羊乳作为一种重要的营养来源，富含蛋白质、脂肪、乳糖、维生素、矿物质等多种生物活性成分，并且其所含有的蛋白结构成分与母乳基本相同，被营养学界称为“奶中之王”^[1]。随着羊乳受到消费者越来越多的重视，各种羊乳制品层出不穷。自2013年国务院《关于进一步加强婴幼儿配方乳粉质量安全工作的意见》中首次明确羊乳可作为婴幼儿配方乳粉原料，市场上便出现大量以羊奶卖点的婴幼儿乳制产品。与牛奶乳制品相比，羊奶蛋白分子小、易吸收、营养价值高，通常来说也具有比牛奶蛋白更低的致敏性^[2-3]。然而，市场上的多数“羊奶粉”掺入牛乳蛋白，使得这些产品存在食用致敏风险，同时存在价格欺骗和虚假标识，阻碍了羊奶市场的健康发展^[4]。因此，开发灵敏、稳定、便捷、低成本的羊奶鉴伪技术值得关注。

目前羊奶及乳制品中蛋白质检测及鉴定方法主要有聚合酶链式反应技术、超高效液相-串联质谱法、酶联免疫检测法、毛细管电泳分析方法等^[5-6]。液相色谱联用质谱方法可以通过测定完整蛋白质分子^[7]，或者测定酶解后标志性多肽对蛋白浓度进行准确测定^[8]。然而，仪器方法需要价格昂贵的质谱仪器、电泳分析仪器或者PCR仪器，同时前处理过程复杂，无法在现场使用。免疫学检测方法具有简便、快速的优势，在乳制品蛋白质检测领域研究广泛。比如王毅通过杂交瘤技术制备了牛α-酪蛋白单克隆抗体，建立了测定羊乳中牛α-酪蛋白的ELISA方法，检测灵敏度为13.7 ng/mL^[9]。目前所开发的免疫学检测方法多以乳制品蛋白的定量检测为主，对不同来源同类乳制品中进行鉴伪和筛查的快速检测方法报道不多。薛海燕等报道了牛乳酪蛋白双联胶体金免疫层析试纸条的研制，可检出的牛乳最低掺伪量为5%^[10]；张颖报道了基于β-乳球蛋白的牛羊乳区别免疫学检测技术，可检出的牛乳最低掺伪量为2%^[11]。

为开发一种便捷、快速的羊奶掺伪免疫试纸条快速检测方法，本实验以筛选到的酪蛋白单克隆抗体为原料，制备了胶体金免疫层析试纸条，评价了该方法的检测限，并研究加热、酶解蛋白过程对检测的影响，同时探究酪蛋白抗体结合特异性，为酪蛋白真实性鉴别技术的开发和应用提供依据。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

羊奶　采集自人工养殖的山羊奶；牛奶　为市售纯牛奶；酪蛋白抗体（效价为1:10⁶）、兔IgG、抗兔IgG抗体　与北京美正生物科技有限公司合作开发，酪蛋白亲和柱由本课题组自行研发及制备；牛酪蛋白、牛源α-酪蛋白（纯度≥70%）、牛源β-酪蛋白（纯度≥98%）　西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；合成多肽（GPFPIIV、VLPVPQK、YQEPVLGPVR和GPFPILV）　纯度≥95%，合肥国肽生物科技有限公司；胰酶（酶活力≥250 usp units/mg）、胃蛋白酶（酶活力≥3000 usp units/mg）、糜蛋白酶（酶活力≥800 usp units/mg）　上海麦克林生化科技有限公司。

HM3035三维划膜喷金仪器　上海金标生物科技有限公司；HMG001胶体金便携式读数仪器　北京华安麦科生物技术有限公司；UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS液质联用仪器　赛默飞世尔科技公司。

