Screening of Lactic Acid Bacteria from Jiuqu and Its Application in the Fermentation of Chestnut Glutinous Rice Beverage
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摘要: 为筛选出适合植物基质发酵的优良乳酸菌。本文以米曲为目标乳酸菌的供体，筛选高产酸、耐胃肠环境能力良好的乳酸菌，并评估了乳酸菌的抗氧化活性及其在板栗糯米饮料中的发酵能力。从酒曲中共分离出84株乳酸菌，其中有38株的产酸量≥10 g/L；在进一步的耐酸耐胆盐、模拟胃肠实验中，共筛出3株乳酸菌株；经16S rDNA鉴定这3株乳酸菌均为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。菌株DH16发酵上清液的DPPH自由基、羟自由基清除率和SOD酶活力最高，分别为98.56%、42.27%和20.3 U/mL；完整细胞悬液中，菌株DH20的DPPH自由基清除率最高（22.49%），菌株DH16的羟自由基清除率最高（22.77%）。利用3株乳酸菌作为发酵剂所得的板栗糯米饮料口感均衡、抗氧化能力较强，因此本文筛出的3株乳酸菌在植物基饮料开发方面具有良好的应用前景。Abstract: In order to screen the excellent lactic acid bacteria suitable for plant substrate fermentation. In this paper, rice koji was used as the donor of target lactic acid bacteria, to screen lactic acid bacteria with high acid yield and good tolerance to gastrointestinal environment. And the antioxidant activity of lactic acid bacteria and its fermentation ability in chestnut glutinous rice beverage were evalutated. The results showed that 84 strains of lactic acid bacteria were isolated from Jiuqu, of which 38 strains produced acid≥10 g/L. In further acid-tolerant, bile salt-tolerant and simulated gastrointestinal tests, three target strains were screened. All the three strains of lactic acid bacteria were identified as Pediococcus pentosaceus though 16S rDNA. In the fermentation supernatant, the DPPH radical scavenging rate, hydroxyl radical scavenging rate and SOD enzyme activity of strain DH16 were the highest, which were 98.56%, 42.27% and 20.3 U/mL respectively. In the intact cell suspension, the DPPH radical scavenging rate of strain DH20 was the highest (22.49%), and the hydroxyl radical scavenging rate of strain DH16 was the highest (22.77%). The chestnut glutinous rice beverage separately fermented by three strains of lactic acid bacteria has a balanced taste and strong antioxidant capacity. Therefore, the three strains of lactic acid bacteria screened in this paper have a good application prospect in the development of plant-based beverages.
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Keywords:
- rice wine koji /
- lactic acid bacteria /
- chestnut /
- glutinous rice /
- beverage /
- simulated gastrointestinal /
- antioxidant capacity
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板栗原产于我国，是我国食用最早的坚果之一。近年来，板栗的栽培面积和总产量迅速扩大，2018年我国板栗栽培面积已达34.1万公顷，产量达196.5万吨，与2008年相比收获面积增长了31.15%，产量增长了35.52%[1]。板栗产业已经成为我国贫困山区的主要支柱产业，但是随着板栗产量的逐年增加，板栗深加工能力弱、工业转化率低等问题已成为制约板栗产业健康发展的瓶颈。因此急需开发附加值高、货架期长、营养丰富、符合大众健康要求的产品。
