±0.002 0.69±0.002 0.11±0.001 0.092±0.001 1807-014 0.99±0.002 1.26±0.005 1.26±0.007 0.061±0.001 0.065±0.001 线叶金雀花茶 20180531-1 0.52±0.001 0.62±0.002 0.62±0.002 0.14±0.001 0.15±0.001 20180531-2 0.65±0.002 0.66±0.002 0.66±0.003 0.25±0.002 0.23±0.003 20180531-3 0.47±0.002 0.57±0.002 0.56±0.002 0.070±0.001 0.067±0.001 3. 结论
本实验建立了线叶金雀花及其制品中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的一测多评检测方法，考察了专属性、仪器精密度、稳定性、重复性以及回收率，结果阴性无干扰，仪器精密度、稳定性和重复性RSD值均小于3%，回收率在 97.4%～101.8%之间；同时，该方法在不同流动相流量、不同色谱柱温度、不同批次色谱柱和不同高效液相色谱仪等条件下均有良好的重复性，耐用性良好。本实验还对外标法测得值和QAMS法计算值进行了秩和检验分析，结果2种方法所得含量之间无显著性差异（P>0.05），表明建立的QAMS法准确可行。线叶金雀花及其制品中化学成分众多，以外标法测定各成分含量需要对照品的数量多，部分对照品价格昂贵且难以获取，采用QAMS法测定各成分含量能极大地减少对照品使用数量，节约成本，增加检测便利性。因此，QAMS法用于线叶金雀花及其制品的质量控制具有极高的实用性、便利性和科学性。
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图 3 288与350 nm下各测试溶液的色谱图
注：A：阴性对照溶液；B：提取溶剂；C：供试品溶液；D：对照品溶液。
Figure 3. Chromatogram of each solution at 288 and 350 nm
表 1 对照品的线性关系、检出限与定量限
Table 1 Linear relationships, LODs and LOQs of reference substance
成分 回归方程 R2 线性范围（μg/mL） 检出限（ng/mL） 定量限（ng/mL） 异荭草苷 Y=14.86X+5.36 0.99992 4.8～142.8 4.9 24.6 荭草苷 Y=13.80X+5.29 0.99992 4.4～133.2 4.6 23.2 阿司巴汀 Y=12.34X+0.84 0.99997 1.8～54.8 34.5 137.9 
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表 2 仪器精密度试验结果
Table 2 Results of instrument precision test
成分 进样次数 1 2 3 4 5 6 RSD（%） 异荭草苷 峰面积 358.5 359.1 359.4 357.5 357.8 358.0 0.21 保留时间（min） 20.771 20.892 20.929 20.951 20.878 20.914 0.30 荭草苷 峰面积 307.7 308.1 308.2 306.1 306.6 307.0 0.28 保留时间（min） 22.122 22.231 22.259 22.280 22.220 22.252 0.25 阿司巴汀 峰面积 90.5 90.2 90.4 89.7 89.9 90.0 0.34 保留时间（min） 24.214 24.317 24.335 24.352 24.304 24.329 0.20
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表 3 稳定性试验结果
Table 3 Results of stability test
试液 待测成分 峰面积 RSD（%） 0 h 8 h 16 h 24 h 对照品溶液 异荭草苷 345.9 352.0 354.5 352.7 1.1 荭草苷 303.3 301.0 304.8 302.5 0.5 阿司巴汀 89.3 90.0 90.7 90.5 0.7 线叶金雀花溶液 异荭草苷 811.3 818.1 815.5 814.5 0.3 荭草苷 616.2 623.5 621.5 621.0 0.5 阿司巴汀 290.4 288.3 285.7 283.1 1.1 线叶金雀花提取物溶液 异荭草苷 722.1 727.3 725.8 720.9 0.4 荭草苷 813.6 820.6 817.5 813.5 0.4 阿司巴汀 183.9 181.8 180.6 177.8 1.4 线叶金雀花茶溶液 异荭草苷 858.9 861.5 855.4 862.2 0.4 荭草苷 968.5 970.0 964.1 972.4 0.4 阿司巴汀 218.7 220.5 215.7 214.4 1.3
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表 4 重复性试验结果
Table 4 Results of repeatability test