1.2   实验方法

1.2.1   金标微孔试剂的制备

金标微孔试剂包含冷冻干燥的金标酪蛋白抗体金和金标兔IgG抗体，其制备过程如下。胶体金颗粒通过柠檬酸三钠还原氯金酸溶液反应制得，粒径在20~40 nm，酪蛋白抗体和兔IgG抗体通过静电标记技术标记到金纳米粒子表面^[12]。酪蛋白抗体标记金纳米粒子优化后使用浓度为4 µg/mL，兔IgG抗体标记金纳米粒子优化后使用浓度为2 µg/mL。将两种金标抗体标记物按照1:1比例混合均匀后，移取200 µL混合标记溶液到96孔酶标板的微孔中，并进行冷冻干燥，条件为真空度50 Pa，冷井温度−50 ℃，时间24 h，用锡箔纸热封保存，待用。

1.2.2   免疫快速检测试纸条的制备

分离式胶体金试纸条包含金标微孔试剂和喷有控制线（C线）和检测线（T线）的试纸条，结构示意图见图1。按照图1组装胶体金免疫快速检测试纸条。用三维划膜喷金仪器将包被抗原β-酪蛋白（0.2 mg/mL）和兔IgG（0.1 mg/mL）按照1 µL/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线和控制线，37 °C烘箱烘干2 h。然后将样品垫和吸水垫按照顺序组装在PVC底板上，通过斩切机制备试纸条，待用^[13]。

图  1  酪蛋白胶体金试纸条检测过程示意图

Figure  1.  Schematic diagram of detection process of casein colloidal gold test strip

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1.2.3   牛酪蛋白胶体金免疫层析试纸条检测标准曲线的建立

将购买的纯牛奶（蛋白含量为3.6 g/100 g）按照 0、0.3、0.6、1.2、3、6、12、24 mg/100 g的比例添加到纯羊奶中并混匀，形成羊奶-牛奶掺混标准溶液。取200 µL混匀样品，加入金标微孔中，40 °C孵育2 min，然后插入胶体金试纸条，反应5 min。停止计时后，将试纸条样品垫末端用吸水纸吸干，通过胶体金便携式读数仪器读取试纸条上检测线和控制线的光密度值，并获得RLU值（检测线光密度值/控制线光密度值）。同时进行拍照记录实验结果。以牛奶掺入量（mg/100 g）和RLU值拟合作图，获得标准曲线。

1.2.4   样品经过煮沸和酶解处理对胶体金试纸条检测结果的影响

将5 mL牛奶和羊奶装入10 mL离心管，在沸水浴上煮沸5 min后冷却至室温，然后各取1 mL样品加入胰酶至终浓度0.1%，室温酶解16 h，用胶体金试纸条测试羊奶和牛奶样品煮沸处理和酶解实验对检测结果的影响。

1.2.5   酪蛋白胶体金试纸条快速检测方法特异性分析

用50 mmol/L碳酸氢铵配制牛源α-酪蛋白和β-酪蛋白标准溶液，浓度分别为5.6和6.3 mg/mL。用羊奶稀释至56和63 mg/100 g并检测，分析胶体金试纸条对α-酪蛋白和β-酪蛋白的识别。同时取500 µL纯α-酪蛋白和β-酪蛋白溶液用0.1%的胰酶进行酶解，获得酶解多肽溶液，按同样比例用羊奶稀释后检测。

1.2.6   牛源酪蛋白酶解多肽与抗体亲和实验分析

通过顺序酶解实验制备了胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶联合酶解的酪蛋白酶解液，并通过制备酪蛋白亲和柱研究酶解多肽与抗体的亲和特性。

称取100 mg的酪蛋白到盛有20 mL超纯水的烧杯中，在45 °C水浴搅拌溶解，溶解完成后用1 mol/L HCl调节pH到2.0左右，并定容到50 mL。为保证充分酶解，加入30 mg胃蛋白酶进行37 °C水解3 h后，用1 mol/L NaOH调节pH到7.0左右，加入40 mg胰蛋白酶进行37 °C水解3 h。用1 mol/L NaOH调节pH到8.0左右，加入40 mg糜蛋白酶进行37 ℃水解3 h后，取出上清液2 mL用分子量3 kDa的超滤管进行超滤，多次超滤收集酶解多肽溶液。