乳酸菌是一类可以利用碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的总称，具有突出的益生特性和发酵活性，广泛应用于发酵食品的生产中[2]。研究表明，经过乳酸菌发酵而成的食品具有一定的益生功效，包括调节免疫系统[3]、降胆固醇含量[4]、调节肠道菌群、抑制肠道致病菌[5]、改善便秘[6]等，除此之外还具有抗衰老、抗氧化活性及降低肿瘤的风险[7-9]。随着消费多样化需求的日益增加，除了酸奶等传统乳酸菌产品外，新兴的乳酸菌发酵产品，如发酵的谷物、水果和蔬菜汁[10]等正逐渐被消费者接受。然而，现有乳酸菌存在非乳基质中生长繁殖状态不佳及需要驯化的问题[11]，因此筛选适合植物基质发酵的乳酸菌是开发新型乳酸菌食品的关键问题之一。
米酒曲是以粮食、麸皮等为原料，通过自然网络微生物或者人工接种而获得的发酵剂，也是乳酸菌的主要供体。在酿造过程中，乳酸菌代谢产生的酸类、酯类物质可以影响酒的风味品质以及出酒率[12]。王丹丹等[13]对凤窝酒曲中乳酸菌菌群进行鉴定，确定凤窝酒曲中包含乳杆菌属（Lactobacillus）和魏斯氏菌（Weissella）两个属的乳酸菌。向凡舒等[14]从建始米酒曲中分离出10株乳酸菌，经鉴定4株为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、1株为乳酸片球菌（P. acidilactici）、2株为短乳杆菌（L. brevis）、3株为屎肠球菌（Enterococcus faecium）。乳酸菌发酵过程中分泌的有机酸既能起到防腐作用，又可以改善原料的口感和风味[15]，从而提高产品的附加值，因此产酸能力是评价乳酸菌优良与否的指标之一[16-17]。耐受胃肠液是益生菌的重要特性之一[18]，因为人体胃肠的极端环境对乳酸菌的活性有很大影响，只有能够耐受低pH、胆盐和各种消化酶的菌株，才能在人体内存活，发挥其益生作用。
因此，本文以传统米酒曲为乳酸菌供体，筛选出能够在模拟胃肠环境中存活的、可以发酵植物基质的乳酸菌，并用筛选到的菌株为发酵菌株开发一款具有板栗风味的新型乳酸菌饮料，最后分析其品质及体外抗氧化能力，为板栗新型产品的开发提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
安琪甜酒曲 安琪酵母股份有限公司；米曲样品 来自四川内江、湖北秭归县、古塘客家三种自制米曲；燕龙板栗 河北迁安；糯米 吉林龙嘉米业有限公司；牛胆盐、胃蛋白酶（3000 U/g）、胰蛋白酶（250 U/g） 上海源叶生物科技有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基，纯度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；邻菲啰啉、硫酸亚铁、30%过氧化氢 分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；氢氧化钠 分析纯，天津欧博凯化工有限公司；MRS培养基 国药集团化学试剂有限公司；MRS-CaCO3培养基 在MRS培养基中补加1% CaCO3。
L530台式低速离心机 湖南湘仪仪器设备有限公司；UV 2600A紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；SPX-250B-8生化培养箱 上海博迅实业有限公司；HOMOLAB均质机 意大利FBF公司。
1.2 实验方法
1.2.1 乳酸菌菌株的初步筛选
分别取三种酒曲各1 g于200 mL MRS液体培养基中，37 ℃富集培养，梯度稀释后采用倾注法倒平板，放入37 ℃培养箱培养48 h。挑选溶钙圈较大的菌落进行平板划线纯化，37 ℃培养48 h，反复多次纯化，直至平板上菌落形态一致，然后进行革兰氏染色、镜检，初步判定革兰氏阳性菌为乳酸菌[19]。
将上述菌株接种到MRS培养基中，37 ℃培养24 h，得到种子液。将种子液以3%的接种量接入MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h后，取5 mL发酵液稀释10倍后，滴加酚酞溶液，用0.1 mol/L标定后的氢氧化钠溶液[20]滴定至粉红色且30 s后不褪色，以未接种乳酸菌的培养基做空白对照，记录消耗氢氧化钠溶液体积，每株菌做3次检测，结果取平均值[21]。其计算公式如下：
X=(V1−V2)×c×N×0.09V×1000 (1) 式中：X为样品产酸量，g/L；V1为消耗氢氧化钠溶液体积，mL；V2为空白培养基消耗氢氧化钠溶液体积，mL；c为标定的氢氧化钠溶液浓度，mol/L；V为发酵液体积，mL；N为稀释倍数；0.09，乳酸的换算系数；1000，换算系数。
将产酸高的菌株纯化后，置于20%的甘油中−80 ℃保藏。
1.2.2 乳酸菌菌株的复筛
1.2.2.1 耐酸能力分析
以2%（V/V）的接种量将筛选的乳酸菌分别接种于pH为3.0的MRS液体培养基中，37 ℃培养3 h，分别于0、3 h取样，采用平板计数法计算活菌数[22-23]。乳酸菌的耐酸能力用公式（2）计算：
乳酸菌的耐酸能力(%)=lgN3lgN0×100 (2) 式中：N3为培养3 h的活菌数，CFU/mL；N0为0 h的活菌数，CFU/mL。
1.2.2.2 耐胆盐能力分析
以2%（V/V）的接种量将筛选的乳酸菌分别接种于含0.3 g/100 mL牛胆盐的MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，采用平板计数法计算0 h和24 h的活菌数[22-23]。乳酸菌的胆盐耐受能力用公式（3）计算：
乳酸菌的耐胆盐能力(%)=lgN24lgN0×100 (3) 式中：N24为胆盐处理24 h的活菌数，CFU/mL；N0为胆盐处理0 h的活菌数，CFU/mL。
1.2.2.3 模拟胃肠液耐受性分析
模拟胃液：0.35 g胃蛋白酶溶于100 mL 0.2%的无菌生理盐水，用盐酸调节pH3.0过滤除菌；模拟肠液：胰蛋白酶0.1 g、胆盐1.8 g溶于含有1.1 g NaHCO3、0.2 g NaCl的100 mL蒸馏水中，用NaOH调整pH8.0后过滤除菌[24]。