试样 待测成分 含量（%） 平均含量（%） RSD（%） 1 2 3 4 5 6 线叶金雀花 异荭草苷 0.271 0.268 0.260 0.266 0.266 0.271 0.27 1.6 荭草苷 0.221 0.219 0.212 0.217 0.217 0.220 0.22 1.5 阿司巴汀 0.113 0.113 0.110 0.112 0.113 0.112 0.11 1.0 线叶金雀花提取物 异荭草苷 0.600 0.597 0.600 0.602 0.595 0.600 0.60 0.5 荭草苷 0.729 0.725 0.729 0.731 0.722 0.729 0.73 0.5 阿司巴汀 0.182 0.180 0.181 0.182 0.180 0.182 0.18 0.5 线叶金雀花茶 异荭草苷 0.481 0.481 0.477 0.475 0.477 0.479 0.48 0.5 荭草苷 0.583 0.583 0.578 0.575 0.579 0.581 0.58 0.5 阿司巴汀 0.146 0.146 0.144 0.143 0.144 0.145 0.14 0.7
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表 5 加标回收率试验结果
Table 5 Results of spiked recovery test
试样 待测成分 低浓度 中浓度 高浓度 平均回收率（%） RSD（%） 加入量（ug） 回收率（%） 加入量（ug） 回收率（%） 加入量（ug） 回收率（%） 线叶金雀花 异荭草苷 558.6 102.3 670.3 101.7 782.0 101.5 101.8 1.6 荭草苷 443.7 98.4 532.4 99.4 621.2 100.7 99.5 1.6 阿司巴汀 227.0 99.2 272.5 98.2 317.9 97.8 98.4 1.8 线叶金雀花提取物 异荭草苷 446.9 103.7 614.5 102.0 782.0 98.5 101.4 2.5 荭草苷 532.4 101.2 709.9 99.3 887.4 97.0 99.2 2.0 阿司巴汀 136.2 102.9 181.6 100.9 227.0 98.0 100.6 2.2 线叶金雀花茶 异荭草苷 558.6 98.8 726.2 97.5 893.8 97.6 98.0 0.9 荭草苷 709.9 98.6 887.4 96.9 1064.8 96.8 97.4 1.2 阿司巴汀 170.3 101.8 215.7 100.2 261.1 99.5 100.5 1.2
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表 6 相对校正因子和相对保留时间的计算结果
Table 6 Results of relative correction factor and relative retention time
序号 标准曲线 相对校正因子（F） 相对保留时间（RRT） 荭草苷 阿司巴汀 荭草苷 阿司巴汀 1 异荭草苷：y=14.86237x+5.36195（R2=0.99992）
荭草苷：y=13.79783x+5.29306（R2=0.99992）
阿司巴汀：y=12.34226x+0.844934（R2=0.99997）1.077153 1.204185 1.06495 1.16552 2 异荭草苷：y=14.92209x+5.52461（R2=0.99993）
荭草苷：y=13.88435x+5.32661（R2=0.99992）
阿司巴汀：y=12.30972x+1.16918（R2=0.99995）1.074742 1.21222 1.06459 1.16503 3 异荭草苷：y=14.63282x−7.23765（R2=0.99990）
荭草苷：y=13.68416x−6.36172（R2=0.99991）
阿司巴汀：y=12.48093x−2.08913（R2=0.99999）1.069325 1.172414 1.06509 1.16617 4 异荭草苷：y=14.82194x−7.63723（R2=0.99992）
荭草苷：y=13.87472x−6.79603（R2=0.99992）
阿司巴汀：y=12.53474x−1.92227（R2=0.99998）1.068269 1.182469 1.06512 1.16585 5 异荭草苷：y=5719.998x−7810.512（R2=0.99993）
荭草苷：y=5406.353x−6654.474（R2=0.99947）
阿司巴汀：y=5102.911x−1624.948（R2=0.99997）1.058014 1.120928 1.06657 1.16725 6 异荭草苷：y=6203.96x−2848.603（R2=0.99996）
荭草苷：y=5812.418x−2381.947（R2=0.99996）
阿司巴汀：y=5458.746x−1695.764（R2=0.99996）1.067363 1.136517 1.06536 1.1673 7 异荭草苷：y=6012.082x−1183.434（R2=0.99983）
荭草苷：y=5663.921x−6606.421（R2=0.99994）
阿司巴汀：y=5339.457x−2372.324（R2=0.99997）1.06147 1.125973 1.06851 1.17561 平均 1.068 1.165 1.066 1.168 RSD（%） 0.63 3.21 0.13 0.31
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表 7 不同流量对F和RRT的影响