取5 mL酶解多肽溶液过亲和柱，控制液滴流出速度1 滴/s，接着用20 mL超纯水分两次洗涤，然后用1 mL甲醇洗脱。将洗脱液中的甲醇用氮气吹干后，加2 mL的50%乙腈水溶液溶解，震荡混匀，过0.2 μm有机膜待测。同时收集过亲和柱未结合的多肽溶液。

用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS液质联用仪器测定从亲和柱洗脱下的多肽，同时对过柱前的酶解溶液及过柱过程中未结合的多肽样品进行测定。分离柱为ZORBAX Eclipse Plus C₁₈ 600 Bar 2.1 mm×100 mm，1.8 µm；流速0.3 mL/min，分离检测流动相条件见表1。

表  1  测定酪蛋白酶解多肽梯度洗脱条件

Table  1.  Instrument conditions for detection of peptides in casein hydrolysates

洗脱时间（min）	流动相体积分数（%）
	A 0.1%甲酸溶液	B 100%乙腈
0	90	10
5	70	30
15	2	98
19	2	98
20	90	10
21	90	10

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获得仪器检测数据通过Peaks Studio软件进行分析，鉴定洗脱液中存在的多肽序列。基于所获得的牛源酪蛋白多肽，分析同区域羊源酪蛋白的序列结构。通过人工方法合成多肽序列，结合胶体金试纸条对于多肽与抗体之间的结合能力进行测试和验证。

1.2.7   实际样品测定

在市场上购买配料表中含羊乳或者羊奶的液态奶，用快速试纸条方法进行牛源成分测定和筛查。

1.3   数据处理

相关实验结果重复3次，图片等数据处理软件为Fireworks 8.0和origin 8.5，液质数据处理软件为Peaks studio。

2.   结果与分析

2.1   酪蛋白胶体金试纸条标准曲线的建立

本实验在前期与北京美正生物科技有限公司合作研发获得的酪蛋白抗体的基础上，建立可用于羊奶鉴伪的酪蛋白免疫快速检测试纸条方法。将市售的纯牛奶按照0、0.3、0.6、1.2、3、6、12、24 mg/100 g（牛奶蛋白质/羊奶）的比例加入纯羊奶中并混匀，然后进行胶体金试纸条测试，结果见图2。对试纸条上检测线和控制线光密度值进行观察并进行定性判别，当羊奶中存在低于0.6 mg/100 g牛奶蛋白质时，RLU值大于1，试纸条结果定义为阴性；当羊奶中存在超过1.2 mg/100 g牛奶蛋白质时，RLU值小于1，试纸条检测结果定义为阳性。当羊奶中存在超过6 mg/100 g牛奶蛋白质时，试纸条上检测线消失，结果定义为强阳性，此时添加的牛奶蛋白质浓度值定义为试纸条的消线值（cut-off值）。此现象表明随着牛奶中的酪蛋白含量不断增加（0.3~3 mg/100 g），牛源蛋白质与金标抗体复合物不断增加，试纸条上检测线上的酪蛋白能够结合的金标抗体复合物不断减少，吸光值逐渐降低。由于控制线的显色由兔IgG和金标兔IgG抗体结合决定，不受样品中酪蛋白含量变化的影响，因此，控制线颜色基本不变。实验结果表明，本方法基于肉眼判断羊奶掺伪定性检出限为1.2 mg/100 g，消线值为6 mg/100 g。Deckwart等通过夹心ELISA方法测定酒类制品中牛源酪蛋白，最低检测线为0.2 mg/L^[14]。通过文献结果比较可以看出，本方法的灵敏度较高。

图  2  羊奶中掺入不同比例的牛奶蛋白质试纸条检测结果

Figure  2.  Results of lateral flow strip for the detection of goat milk mixed with cow milk

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同时以牛奶蛋白质的添加量和对应的RLU值为横纵坐标，进行数据拟合，发现在添加量0.3~6 mg/100 g的范围内，标准曲线呈现为拟合度比较高的S型曲线，结果见图3。由于市场上的羊奶产品若存在牛奶掺伪其添加量一般都比较高，因此，本方法在实际使用中适用于定性检测牛奶掺伪；也可以通过对样本进行多次稀释多次检测获得其掺伪添加比例。

