Effects of Microwave-assisted L-phenylalanine Treatment on the Flavonoids of Tartary Buckwheat during Germination
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摘要: 以川乔1号苦荞种子为研究对象，研究微波处理协同营养液L-苯丙氨酸（L-Phe）处理富集发芽苦荞黄酮效果。采用单因素和CCD响应面优化的方法，以苦荞芽中黄酮含量为指标，优化微波协同L-Phe处理下苦荞萌发富集黄酮的最佳工艺，并采用高效液相色谱法（HPLC）对苦荞芽中黄酮成分进行分析。结果表明，最优富集工艺为：苦荞种子经消毒、催芽，采用微波功率250 W处理90 s，微波温度为（40±2）℃，然后在温度25 ℃，湿度75%±5% RH条件下避光培养7 d，发芽盘底盘中装入2.90 mmol/L的L-Phe溶液作为营养液，培养第7 d苦荞芽中黄酮含量为6.26 g/100 g。高效液相色谱法对苦荞芽中黄酮成分进行定性和定量分析，分离和确定出绿原酸、牡荆素、芦丁三种黄酮类物质，含量分别为3.2764、0.5644 和31.8962 mg/g。Abstract: In the study, tartary buckwheat sprouts of Chuanqiao 1 cultivar were investigated, and the effects of microwave-assisted L-phenylalanine (L-Phe) treatment on the flavonoids of tartary buckwheat during germination were studied. The content of flavonoids of tartary buckwheat sprouts was used as the standard, the single factor test and CCD response surface design methods were used to optimize the process of flavonoid enrichment by microwave-assisted L-Phe treatment of tartary buckwheat during germination. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to analyze the flavonoid in tartary buckwheat sprouts. The results showed that the tartary buckwheat seeds were disinfected and germinated, then the seeds were treated by microwave with the power of 250 W for 90 s, the microwave temperature was (40±2)℃. Then, the tartary buckwheat seeds were cultured in the dark for 7 days at the condition of the temperature of 25 ℃ and the humidity of 75%±5% RH, and 2.90 mmol/L L-Phe solution was put into the germination tray as a nutrient solution. The result by detection showed the flavonoid content of tartary buckwheat sprouts on the 7th day was 6.26 g/100 g. Simultaneously, three flavonoids, chlorogenic acid, vitexin and rutin, were separated and determined by HPLC, and the content was 3.2764, 0.5644 and 31.8962 mg/g, respectively.
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Keywords:
- tartary buckwheat sprouts /
- flavonoids enrichment /
- microwave /
- L-Phe /
- HPLC