取10 mL种子液用无菌水离心洗涤3次后，用10 mL无菌水重悬，制成菌悬液。分别吸取1 mL待测菌株的菌悬液接入9 mL无菌人工模拟胃液中，共接2支，混匀，37 ℃培养3 h，其中，1支试管用于0 h和3 h的平板活菌计数，计算其耐受胃液能力。另1支试管模拟胃液处理3 h后在无菌条件下离心，并用无菌水离心洗涤2次后，用1 mL无菌水重悬，然后将其加入到9 mL无菌人工模拟肠液中，37 ℃处理8 h，每隔2 h取样平板计数[24]。乳酸菌对人工模拟胃肠环境的耐受能力用公式（4）计算：
胃肠环境耐受能力(%)=lgN11lgN0×100 (4) 式中：N11为经过模拟胃、肠液处理11 h后的活菌数，CFU/mL；N0为未处理前的活菌数，CFU/mL。
1.2.2.4 乳酸菌耐受H2O2能力分析
将H2O2通过0.45 μm滤膜除菌后按比例加入至无菌的MRS液体培养基中，配制成含有0.4、0.7、1.0 mmol/L H2O2浓度的培养基，以2%（V/V）的接种量将乳酸菌菌悬液分别接种于含0.4、0.7、1.0 mmol/L H2O2的MRS液体培养基中，37 ℃培养16 h后，采用平板菌落计数法计算菌落数，以未加H2O2的培养基做对照试验[25]。
1.2.3 菌株的抗氧化能力
1.2.3.1 完整细胞悬液和发酵上清液的制备
将菌株接入MRS液体培养基中，37 ℃培养12 h后，在5000 r/min条件下离心15 min，收集上清液即为菌株的发酵上清液。菌体用PBS缓冲溶液（pH7.4）离心洗涤三次后将菌体重悬于同体积的PBS缓冲溶液中得到完整细胞悬液。
1.2.3.2 清除DPPH自由基能力
取2 mL待测液（菌悬液或上清液），加入2 mL 0.01%的DPPH乙醇溶液，室温下静置30 min后在517 nm波长处测吸光度[26]。DPPH自由基清除率用公式（5）表示：
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (5) 式中：A1为2 mL样品+2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A2为2 mL无水乙醇+2 mL样品的吸光度；A0为2 mL蒸馏水+2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度。
1.2.3.3 清除羟自由基能力
取1 mL待测液（同1.2.3.2）于试管中，分别加入0.75 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液、2.5 mL磷酸缓冲溶液（pH7.4）、0.5 mL 0.1% H2O2、0.75 mL 7.5 mmol/L 邻菲罗啉于37 ℃保温1 h后在536 nm处测定吸光度[26]，羟自由基清除率用公式（6）表示：
羟自由基清除率 (%)=（Ai−A）(A0−A)×100 (6) 式中：Ai为样品组吸光度；A0为无样品无H2O2组吸光度；A为无样品组吸光度。
1.2.3.4 SOD酶活力测定实验
参照国标GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》中邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力[27]。
1.2.4 菌株的分子生物学鉴定
将筛选得到的菌株送往华大基因进行菌株的16S rDNA序列测序。然后登陆GenBank中的BLAST程序比对测序菌株，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA5软件中的邻接算法构建系统发育树。
1.2.5 板栗糯米乳酸菌发酵饮料的制备及指标测定
1.2.5.1 工艺流程
1.2.5.2 操作要点
a.乳酸菌发酵剂的制备：将菌株接入MRS液体培养基中，37 ℃培养12 h后，在5000 r/min条件下离心15 min弃上清液，菌体用无菌水同等条件下离心洗涤两次后，用无菌水调节菌落数至约108 CFU/mL。
b.板栗发酵：板栗去壳后洗净、破碎成块，蒸30 min冷却后按0.4%（质量比）添加安琪甜酒曲，按0.3%（质量比）的添加量添加乳酸菌，30 ℃发酵24 h后，按料液比1:4（g/mL）加水破壁机打浆1 min。
c.糯米发酵：取糯米50 g，淘洗3次后，加200 mL水浸泡12 h，沥干水分后蒸30 min，冷却，按0.4%（质量比）添加安琪甜酒曲，按0.3%（质量比）添加乳酸菌，30 ℃发酵48 h后，按料液比1:4加水搅拌均匀后纱布过滤得发酵糯米汁。
d.混合：将板栗汁与糯米汁按体积比为1:4混合。
e.均质：纱布过滤除去大颗粒后，添加0.1%黄原胶，使用均质机在60 ℃、35 MPa条件下均质两次。
f.灭菌：罐装后放入85 ℃水浴锅中15 min。
1.2.5.3 感官评价
邀请10位有感官评价经验的专业人员（男:女=1:1），根据表1对板栗糯米饮料的颜色、组织状态、口感、风味四个指标进行评分，记录数据取平均值。
表 1 板栗糯米乳酸饮料感官评分标准Table 1. Sensory rating of chestnut glutinous rice lactic acid beverage指标 评分标准 颜色（25分） 淡乳黄色，颜色均匀（21~25分） 色泽较深，颜色大致均匀（11~20分） 色泽暗沉，严重不均匀（1~10分） 组织状态（25分） 均匀稳定，无其他杂质（21~25分） 有少量沉淀和分层，略有杂质（11~20分） 严重沉淀和分层，杂质较多（1~10分） 口感（25分） 口感细腻，酸甜适中（21~25分） 口感略粗糙，酸度较低（11~20分） 口感粗糙，糖酸比不协调（1~10分） 风味（25分） 有板栗香味，无异味（21~25分） 板栗香味较淡，无异味（11~20分） 无板栗香味，有异味（1~10分） 1.2.5.4 酸度测定
参照国标GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》滴定酸度[28]。
1.2.5.5 抗氧化能力测定
板栗糯米饮料离心后取上清液，参照1.2.3.3中方法测定羟基自由基清除率，参照1.2.3.4中方法测定SOD酶活力；将上清液稀释10倍，参照1.2.3.2中方法测定DPPH自由基清除率。