图  3  基于便携式胶体金读数仪胶体金定量检测标准曲线

Figure  3.  Standard curve for quantitative detection based on portable colloidal gold reader

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2.2   样品煮沸和酶解处理对胶体金试纸条检测结果的影响

通过抗原抗体反应检测蛋白质，其特异性和灵敏度是由抗体与蛋白质空间结构之间的亲和特性决定的。因此，热处理和酶处理可能会改变蛋白质的空间结构并影响检测结果，并对实际样品中存在的目标蛋白检测出现低估的情况。Downs等研究发现不同的加热处理会对面团中的牛奶成分测定回收率有不同程度的影响^[15]。其中，检测牛奶中的β-乳球蛋白试剂盒对加热样品的实测值只有真实值的2%~10%；而酪蛋白试剂盒对煮沸蛋白食品的检测结果达59%；对焙烤和煎炸食品中蛋白质的回收率都低于21%。由于蛋白质在高温下的变性，因此评价蛋白质煮沸和酶解处理对胶体金试纸条检测的影响十分重要。

本实验通过对牛奶和羊奶进行沸水浴5 min和酶解16 h进行处理，研究处理过程对酪蛋白胶体金层析试纸条检测结果的影响，结果见图4。对羊奶、煮沸的羊奶及经酶解处理后的羊奶进行检测后，发现检测结果均呈阴性（以“−”表示），该现象表明经煮沸和酶解的羊奶并未在检测中出现假阳性，酶解后的羊奶中未产生可与酪蛋白抗体结合的多肽。随后对牛奶进行煮沸和酶解处理，检测结果都呈阳性（以“+”表示）。经过分析，由于酶的添加量和酶解时间的影响，牛奶酶解后仍然为阳性的原因可能是牛奶中蛋白含量非常高，导致牛奶中酪蛋白并未完全酶解完全，残留的部分牛奶酪蛋白仍然存在并被检测出。

图  4  羊奶和牛奶煮沸及酶解后胶体金试纸条测定结果

Figure  4.  Results of test strips of goat milk and cow milk treated by boiling and hydrolysis

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2.3   酪蛋白胶体金试纸条识别特异性分析

大分子蛋白质抗体的制备通常具有两种方法。一是以蛋白质整体为免疫原制备多克隆抗体或者单克隆抗体，并建立间接竞争法或者夹心法ELISA方法。比如李言言等人以山羊酪蛋白为免疫原，通过细胞融合，制备了可特异性识别山羊乳酪蛋白的单克隆抗体^[16]。二是以蛋白质上特有的一段多肽序列为免疫原，制备可识别特定多肽序列的抗体^[17]。

本实验中酪蛋白抗体是以大分子酪蛋白为免疫原制备而成，因此可以识别大分子酪蛋白完整的结构。通过研究纯品的牛源α-酪蛋白和β-酪蛋白及其酶解产物在胶体金试纸条上的反应特性，可以确定其与抗体的结合特性，结果见图5。将纯品的牛源α-酪蛋白和β-酪蛋白配置成5.6和6.3 mg/mL的溶液，用纯羊奶稀释10倍后进行测试，结果为强阳性，即56和63 mg/100 g的酪蛋白含量都超过了胶体金试纸条的消线值（cut-off）。随后取500 µL纯α-酪蛋白和β-酪蛋白溶液用0.1%的胰酶进行酶解，酶解16 h后，按照上述同样方法，用羊奶稀释10倍酶解液后进行检测，检测结果为阴性，表明该方法并不能识别酶解后的酪蛋白多肽。以上结果说明所建立的酪蛋白免疫快速识别方法可同时与α-酪蛋白和β-酪蛋白相似的空间结构反应，无法区分酪蛋白不同组分；而酶解过程会将一些特有的多肽结构打断，破坏酪蛋白的空间结构，因而无法与抗体进行高效识别。

图  5  α-酪蛋白和β-酪蛋白测定及酶解实验结果

Figure  5.  Determination of α-casein and β-casein with and without enzymatic hydrolysis