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苦荞（Tartary buckwheat）是一种蓼科荞麦属双子叶植物，富含黄酮、多肽、植物甾醇等生物活性成分[1-2]。苦荞中黄酮类化合物含量丰富[3-5]，这是苦荞区别于其它禾谷类作物的显著特征。苦荞萌发后黄酮类化合物含量显著增加，提高了其芽苗的营养价值和保健作用[6]。黄酮类化合物是苦荞在萌发过程中产生的一类次生代谢产物，其合成途径受光[7]、磁场[8]、激素、盐胁迫等逆境因子调控。
微波属于一种电磁波，能够引发生物体内的生理生化反应[9]，微波非热效应还能够改变细胞膜表面的电荷密度和膜内外电压变化。近年来，国内学者[10-14]开展了大量关于微波处理提高种子活力和生物量积累的研究工作，包括冰草、苜蓿、大豆、黄豌豆和蔬菜等。研究表明，微波处理苦荞能够对其萌发产生一定生物效应，从而促进种子的萌发和萌发过程中黄酮类物质的合成[15]。植物代谢过程中的黄酮类物质是以苯丙烷类物质作为底物，在苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）和黄酮醇合酶（FLS）等多种酶的作用下合成[16]。苯丙氨酸（Phenylalanine, Phe）属于芳香族氨基酸，是苯丙烷代谢的前体物质，对植物的苯丙烷代谢起着重要作用[15]。Seo等[17]研究指出，添加外源5 mmol/L的L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-Phe）能够显著促进苦荞麦芽中酚类单体及总酚类化合物的合成。目前，采用单一微波处理或者L-Phe处理促进种子萌发和富集黄酮研究较多，但微波协同L-Phe处理苦荞种子促进发芽苦荞富集黄酮类化合物等研究鲜见报道。
本课题组前期研究表明[15]，在微波功率400 W条件下处理10 s协同5 mmol/L L-Phe处理下，萌发第7 d苦荞芽中黄酮含量为5.1 g/100 g。为确定微波协同L-Phe处理下苦荞萌发富集黄酮的最佳工艺，本研究进一步考察了微波时间、微波功率、不同浓度L-Phe营养液处理对萌发苦荞芽中黄酮类物质富集的影响，并通过响应面设计法优化微波协同L-Phe处理对苦荞萌发富集黄酮的工艺条件。采用高效液相色谱法对萌发苦荞芽中黄酮成分进行分析，初步明确苦荞芽中部分黄酮成分和含量，以期为微波协同L-Phe促进苦荞萌发富集黄酮的机理研究提供参考，为苦荞芽产品和富含苦荞芽黄酮类化合物功能食品的开发提供技术支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
川荞1号苦荞种子 产自四川凉山，购买当年产、自然阴干的苦荞种子，置于4 ℃冰箱贮存备用；L-Phe 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；绿原酸、牡荆素 色谱纯，中国药品生物药品检定所；芦丁标准品 色谱纯，北京普天同创生物科技有限公司；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇、牛血清白蛋白、3,5-二硝基水杨酸、蔗糖、葡萄糖、苯酚和浓硫酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；高锰酸钾 分析纯，宿州化学试剂厂。
P4543-1风力悬浮控温微波装置 安徽工程大学与芜湖众维教研仪器研发公司共同研发；YRG-300光照种子发芽箱 上海台恒仪器设备有限公司；LGJ-10真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技有限公司；Waters2487高效液相色谱仪 美国Waters公司；L3S可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；JY1002电子天平 上海精密科学仪器有限公司；KS-100DE液晶超声波清洗器 昆山洁力美超声仪器有限公司；TGL-16A医用离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 苦荞种子预处理
苦荞种子预处理参照赵强等[18]方法，并略做调整：选取颗粒饱满、均匀、无霉变的苦荞种子适量，1.0 g/L高锰酸钾溶液消毒，消毒时间5 min，蒸馏水冲洗，然后在室温条件下用蒸馏水浸泡催芽4 h，中间换一次水。催芽后过滤，滤纸吸除苦荞种子表面水分，备用。
1.2.2 苦荞萌发富集黄酮
定量称取催芽后苦荞种子，采用一定微波功率，分别微波处理一定时间，微波温度为（40±2）℃。然后，将种子均匀平铺于发芽盘上，发芽盘底盘装入营养液，营养液为一定浓度的L-Phe溶液，营养液液面刚刚接触发芽盘铺种盘，每24 h更换一次营养液，发芽盘置于种子发芽箱（25 ℃，75%±5% RH）中避光培养7 d，以未经微波处理的苦荞种子组为对照，分别取培养1、3、5、7 d的苦荞芽进行指标测定。
1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 微波时间对萌发苦荞芽中黄酮含量影响