1.3 数据处理
采用Excel 2016和SPSS 23.0软件进行统计学分析，数据间的分析采用单因素方差分析和Duncan多重比较法，显著性水平设定为0.05；绘图采用Origin 2018。
2. 结果与分析
2.1 酒曲中高产酸乳酸菌的初筛
产酸能力是乳酸菌的重要益生特性，乳酸可以降低pH、抑制或杀死病原菌、提高胃肠道消化酶活性[29]。从四川内江甜酒曲、湖北秭归县黄酒曲、古塘客家甜酒饼中共分离出84株具有溶钙圈、革兰氏染色呈阳性的菌株，初步判定为乳酸菌。以在MRS-CaCO3固体培养基上形成的透明溶钙圈的大小来初步判定其产酸能力，测定了其中38株溶钙圈大的菌株产酸能力，具体产酸量见表2，这38株菌的产酸量均大于10 g/L，最大值为18.14 g/L，最小值为10.07 g/L。
表 2 38株乳酸菌的产酸能力Table 2. Acid production capacity of 38 lactic acid bacteria菌株编号 产酸量（g/L） 菌株编号 产酸量（g/L） 菌株编号 产酸量（g/L） DS2 13.29±0.43kl DH31 14.64±0.54fgh DG29 11.21±0.54pq DS3 15.57±0.45cde DH33 16.00±0.33cd DG30 11.14±0.37pqr DS4 13.50±0.43kl DH34 14.57±0.43fgh DG31 18.14±0.12a DS5 16.21±0.33bc DH35 15.00±0.57efg DG32 13.57±0.33jkl DH16 13.00±0.33lm DH36 14.43±0.54ghi DG33 10.43±0.25rs DH20 15.00±0.43efg DH37 16.86±0.25b DG34 13.29±0.43kl DH23 13.71±0.21ijkl DH38 15.29±0.49def DG35 14.36±0.43ghij DH24 13.43±0.65kl DG18 14.36±0.57ghij DG36 16.14±0.33bc DH25 12.50±0.33mn DG24 10.07±0.64s DG37 13.36±0.45kl DH26 13.93±0.43hijk DG25 13.43±0.54kl DG38 13.14±0.33klm DH27 12.00±0.37no DG26 10.64±0.12qrs DG39 13.57±0.12jkl DH28 11.86±0.33nop DG27 11.21±0.54pq DG40 13.71±0.57ijkl DH29 11.36±0.43opq DG28 10.71±0.21qrs 注：表中数据形式为平均数±标准偏差（n=3）；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；表3同。 2.2 具有较强耐受能力乳酸菌的筛选
2.2.1 耐酸乳酸菌的筛选
乳酸菌经由胃后进入小肠，而胃液pH通常在3.0左右，因此乳酸菌在低pH下的存活能力即耐酸能力是评价其益生性的重要指标之一[30]。根据食物在胃部的停留时间，本文将初筛的38株乳酸菌在pH3.0的液体MRS培养基中培养3 h，筛选耐酸能力强的乳酸菌进行后续实验。王帅等[31]的研究表明菌株耐受能力超过60%时，具有较好的耐受胃肠环境能力，因此本文以耐受能力60%为指标，筛选出25株菌的耐酸能力≥60%，进行下一步实验，其中，耐酸能力达到90%以上的共有6株（详见表3）。
表 3 38株乳酸菌的耐酸能力Table 3. Acid tolerance of 38 strains of lactic acid bacteria菌株编号 乳酸菌活菌数（lg CFU/mL） 乳酸菌耐酸能力（%） 菌株编号 乳酸菌活菌数（lg CFU/mL） 乳酸菌耐酸能力（%） 0 h 3 h 0 h 3 h DS2 7.43±0.09 6.91±0.06 93.12±1.59bc DH38 7.77±0.02 4.01±0.04 51.60±0.61op DS3 7.62±0.11 6.79±0.04 89.14±1.37d DG18 7.03±0.01 4.64±0.12 65.96±1.65kl DS4 7.53±0.11 6.43±0.05 85.46±0.72e DG24 6.74±0.07 5.11±0.19 75.86±3.37hi DS5 6.87±0.03 5.63±0.06 81.93±1.20f DG25 6.02±0.04 5.48±0.18 91.09±3.19cd DH16 7.81±0.07 5.89±0.09 75.37±1.43hi DG26 6.75±0.14 5.60±0.19 83.03±1.12ef DH20 8.42±0.04 6.18±0.05 73.36±0.79ij DG27 7.15±0.17 3.90±0.08 54.55±0.60no DH23 7.86±0.05 4.10±0.11 52.15±1.52op DG28 5.17±0.07 4.94±0.11 95.56±1.06ab DH24 8.43±0.02 6.09±0.04 72.28±0.68j DG29 5.62±0.09 4.43±0.16 78.68±1.72g DH25 8.41±0.15 6.15±0.20 73.19±1.02ij DG30 7.23±0.04 4.19±0.14 57.99±1.69m DH26 7.72±0.03 4.18±0.14 54.21±2.02nop DG31 5.85±0.06 4.50±0.11 76.81±1.11gh DH27 7.37±0.08 6.32±0.13 85.66±2.21e DG32 6.92±0.04 6.74±0.07 97.45±0.49a DH28 8.36±0.04 5.72±0.10 68.34±1.54k DG33 8.14±0.09 4.21±0.13 51.77±2.14op DH29 7.72±0.05 5.73±0.05 74.22±1.18hij DG34 