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2.4   酪蛋白酶解多肽与抗体亲和分析

为进一步确认抗体是否能够识别酶解多肽，并验证不同组分的酪蛋白酶解多肽是否能够与抗体反应，制备亲和柱富集酶解多肽并进行鉴定分析。

首先通过三种酶依次酶解牛源酪蛋白从而获得多肽酶解液，然后通过亲和柱进行富集，并分析酶解液、过柱未结合的酶解液及最终的洗脱液，通过UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS液质联用仪器进行测定，并通过Peaks Studio分析软件进行肽段鉴定和分析^[18-19]。结果表明，牛源酪蛋白中存在αS1-casein、β-casein、αS2-casein和κ-casein 四种酪蛋白组分。通过对流出液和洗脱液进行质谱检测和软件分析鉴定，发现大部分多肽并未与酪蛋白抗体亲和柱结合，在洗脱中只检测出少量的多肽序列，分别为VLPVPQK、YQEPVLGPVR和GPFPIIV， 结果见图6。

图  6  亲和柱洗脱液中三种多肽鉴定结果

Figure  6.  Peptide identification of the affinity column eluate

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通过比较已经公布的牛源和羊源酪蛋白序列，发现VLPVPQK和YQEPVLGPVR为牛羊共有的氨基酸序列，而GPFPIIV为牛源酪蛋白特有氨基酸，同区域羊源酪蛋白特有氨基酸序列为GPFPILV。通过人工方法合成区分牛源和羊源的两种多肽（GPFPIIV和GPFPILV）及共有多肽（VLPVPQK和YQEPVLGPVR），并进行胶体金试纸条方法测试。测试结果表明，多肽浓度为120 mg/100 g条件下，四种多肽检测结果都是阴性，结果见图7。说明在胶体金免疫快速检测方法不能检出以上四种酪蛋白的多肽序列。

图  7  四种多肽的胶体金检测结果

Figure  7.  Results of test strips for four artificially synthesized peptides

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分析原因，可能是由于酪蛋白抗体对多肽序列的亲和力非常低的原因，该序列只占抗体识别位点中一部分。酪蛋白的抗体结合区域的氨基酸序列确证可以通过以下方法进行，一是针对牛源酪蛋白的全序列进行分段合成，并进行亲和力分析，获得能够与抗体由结合能力的序列^[20]；二是对该抗体进行氨基酸序列分析，解析抗体序列结构^[21]，并通过分子对接等手段模拟抗体与酪蛋白的结合区域^[22-24]。

2.5   实际样品检测分析

将从市场上购买的部分羊奶产品通过试纸条方法进行检测，发现所购买的5种不同品牌的羊奶产品的检测结果都只有C线显色，T线不显色，结果为强阳性，表明虽然配料表注明含有羊奶成分，但是仍然可能含有牛源蛋白并超过6 mg/100 g。表明这些液态奶产品生产过程中羊奶作为配料之一，还掺入了部分牛奶^[25-26]。因此，本方法可以作为快速、现场检测方法用于超市、出入境等场所对羊奶掺伪牛奶进行快速筛查和检测。进一步的结果确认，还需要根据相关国家标准进行测定^[27]。

3.   结论

酪蛋白是牛乳及羊乳的主要成分，本文通过酪蛋白之间的结构差异，筛选到能够特异性识别牛乳酪蛋白的抗体，并可以用于羊奶掺假鉴定。本实验通过组装胶体金层析试纸条，可以在7 min内对羊乳制品的真实性进行鉴定，对牛源蛋白质的肉眼最低检测限为1.2 mg/100 g，试纸条消线值为6 mg/100 g，并且发现将羊奶与牛奶进行煮沸和酶解处理后对检测结果没有影响，此外该方法无法区分α-酪蛋白和β-酪蛋白。同时通过对纯牛源α-酪蛋白和β-酪蛋白酶解液及及人工合成多肽进行试纸条测定，表明该抗体可以识别酪蛋白的空间结构，对多肽序列的识别能力差，因此，对于羊奶中添加完全水解牛源蛋白的情况需要进一步评估。