定量称取催芽后苦荞种子，采用微波功率300 W，分别处理25、50、75和100 s，微波温度为（40±2）℃。然后，将种子均匀平铺于发芽盘上，发芽盘底盘装入营养液，营养液为0 mmol/L的L-Phe溶液（蒸馏水），营养液液面刚刚接触发芽盘铺种盘，每24 h更换一次营养液，发芽盘置于种子发芽箱（25 ℃，75%±5% RH）中避光培养7 d，以未经微波处理的苦荞种子组为对照，分别取培养1、3、5、7 d的苦荞芽进行指标测定。
1.2.3.2 微波功率对萌发苦荞芽中黄酮含量影响
定量称取催芽后苦荞种子，分别采用微波功率200、300、400和500 W处理50 s，微波温度为（40±2）℃。然后，将种子均匀平铺于发芽盘上，发芽盘底盘装入营养液，营养液为0 mmol/L的L-Phe溶液（蒸馏水），营养液液面刚刚接触发芽盘铺种盘，每24 h更换一次营养液，发芽盘置于种子发芽箱（25 ℃，75%±5% RH）中避光培养7 d，以未经微波处理的苦荞种子组为对照，分别取培养1、3、5、7 d的苦荞芽进行指标测定。
1.2.3.3 L-Phe浓度对萌发苦荞芽中黄酮含量影响
定量称取催芽后苦荞种子，将种子均匀平铺于发芽盘上（不进行微波处理），发芽盘底盘装入营养液，营养液为0、1、2、3、4、5 mmol/L的L-Phe溶液，营养液液面刚刚接触发芽盘铺种盘，每24 h更换一次营养液，发芽盘置于种子发芽箱（25 ℃，75%±5% RH）中避光培养7 d，分别取培养1、3、5、7 d的苦荞芽进行指标测定。
1.2.4 苦荞萌发富集黄酮响应面试验设计
以苦荞芽中黄酮含量为指标，采用Design expert软件CCD响应面分析法，对微波功率、微波时间、营养液L-Phe浓度3个因素进行响应面设计，研究各因素及各因素交互所用对苦荞芽中黄酮含量的影响，并采用二次多项式回归方程进行模型预测，以优化微波协同L-Phe处理苦荞萌发富集黄酮的最佳工艺条件。试验因素水平表见表1。
表 1 响应面实验因素水平设计Table 1. Factors and levels for response surface experiment水平 因素 A微波时间（s） B微波功率（W） C L-Phe浓度（mmol/L） −1 50 200 2.0 0 75 300 3.0 1 100 400 4.0 1.2.5 苦荞芽中黄酮含量的测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法[19-20]测定苦荞芽中黄酮含量。苦荞芽于−40 ℃温度下真空冷冻干燥48 h，准确称取0.5 g苦荞芽冻干干样，置于研钵中充分粉碎，加入5 mL 60%乙醇溶液，置于350 W超声功率下恒温（50 ℃）提取0.5 h，然后在8000 r/min离心10 min，取上清液；沉淀物加入5 mL 60%乙醇溶液再次提取，连续提取三次，合并提取液，并定容至25 mL，备用。以不加样液为对照，在波长为502 nm处测定吸光度值。以芦丁标准品绘制标准曲线，结果以每克苦荞芽中所含芦丁当量表示（g/100 g）测定样品（干基）中黄酮的含量。
1.2.6 苦荞芽黄酮成分高效液相色谱（HPLC）分析
1.2.6.1 测定波长选择
研究表明，苦荞萌发后黄酮中含量较高的成分有芦丁、绿原酸、牡荆素等[21]，因此本研究用紫外分光光度计对标准品芦丁、绿原酸、牡荆素溶液分别进行全波长紫外扫描。得到各单酚在紫外区的最大吸收波长，进一步确定最佳测定波长。
1.2.6.2 混合标准品溶液配制
分别精确称取标准品10.0 mg绿原酸、3.0 mg牡荆素、5.0 mg芦丁于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得到1.0 mg/mL绿原酸、0.3 mg/mL牡荆素、0.5 mg/mL芦丁的混合标准品溶液，避光冷藏，备用。
1.2.6.3 样品溶液制备
苦荞种子经消毒、催芽，采用微波功率250 W处理90 s，微波温度为（40±2）℃，在温度25 ℃，湿度75%±5% RH条件下避光培养7 d，发芽盘底盘中装入2.90 mmol/L的L-Phe溶液作为营养液。取培养萌发7 d苦荞芽，在−40 ℃温度下真空冷冻干燥48 h，将苦荞芽干样置于研钵中充分粉碎。精确称取2.5 g（精确到0.0001 g）苦荞芽干粉，加入75%乙醇溶液30 mL，80 ℃下回流提取1 h（重复2次），过滤后合并滤液。待旋蒸至干后，残渣加丙酮溶解并定容至5 mL，过0.45 μm微孔滤膜后，待测。空白试验：试验中所使用的试剂按上述方法处理后，进行HPLC分析。
1.2.6.4 色谱条件
色谱柱：Agilent C18（4.6 m×250 mm×5 μm）；检测器：DAD检测器；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；波长：330 nm；流动相A（乙腈溶液）和流动相B（0.4%磷酸溶液）梯度洗脱35 min，梯度程序为：0 min，6%A，94%B；0~30 min，18%A，82%B；30~35 min，6%A，94%B。
1.3 数据统计与分析