7.31±0.03 4.13±0.09 56.47±1.12mn DH31 7.08±0.17 6.08±0.11 85.80±0.78e DG35 7.43±0.02 4.23±0.07 56.89±0.89mn DH33 6.82±0.04 6.92±0.07 96.72±0.96a DG36 7.41±0.15 4.18±0.18 56.43±2.25mn DH34 7.39±0.04 4.02±0.05 54.46±0.44nop DG37 7.37±0.08 4.26±0.11 57.80±1.42m DH35 6.88±0.12 5.75±0.24 83.55±2.07ef DG38 7.07±0.06 6.60±0.14 93.26±1.21bc DH36 7.97±0.04 4.10±0.12 51.48±1.70p DG39 6.50±0.16 5.39±0.19 82.93±0.91ef DH37 6.48±0.07 4.20±0.19 64.82±3.44l DG40 7.36±0.04 4.16±0.15 56.43±1.95mn 2.2.2 耐胆盐菌株的筛选
小肠是乳酸菌发挥益生作用的重要部位，正常人体小肠中胆汁盐含量在0.03%~0.3%范围内波动，胆盐可以改变菌体外膜的通透性并对菌体的脱氧核糖核酸产生伤害，进而影响乳酸菌在人体肠道的定植[30]，因此，耐胆盐能力是评价乳酸菌能否在人体胃肠道发挥益生作用的重要指标。以25株耐酸能力强的乳酸菌为出发菌株，按照方法1.2.2.2测定其耐胆盐能力，结果见图1。结果显示，共有10株乳酸菌对0.3%浓度的胆盐耐受能力≥60%，其中最高的是菌株DH24，其耐受能力为（96.48%±0.46%），因此，以这10株乳酸菌进行后续的筛选。
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图 1 25株乳酸菌耐胆盐能力分析注：不同字母表示差异显著（P<0.05）；图4同。Figure 1. Ability of tolerance bile salt of 25 strains lactic acid bacteria2.2.3 耐模拟胃肠道环境菌株的筛选
尽管前面已经通过酸度以及胆盐含量来模拟了人体的胃肠环境，但真正的人体胃肠中还含有胃蛋白酶和胰蛋白酶，这些酶可以水解微生物的菌体蛋白质，抑制甚至杀死微生物[32]，因此，对耐酸耐胆盐的10株乳酸菌的耐模拟胃肠环境能力进行了分析，结果如图2所示。经过3 h的模拟胃液处理，10株乳酸菌的活菌数均明显降低，这说明胃液环境对微生物有明显的抑制甚至杀灭作用。经模拟胃液消化后DH16和DH24活菌数下降了1~2 lg CFU/mL，菌株DH20和DH35活菌数下降了2~3 lg CFU/mL，其余乳酸菌活菌数减少量超过3 lg CFU/mL。经模拟肠液消化后，乳酸菌的活菌数持续减少，其中，在模拟肠道环境中存活能力最好的是菌株DG39，活菌数仅减少了0.32 lg CFU/mL。经处理11 h后的结果表明菌株DH24的活菌数最高为6.02 lg CFU/mL，DH16和DH20的活菌数略低于菌株DH24，分别为5.98、5.54 lg CFU/mL，其余菌株活菌数均小于5 lg CFU/mL。菌株DH16、DH20和DH24三株乳酸菌对模拟胃肠环境有较好的耐受性，耐受能力≥60%，进入下一步实验。
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图 2 10株乳酸菌耐受人工模拟胃肠液能力分析注：0~3 h为模拟胃液处理，3~11 h为模拟肠道环境。Figure 2. Tolerance ability of 10 strains lactic acid bacteria in artificial simulated gastric and intestinal fluid2.2.4 菌株耐受H2O2能力
氧化剂可以激发机体氧化防御系统产生各种酶，当微生物受到低浓度H2O2处理时，细胞会产生适应能力，来保护自身免受更高浓度氧化剂的危害，因此 H2O2耐受力可作为衡量菌体抗氧化活性的一个指标[33]。本研究将三株乳酸菌接种于含有不同浓度H2O2的MRS培养基中，37 ℃培养16 h后的活菌数见表4。由表4可知三株菌在含有0.4、0.7、1.0 mmol/L浓度的H2O2培养基中的活菌数与空白对照组无显著差异（P>0.05），这表明这三株乳酸菌均具有氧化防御系统，对H2O2有一定的耐受力。
表 4 乳酸菌对过氧化氢的耐受能力Table 4. Resistance of lactic acid bacteria to hydrogen peroxide菌株编号 乳酸菌活菌数（lg CFU/mL） 空白对照组 0.4 mmol/L 0.7 mmol/L 1.0 mmol/L DH16 8.52±0.26a 8.31±0.10a 8.52±0.18a 8.23±0.22a DH20 8.49±0.14ab 8.58±0.31ab 8.71±0.16a 8.29±0.10b DH24 8.45±0.14a 8.24±0.06a 8.41±0.10a 8.47±0.23a 注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 2.3 菌株体外抗氧化能力分析
当机体代谢过程中产生的自由基含量过高时，生物大分子与其结合会造成机体损伤，引发多种疾病[34]。因此探究了这三株乳酸菌的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力以及SOD酶活力。由表5可知，同一株乳酸菌的上清液和细胞悬液对DPPH自由基的清除能力不同，发酵上清液要优于完整细胞悬液，三株乳酸菌的发酵上清液均表现出较强的DPPH自由基清除能力，发酵上清液中以菌株DH16的清除率最高为（98.56%±0.74%），完整细胞悬液中以菌株DH20对DPPH自由基的清除能力最高为（22.49%±0.71%）。林祥娜等[33]研究的8株乳酸菌发酵上清液和完整细胞悬液的DPPH自由基清除能力也发现上清液的DPPH自由基清除力要高于细胞悬液。菌株DH16发酵上清液和完整细胞悬液对羟自由基的清除能力均高于另外两株，且菌株DH24和DH20发酵上清液、菌体的羟自由基清除能力差异不显著（P>0.05）。同样可以发现发酵上清液的羟自由基清除能力高于完整细胞悬液，这可能是因为菌株发酵上清液的SOD酶活力高于完整细胞悬液[35]，也可能因为乳酸菌代谢产物中存在更多的清除自由基活性物质，比如硫氧还蛋白、谷胱甘肽等还原性物质[36]。此外，这3株乳酸菌发酵上清液的SOD酶活力差异显著，菌株DH16的发酵上清液SOD酶活力高于另外两株（P<0.05）。