Table 7 F and RRT factors of different flow rates
流量（mL/min） 荭草苷 阿司巴汀 F RRT F RRT 0.9 1.077 1.064 1.223 1.159 1.0 1.068 1.066 1.165 1.168 1.1 1.075 1.069 1.216 1.179 均值 1.073 1.066 1.201 1.179 RSD（%） 0.44 0.24 2.64 0.86
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表 8 不同色谱柱温度对F和RRT的影响
Table 8 F and RRT factors of different column temperatures
色谱柱温度（℃） 荭草苷 阿司巴汀 F RRT F RRT 23 1.074 1.063 1.221 1.158 25 1.068 1.066 1.165 1.168 30 1.071 1.075 1.217 1.195 均值 1.071 1.068 1.201 1.174 RSD（%） 0.28 0.58 2.60 1.63
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表 9 不同批次色谱柱和不同仪器对F和RRT的影响
Table 9 F and RRT factors of columns in different batches and different instruments
不同批次色谱柱和仪器 荭草苷 阿司巴汀 F RRT F RRT 安捷伦1260
（色谱柱批号0314380961）1.071 1.065 1.206 1.166 Waters UPLC H-Class
（色谱柱批号0309372961）1.068 1.066 1.165 1.168 Waters e2695
（色谱柱批号0313380991）1.062 1.061 1.189 1.171 均值 1.067 1.064 1.187 1.168 RSD（%） 0.53 0.25 1.74 0.22
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表 10 QAMS法与外标法测定线叶金雀花及其制品中3种成分的比较
Table 10 Comparison of three components in Aspalathus linearis and its products by QAMS and external standard method
样品及批号 异荭草苷（g/100 g） 荭草苷（g/100 g） 阿司巴汀（g/100 g） 外标法 QAMS 外标法 QAMS 外标法 线叶金雀花 TLE6124846 0.24±0.002 0.19±0.005 0.19±0.005 0.060±0.001 0.055±0.001 TLE6124847 0.28±0.006 0.22±0.005 0.22±0.006 0.11±0.001 0.10±0.001 TLE6124848 0.23±0.002 0.17±0.009 0.17±0.010 1.53±0.048 1.35±0.051 线叶金雀花提取物 20151022 0.64±0.002 0.75±0.003 0.75±0.003 0.19±0.002 0.17±0.002 20150203 0.85±0.007 0.89±0.001 0.89±0.002 5.15±0.050 5.29±0.053 20171011-1 0.81±0.001 0.94±0.004 0.93±0.004 0.21±0.001 0.19±0.002 20171011-2 0.84±0.006 0.83±0.001 0.82±0.001 4.46±0.036 4.33±0.038 20171010 0.91±0.002 1.09±0.002 1.10±0.003 0.14±0.001 0.15±0.001 20180205 0.85±0.006 0.99±0.004 0.99±0.005 0.32±0.001 0.28±0.001 20180424 0.95±0.002 0.96±0.003 0.96±0.003 0.47±0.002 0.42±0.003 20180525 0.78±0.007 0.79±0.002 0.79±0.002 0.29±0.002 0.32±0.003 18-190 0.61±0.002 0.79±0.002 0.78±0.002 0.19±0.001 0.17±0.001 18-071 0.59±0.001 0.63±0.002 0.69±0.002 0.11±0.001 0.092±0.001 1807-014 0.99±0.002 1.26±0.005 1.26±0.007 0.061±0.001 0.065±0.001 线叶金雀花茶 20180531-1 0.52±0.001 0.62±0.002 0.62±0.002 0.14±0.001 0.15±0.001 20180531-2 0.65±0.002 0.66±0.002 0.66±0.003 0.25±0.002 0.23±0.003 20180531-3 0.47±0.002 0.57±0.002 0.56±0.002 0.070±0.001 0.067±0.001
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