实验为3次重复，结果以平均值±标准差的形式表示。用SPSS 22.0软件中的Duncan’s多重比较法进行方差分析，显著水平为P<0.05。采用Sigmaplot 10.0和Origin 2018软件作图。
2. 结果与分析
2.1 苦荞萌发富集黄酮单因素实验结果
2.1.1 微波时间对萌发苦荞芽中黄酮含量的影响
微波时间对萌发苦荞芽中黄酮含量的影响结果如图1。由图1可知，苦荞芽中的黄酮含量随着苦荞培养时间的延长逐渐增加，随着微波时间的延长呈现先增加后减少的趋势。在微波时间50、75 s时，苦荞芽中黄酮含量与对照组比较显著增加（P<0.05），在微波功率300 W下处理75 s，微波温度为（40±2）℃，苦荞萌发第7 d苦荞芽中的黄酮含量最高，与对照组比较提高了3.25%。这是由于微波预处理可以促进谷物的次生代谢过程，从而增加发芽谷物中黄酮等次生代谢产物的含量，Randhir等[22]研究结果显示，蚕豆经微波处理后萌发的蚕豆芽苗中酚类物质的含量增加700%。王顺民等[23]研究表明，微波处理豌豆后豌豆芽黄酮含量较对照组增加了23.3%，达1.48 mg/100 mg。大米[24]和黍米[25]经微波处理后萌发，胚芽米的胚芽油中α-生育酚和植物甾醇含量分别增加约1.5倍和15%，黍米中的可接受性多酚的含量增加显著，与本文结果类似。
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图 1 微波时间对苦荞芽中黄酮含量的影响注：不同小写字母表示在相同萌发天数，不同微波处理时间下，苦荞芽中黄酮含量差异显著（P<0.05）；图2~图3同。Figure 1. Effect of microwave time on total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts2.1.2 微波功率对萌发苦荞芽中黄酮含量的影响
微波功率对萌发苦荞芽中黄酮含量影响结果如图2。由图2可知，苦荞芽中的黄酮含量随着苦荞培养时间的延长逐渐增加，随着微波功率的增加呈现先增加后减少的趋势。在微波功率200、300 W时，苦荞芽中黄酮含量与对照组比较显著增加（P<0.05），在微波功率400 W下处理50 s，微波温度为（40±2）℃，苦荞萌发第7 d苦荞芽中的黄酮含量最高，与对照组比较提高了1.66%。这是由于微波辐射时间过长，微波功率过大都会对种子萌发产生负面影响[26-29]。微波辐射对种子萌发、萌发种芽中次生代谢产物和促进生物量积累的影响取决于种子类型，同时微波频率、微波功率和微波时间等因素也有较大影响，这与张蕊思等[30]微波辐射对冰草种子生理特性影响的研究结果一致。
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图 2 微波功率对苦荞芽中黄酮含量的影响Figure 2. Effect of microwave power on total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts2.1.3 营养液L-Phe浓度对萌发苦荞芽中黄酮含量的影响
营养液L-Phe浓度对萌发苦荞芽中黄酮含量影响结果如图3。由图3可以看出，苦荞芽中的黄酮含量随着苦荞培养时间的延长逐渐增加，而随着营养液L-Phe浓度的增加呈现先增加后减少的趋势。其中，在营养液L-Phe浓度为3.0 mmol/L条件下，苦荞芽中的黄酮含量最高，苦荞萌发第7 d时，苦荞芽中黄酮含量与对照组比较提高了5.5%。同时，在营养液L-Phe浓度为3.0 mmol/L条件下，苦荞萌发第7 d苦荞芽中黄酮含量与苦荞萌发第1 d比较提高了2.19倍。L-Phe是苦荞萌发和生长过程中黄酮类物质合成的前体物质，因此苦荞萌发和L-Phe营养液处理都能促进苦荞黄芽中酮类化合物的合成，这与Seo等[17]研究结果一致。
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图 3 L-Phe浓度对苦荞芽中总黄酮含量的影响Figure 3. Effect of L-Phe concentration on total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts2.2 苦荞萌发富集黄酮的响应面优化
2.2.1 响应面试验结果
以苦荞芽中黄酮含量（g/100 g）为指标进行响应面试验设计，选取微波时间（A）、微波功率（B）和营养液L-Phe浓度（C）为影响因素，进行3因素3水平的响应面分析。试验结果如表2所示。
表 2 响应面试验设计及结果Table 2. Design and results of response surface experiments试验号 因素 R1
黄酮含量（g/100 g）A B C 1 −1 0 −1 5.95 2 1 0 −1 5.69 3 0 1 −1 5.58 4 1 1 0 5.54 5 1 0 1 5.73 6 1 −1 0 6.07 7 0 −1 1 5.79 8 −1 −1 0 6.19 9 0 0 0 6.37 10 0 0 0 6.31 11 0 0 0 6.35 12 0 1 1 5.63 13 0 −1 −1 6.11 14 −1 1 0 5.86 15 0 0 0 6.34 16 0 0 0 6.39 17 −1 0 1 5.76 2.2.2 响应面试验回归模型及方差分析