表 5 3株乳酸菌的抗氧化能力Table 5. Antioxidant capacity of three strains lactic acid bacteria菌株编号 样品 DPPH自由基清除率（%） 羟自由基清除率（%） SOD酶活力（U/mL） DH16 完整细胞悬液 20.58±0.69d 22.77±0.45c − 发酵上清液 98.56±0.74a 42.27±1.65a 20.3±0.10a DH20 完整细胞悬液 22.49±0.71c 16.84±0.53d − 发酵上清液 96.11±0.67b 36.61±1.17b 18.57±0.06b DH24 完整细胞悬液 14.32±1.01e 16.51±1.04d − 发酵上清液 97.25±0.16b 36.26±0.22b 11.9±0.20c 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；表6同。 2.4 菌株鉴定
对这3株乳酸菌的16S rDNA基因序列进行分析、比对，利用MEGA5软件构建系统发育树如图3所示。由图3可知菌株DH16、DH20、DH24与戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）聚于一支，亲缘关系最近，因此将这三株菌鉴定为戊糖片球菌（P. pentosaceus）。有研究表明戊糖片球菌（P. pento-saceus）可抑制食源性致病菌、调节肠道免疫功能、降低胆固醇、抗氧化、抗肿瘤等，用于发酵食品工业化生产中，可以提高产品的品质、安全性及生产效率[2, 37]。
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图 3 基于16S rDNA基因序列的片球菌属系统进化树Figure 3. Evolutionary tree of Pediococcus based on 16S rDNA gene sequence2.5 板栗糯米乳酸菌饮料的品质评价
2.5.1 感官评分
感官评分是食品品质测评的重要方法，综合四项指标得分发现3株乳酸菌发酵的板栗糯米乳酸饮料酸甜可口、组织状态均匀一致，板栗风味浓郁，感官评分较高，其中以DH20菌株发酵的饮料评分最高。
表 6 不同乳酸菌发酵饮料的感官得分Table 6. Sensory scores of beverages fermented by different lactic acid bacteria菌株 得分（分） 合计（分） 颜色 组织状态 口感 风味 DH16 21.0±0.94 17.2±1.03 19.9±1.66 21.0±0.67 79.1±1.20b DH20 21.7±0.95 17.4±1.35 21.2±1.93 21.9±1.20 82.2±2.90a DH24 20.1±1.19 17.0±1.25 21.6±1.07 21.5±1.27 80.2±1.99ab 2.5.2 酸度
乳酸菌发酵过程中产生的酸可以起到改善产品风味口感的作用，因此产品的酸度是评判产品品质的重要指标，也可作为评判菌株发酵能力的指标之一，由图4可知，不同乳酸菌发酵得到的板栗糯米饮料酸度有所差异，酸度由高到低分别是菌株DH20>DH24>DH16，说明菌株DH20在板栗糯米饮料中发酵能力最强。
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图 4 不同乳酸菌发酵饮料的酸度Figure 4. Acidity of fermented beverages by different lactic acid bacteria2.5.3 体外抗氧化活性
对三株乳酸菌发酵的板栗糯米饮料的羟自由基、DPPH自由基清除率、SOD酶活力进行测定，结果见图5。由图5可以看出乳酸菌发酵的板栗糯米饮料有一定的抗氧化能力，DH16发酵饮料的DPPH自由基、羟自由基清除率显著高于另外两株（P<0.05）。3株乳酸菌发酵的板栗糯米饮料的SOD酶活力大小依次为菌株DH16>DH20>DH24，其中，DH16和DH20发酵饮料的SOD酶活力差异不显著（P>0.05）。本研究中乳酸菌发酵的板栗糯米饮料，口感协调，感官良好且具有一定的抗氧化能力，因此，本实验筛选的乳酸菌适宜生产板栗糯米发酵饮料，可为其他植物基发酵饮料的研发提供参考依据。
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图 5 不同乳酸菌发酵饮料的抗氧化活性分析注：同一指标不同小写字母表示乳酸菌发酵饮料间差异显著（P<0.05）。Figure 5. Antioxidant activity of fermented beverages by different lactic acid bacteria3. 结论
本研究从三种米酒曲样品中分离出了84株乳酸菌，经筛选后得到3株戊糖片球菌（P. pentosaceus），产酸量大于10 g/L、模拟胃肠环境试验后活菌数大于5.5 lg CFU/mL，同时具备一定的自由基清除能力和SOD酶活性。用其发酵得到的板栗糯米乳酸菌饮料，酸甜适中、口感协调、抗氧化能力较好，具有一定的应用前景。其中，以菌株DH20发酵的饮料感官评分值最高，达到82.2分，酸度为1.76 g/L，DH16发酵的饮料抗氧化活性最强，DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、SOD酶活力分别为28.8%、36.47%、14 U/mL，在实际应用中可根据实际需求选择合适的菌株，或将3株乳酸菌按一定比例复配应用到生产中，以发挥出每个菌株各自的优势。因此本实验中的3株乳酸菌可作为植物发酵的潜在益生菌，改善当前适用于植物基发酵乳酸菌较少的现状，促进非乳制品乳酸菌发酵行业的发展，对提高乳酸菌类生物制品的市场竞争力有重要意义。