应用Design-Expert V8.0.6软件，对表2的数据进行处理、分析，预测模型为：R1=6.35−0.091A−0.19B−0.053C−0.050AB+0.058AC+0.093BC−0.22A2−0.22B2−0.35C2。
对试验结果进行拟合的二次模型方差分析，结果见表3。F值为96.38，回归方程模型达到极显著水平（P<0.0001），说明响应面模型极度显著。根据各因素的F值可知，影响苦荞萌发后黄酮含量的因素依次为B>A>C，交互项依次为BC>AC>AB。除AC、AB影响显著（P<0.05）外，其他各项影响均极显著（P<0.01）。多元决定系数为R2=0.9076，失拟P为0.1595（P>0.05），该模型预测值与实际试验值拟合较好。可以利用该回归方程对微波协同L-Phe处理对苦荞萌发富集黄酮结果进行分析，对响应值进行预测。
表 3 响应面试验结果方差分析Table 3. Variance analysis of response surface experiments方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性 模型 1.48 9 0.16 96.38 <0.0001 ** A-微波时间 0.067 1 0.067 39.17 0.0004 ** B-微波功率 0.30 1 0.30 176.58 <0.0001 ** C-L-Phe浓度 0.022 1 0.022 12.97 0.0087 ** AB 0.010 1 0.010 5.88 0.0458 * AC 0.013 1 0.013 7.78 0.0270 * BC 0.034 1 0.034 20.12 0.0028 ** A2 0.20 1 0.20 115.51 <0.0001 ** B2 0.21 1 0.21 120.92 <0.0001 ** C2 0.53 1 0.53 309.37 <0.0001 ** 残差 0.012 7 1.701×10−3 失拟项 8.225×10−3 3 2.742×10−3 2.98 0.1595 纯误差 3.680×10−3 4 9.200×10−4 总残差 1.49 16 R2Adj 0.9817 R2 0.9076 CV 0.69% 2.2.3 响应面分析交互作用
由表3和图4可知，微波功率B与微波时间A对苦荞芽中黄酮含量的交互作用显著（P<0.05）。当微波功率B一定时，苦荞芽中黄酮含量随着微波时间A的增加先增加后降低。在微波时间A为88.19 s，微波功率B为248.07 W时苦荞芽中黄酮含量最高。L-Phe浓度C和微波时间A对苦荞芽中黄酮含量的交互作用显著（P<0.05）。当微波时间A一定时，苦荞芽中黄酮含量随着L-Phe浓度C的增加先增加后降低，在L-Phe浓度为2.90 mmol/L时苦荞芽中黄酮含量最高。L-Phe浓度C和微波功率B对苦荞芽中黄酮含量的的交互作用极显著（P<0.01）。当微波功率B一定时，苦荞芽中黄酮含量随着L-Phe浓度C的升高呈现先增加后降低的趋势。以上分析与方差分析结果一致。
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图 4 因子交互作用对苦荞芽中总黄酮含量的曲面图与等高线图Figure 4. Surface plot and contour plot of total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts of the interaction between factors2.3 验证实验
利用Design-expert 8.0软件在设定的因素水平内对回归方程进行数学规划，得到微波协同L-Phe处理对苦荞萌发富集黄酮各因素最优值为：苦荞种子经消毒、催芽，采用微波功率248.07 W处理88.19 s，微波温度为（40±2）℃，在温度25 ℃，湿度75%±5%RH条件下避光培养7 d，发芽盘底盘中装入2.90 mmol/L的L-Phe溶液作为营养液，培养第7 d萌发的苦荞芽中黄酮含量预测值为6.30 g/100 g。经校正，微波协同L-Phe处理对苦荞萌发富集黄酮条件为：苦荞种子经消毒、催芽，采用微波功率250 W处理90 s，微波温度为（40±2）℃，在温度25 ℃，湿度75%±5% RH条件下避光培养7 d，发芽盘底盘中装入2.90 mmol/L的L-Phe溶液作为营养液，培养第7 d萌发的苦荞芽中测定黄酮含量为6.26 g/100 g。验证实验表明，微波协同L-Phe处理促进苦荞萌发富集黄酮，苦荞芽中黄酮含量预测值与实际测定值接近，经响应面优化所得的微波协同L-Phe处理对苦荞萌发富集黄酮工艺科学可信，具有指导实际生产的应用价值。
2.4 方法学考察结果
2.4.1 线性关系
分别精确吸取混合标准品溶液适量，配制系列质量浓度标准品溶液，注入液相色谱仪并测定。以各成分峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X, μg·mL−1）为横坐标，进行线性回归，其回归方程见表4。
表 4 各种成分的线性关系Table 4. Linerity of various constituents成分 回归方程 R2 绿原酸 y=0.2846x+0.1349 0.9999 牡荆素 y=0.3405x+0.2381 0.9999 芦丁 y=0.2178x+0.2644 1.0000 2.4.2 精密度试验
精确吸取混合标准品溶液适量，注入液相色谱仪并测定，重复进样6次，记录色谱图并计算峰面积的RSD。绿原酸、牡荆素、芦丁峰面积RSD分别为0.32%、0.43%、0.55%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 稳定性试验
取同一批样品（微波功率300 W，处理25 s样品组）溶液，室温下放置，分别于0、4、8、12、24 h时进样测定，测得绿原酸、牡荆素、芦丁峰面积RSD分别为0.63%、0.52%、0.57%，表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定性良好。
2.4.4 重复性试验
取同一批样品（微波功率400 W，处理50 s样品组），制备样品溶液6份，进样测定，记录色谱图，按外标法计算各成分含量及其RSD。结果绿原酸、牡荆素、芦丁平均含量分别为2.8815、0.5146、30.1142 mg·g−1，RSD分别为0.76%、0.63%、0.85%，表明该方法重复性良好。
2.4.5 加样回收试验
称取已知含量样品（微波功率400 W，处理50 s样品组）9份，分成3组，精密称定，分别加入混合标准溶液1.0、2.0、3.0 mL，进样测定，记录色谱图，计算绿原酸、牡荆素、芦丁加样回收率在98.87%～102.31%范围内，RSD在0.38%～0.81%范围内。
2.5 苦荞芽样品黄酮含量测定结果
紫外扫描结果显示，绿原酸、牡荆素、芦丁标准品的最大吸收波长在330 nm左右，故将330 nm作为样品紫外检测波长。混合标准品溶液和样品溶液稀释后进行HPLC分析，结果如图5，同时记录色谱图，按外标法计算绿原酸、牡荆素、芦丁含量，结果如表5。
表 5 样品含量测定结果Table 5. Content determination results of samples成分 含量（mg/g） 绿原酸 3.2764 牡荆素 0.5644 芦丁 31.8962 由图5a可知，混合标准品中绿原酸保留时间是12.765 min；牡荆素保留时间是28.157 min；芦丁保留时间是28.898 min。比较图5a混合标准品色谱图和图5b样品色谱图的相对保留值，样品中对应的绿原酸、牡荆素和芦丁保留时间分别为：12.823、28.188、28.875 min。样品中芦丁含量最高，其次为绿原酸、牡荆素，由表5可知，其含量分别为31.8962、3.2764和0.5644 mg/g。此外，样品中还含有多种其它成分，保留时间分别为：1.481、1.905、8.889、15.238、18.307、23.915、27.513、33.709 min，需要进一步的研究。
3. 结论
微波处理和营养液L-Phe溶液处理都具有提高苦荞芽中黄酮含量的作用，微波处理及营养液L-Phe溶液处理在一定范围内对苦荞萌发富集黄酮类物质有协同促进作用。采用CCD响应面优化的方法，以苦荞芽中黄酮含量为指标，优化得到微波协同L-Phe处理对苦荞萌发富集黄酮的最佳工艺为：苦荞种子经消毒、催芽，采用微波功率250 W处理90 s，微波温度为（40±2）℃，在温度25 ℃，湿度75%±5% RH条件下避光培养7 d，发芽盘底盘中装入2.90 mmol/L的L-Phe溶液作为营养液，培养第7 d萌发的苦荞芽中测定黄酮含量达到了6.26 g/100 g。
采用高效液相色谱法（HPLC）对苦荞芽中黄酮成分进行分析，分离和确定出绿原酸、牡荆素、芦丁三种黄酮类物质和含量，另外有8种成分需要进一步分析和确定。本研究为微波协同L-Phe促进苦荞萌发富集黄酮的机理研究提供了参考，为苦荞芽产品和富含苦荞芽黄酮类化合物功能食品的开发提供了技术支持。
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图 1 微波时间对苦荞芽中黄酮含量的影响
注：不同小写字母表示在相同萌发天数，不同微波处理时间下，苦荞芽中黄酮含量差异显著（P<0.05）；图2~图3同。
Figure 1. Effect of microwave time on total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts
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图 2 微波功率对苦荞芽中黄酮含量的影响
Figure 2. Effect of microwave power on total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts
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图 3 L-Phe浓度对苦荞芽中总黄酮含量的影响
Figure 3. Effect of L-Phe concentration on total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts
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图 4 因子交互作用对苦荞芽中总黄酮含量的曲面图与等高线图
Figure 4. Surface plot and contour plot of total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts of the interaction between factors
表 1 响应面实验因素水平设计
Table 1 Factors and levels for response surface experiment
水平 因素 A微波时间（s） B微波功率（W） C L-Phe浓度（mmol/L） −1 50 200 2.0 0 75 300 3.0 1 100 400 4.0 
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表 2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiments
试验号 因素 R1
黄酮含量（g/100 g）A B C 1 −1 0 −1 5.95 2 1 0 −1 5.69 3 0 1 −1 5.58 4 1 1 0 5.54 5 1 0 1 5.73 6 1 −1 0 6.07 7 0 −1 1 5.79 8 −1 −1 0 6.19 9 0 0 0 6.37 10 0 0 0 6.31 11 0 0 0 6.35 12 0 1 1 5.63 13 0 −1 −1 6.11 14 −1 1 0 5.86 15 0 0 0 6.34 16 0 0 0 6.39 17 −1 0 1 5.76
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表 3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface experiments
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性 模型 1.48 9 0.16 96.38 <0.0001 ** A-微波时间 0.067 1 0.067 39.17 0.0004 ** B-微波功率 0.30 1 0.30 176.58 <0.0001 ** C-L-Phe浓度 0.022 1 0.022 12.97 0.0087 ** AB 0.010 1 0.010 5.88 0.0458 * AC 0.013 1 0.013 7.78 0.0270 * BC 0.034 1 0.034 20.12 0.0028 ** A2 0.20 1 0.20 115.51 <0.0001 ** B2 0.21 1 0.21 120.92 <0.0001 ** C2 0.53 1 0.53 309.37 <0.0001 ** 残差 0.012 7 1.701×10−3 失拟项 8.225×10−3 3 2.742×10−3 2.98 0.1595 纯误差 3.680×10−3 4 9.200×10−4 总残差 1.49 16 R2Adj 0.9817 R2 0.9076 CV 0.69%
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表 4 各种成分的线性关系
Table 4 Linerity of various constituents
成分 回归方程 R2 绿原酸 y=0.2846x+0.1349 0.9999 牡荆素 y=0.3405x+0.2381 0.9999 芦丁 y=0.2178x+0.2644 1.0000
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表 5 样品含量测定结果
Table 5 Content determination results of samples
成分 含量（mg/g） 绿原酸 3.2764 牡荆素 0.5644 芦丁 31.8962
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