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图 1 25株乳酸菌耐胆盐能力分析
注：不同字母表示差异显著（P<0.05）；图4同。
Figure 1. Ability of tolerance bile salt of 25 strains lactic acid bacteria
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图 2 10株乳酸菌耐受人工模拟胃肠液能力分析
注：0~3 h为模拟胃液处理，3~11 h为模拟肠道环境。
Figure 2. Tolerance ability of 10 strains lactic acid bacteria in artificial simulated gastric and intestinal fluid
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图 3 基于16S rDNA基因序列的片球菌属系统进化树
Figure 3. Evolutionary tree of Pediococcus based on 16S rDNA gene sequence
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图 4 不同乳酸菌发酵饮料的酸度
Figure 4. Acidity of fermented beverages by different lactic acid bacteria
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图 5 不同乳酸菌发酵饮料的抗氧化活性分析
注：同一指标不同小写字母表示乳酸菌发酵饮料间差异显著（P<0.05）。
Figure 5. Antioxidant activity of fermented beverages by different lactic acid bacteria
表 1 板栗糯米乳酸饮料感官评分标准
Table 1 Sensory rating of chestnut glutinous rice lactic acid beverage
指标 评分标准 颜色（25分） 淡乳黄色，颜色均匀（21~25分） 色泽较深，颜色大致均匀（11~20分） 色泽暗沉，严重不均匀（1~10分） 组织状态（25分） 均匀稳定，无其他杂质（21~25分） 有少量沉淀和分层，略有杂质（11~20分） 严重沉淀和分层，杂质较多（1~10分） 口感（25分） 口感细腻，酸甜适中（21~25分） 口感略粗糙，酸度较低（11~20分） 口感粗糙，糖酸比不协调（1~10分） 风味（25分） 有板栗香味，无异味（21~25分） 板栗香味较淡，无异味（11~20分） 无板栗香味，有异味（1~10分） 
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表 2 38株乳酸菌的产酸能力
Table 2 Acid production capacity of 38 lactic acid bacteria
菌株编号 产酸量（g/L） 菌株编号 产酸量（g/L） 菌株编号 产酸量（g/L） DS2 13.29±0.43kl DH31 14.64±0.54fgh DG29 11.21±0.54pq DS3 15.57±0.45cde DH33 16.00±0.33cd DG30 11.14±0.37pqr DS4 13.50±0.43kl DH34 14.57±0.43fgh DG31 18.14±0.12a DS5 16.21±0.33bc DH35 15.00±0.57efg DG32 13.57±0.33jkl DH16 13.00±0.33lm DH36 14.43±0.54ghi DG33 10.43±0.25rs DH20 15.00±0.43efg DH37 16.86±0.25b DG34 13.29±0.43kl DH23 13.71±0.21ijkl DH38 15.29±0.49def DG35 14.36±0.43ghij DH24 13.43±0.65kl DG18 14.36±0.57ghij DG36 16.14±0.33bc DH25 12.50±0.33mn DG24 10.07±0.64s DG37 13.36±0.45kl DH26 13.93±0.43hijk DG25 13.43±0.54kl DG38 13.14±0.33klm DH27 12.00±0.37no DG26 10.64±0.12qrs DG39 13.57±0.12jkl DH28 11.86±0.33nop DG27 11.21±0.54pq DG40 13.71±0.57ijkl DH29 11.36±0.43opq DG28 10.71±0.21qrs 注：表中数据形式为平均数±标准偏差（n=3）；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；表3同。
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表 3 38株乳酸菌的耐酸能力
Table 3 Acid tolerance of 38 strains of lactic acid bacteria
菌株编号 乳酸菌活菌数（lg CFU/mL） 乳酸菌耐酸能力（%） 菌株编号 乳酸菌活菌数（lg CFU/mL） 乳酸菌耐酸能力（%） 0 h 3 h 0 h 3 h DS2 7.43±0.09 6.91±0.06 93.12±1.59bc DH38 7.77±0.02 4.01±0.04 51.60±0.61op DS3 7.62±0.11 6.79±0.04 89.14±1.37d DG18 7.03±0.01 4.64±0.12 65.96±1.65kl DS4 7.53±0.11 6.43±0.05 85.46±0.72e DG24 6.74±0.07 5.11±0.19 75.86±3.37hi DS5 6.87±0.03 5.63±0.06 81.93±1.20f DG25 6.02±0.04 5.48±0.18 91.09±3.19cd DH16 7.81±0.07 5.89±0.09 75.37±1.43hi DG26 6.75±0.14 5.60±0.19 83.03±1.12ef DH20 8.42±0.04 6.18±0.05 73.36±0.79ij DG27 7.15±0.17 3.90±0.08 54.55±0.60no DH23 7.86±0.05 4.10±0.11 52.15±1.52op DG28 5.17±0.07 4.94±0.11 95.56±1.06ab DH24 8.43±0.02 6.09±0.04 72.28±0.68j DG29 5.62±0.09 4.43±0.16 78.68±1.72g DH25 8.41±0.15 6.15±0.20 73.19±1.02ij DG30 7.23±0.04 4.19±0.14 57.99±1.69m DH26 7.72±0.03 4.18±0.14 54.21±2.02nop DG31 5.85±0.06 4.50±0.11 76.81±1.11gh DH27 7.37±0.08 6.32±0.13 85.66±2.21e DG32 6.92±0.04 6.74±0.07 97.45±0.49a DH28 8.36±0.04 5.72±0.10 68.34±1.54k DG33 8.14±0.09 4.21±0.13 51.77±2.14op DH29 7.72±0.05 5.73±0.05 74.22±1.18hij DG34 7.31±0.03 4.13±0.09 56.47±1.12mn DH31 7.08±0.17 6.08±0.11 85.80±0.78e DG35 7.43±0.02 4.23±0.07 56.89±0.89mn DH33 6.82±0.04 6.92±0.07 96.72±0.96a DG36 7.41±0.15 4.18±0.18 56.43±2.25mn DH34 7.39±0.04 4.02±0.05 54.46±0.44nop DG37 7.37±0.08 4.26±0.11 57.80±1.42m DH35 6.88±0.12 5.75±0.24 83.55±2.07ef DG38 7.07±0.06 6.60±0.14 93.26±1.21bc DH36 7.97±0.04 4.10±0.12 51.48±1.70p DG39 6.50±0.16 5.39±0.19 82.93±0.91ef DH37 6.48±0.07 4.20±0.19 64.82±3.44l DG40 7.36±0.04 4.16±0.15 56.43±1.95mn
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表 4 乳酸菌对过氧化氢的耐受能力
Table 4 Resistance of lactic acid bacteria to hydrogen peroxide
菌株编号 乳酸菌活菌数（lg CFU/mL） 空白对照组 0.4 mmol/L 0.7 mmol/L 1.0 mmol/L DH16 8.52±0.26a 8.31±0.10a 8.52±0.18a 8.23±0.22a DH20 8.49±0.14ab 8.58±0.31ab 8.71±0.16a 8.29±0.10b DH24 8.45±0.14a 8.24±0.06a 8.41±0.10a 8.47±0.23a 注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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表 5 3株乳酸菌的抗氧化能力
Table 5 Antioxidant capacity of three strains lactic acid bacteria
菌株编号 样品 DPPH自由基清除率（%） 羟自由基清除率（%） SOD酶活力（U/mL） DH16 完整细胞悬液 20.58±0.69d 22.77±0.45c − 发酵上清液 98.56±0.74a 42.27±1.65a 20.3±0.10a DH20 完整细胞悬液 22.49±0.71c 16.84±0.53d − 发酵上清液 96.11±0.67b 36.61±1.17b 18.57±0.06b DH24 完整细胞悬液 14.32±1.01e 16.51±1.04d − 发酵上清液 97.25±0.16b 36.26±0.22b 11.9±0.20c 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；表6同。
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表 6 不同乳酸菌发酵饮料的感官得分
Table 6 Sensory scores of beverages fermented by different lactic acid bacteria
菌株 得分（分） 合计（分） 颜色 组织状态 口感 风味 DH16 21.0±0.94 17.2±1.03 19.9±1.66 21.0±0.67 79.1±1.20b DH20 21.7±0.95 17.4±1.35 21.2±1.93 21.9±1.20 82.2±2.90a DH24 20.1±1.19 17.0±1.25 21.6±1.07 21.5±1.27 80.2±1.99ab
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