Extraction of Tannin from Lonicera edulis and Its Effect on Yeast Fermentation Performance
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摘要: 为确定酵母菌发酵蓝靛果果汁中的最适单宁含量，采用单因素实验及正交试验优化超声辅助法提取蓝靛果单宁工艺，将此条件下获得的单宁粗提液纯化、浓缩后得到单宁酸样品。将其添加到模拟蓝靛果果汁中，研究不同浓度单宁酸对酵母菌的影响，并验证最适单宁含量对发酵蓝靛果果汁的影响。结果表明，蓝靛果单宁最优提取条件为：乙醇体积分数50%，料液比1:60（g/mL），超声温度50 ℃，超声时间40 min，此条件下单宁得率为14.68%。浓度为400 mg/L单宁酸模拟果汁中酵母菌的生长趋势良好，稳定期内酵母菌活性最高。与原发酵果汁相比，采用单宁酶处理后，最适单宁含量的发酵果汁中酒精度及总酸含量分别提高84.21%和14.58%，残糖含量及涩度值分别降低57.91%和86.32%，总酯含量提高38.45%。该含量单宁对酵母菌的发酵效果具有明显促进作用，果汁涩感降低且酸甜适中，果香及发酵香浓郁。Abstract: In order to study the optimum tannin content in Lonicera edulis juice fermented by yeast, the processing of tannins extracted from Lonicera edulis by ultrasonic-assisted was optimized by single factors and orthogonal test. The purified and concentrated tannin extract was added to the simulated Lonicera edulis juice to study the effect of different concentrations of tannins on the yeast. In addition, the optimal tannin concentration was verified for yeast fermentation of Lonicera edulis juice. Results showed that, the optimal conditions for extracting tannins from Lonicera edulis were as follows: Ethanol volume fraction 50%, liquid to solid ratio 1:60 (g/mL), ultrasonic temperature 50 ℃, ultrasound time 40 min, under which, the tannin extraction rate reached 14.68%. Yeast grew well and had the highest activity during the stable period when the tannic acid concentration of the simulated juice was 400 mg/L. Compared with the original fermented juice, the alcohol and total acid content of the fermented fruit juice with the optimum tannin content hydrolyzed by tannins increased by 84.21% and 14.58%, and the residual sugar content and astringency were reduced by 57.91% and 86.32%, respectively. Total ester content increased by 38.45%. The optimum tannin content had a significant promoting effect on the fermentation ability of yeast, the fruit juice reduced astringency and had the moderate sour and sweetness with a strong fruity and fermented aroma.
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Keywords:
- Lonicera caerulea /
- ultrasound assisted extraction /
- yeast /
- tannin /
- simulated juice
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蓝靛果（Lonicera caerulea L），属蓝果忍冬的变种[1]。果实呈蓝紫色椭圆状，是一种含有多酚、花青素、黄酮、维生素等物质的天然野生浆果[2]，因具备抗突变、保护心脏等药理特性，被称为长寿水果[3-4]。蓝靛果味道酸涩、不宜鲜食，多以果汁等饮品形式出现[5]。浆果果汁中，单宁释放构成了果汁的口感骨架[6]，而果汁的涩感来源于单宁酸与人体口腔唾液蛋白结合引起的收敛感，对果汁特征的口感的形成是必要的[7]，但当单宁含量过多时，涩感物质或颗粒物进入口腔，在口腔软组织内部形成表层，使唾液黏膜的润滑作用降低，且摩擦作用增加[8-9]，人体感触到的涩味加重。蓝靛果加工成果汁后，酸涩感明显且消费体验较差，这是由于其单宁含量远远高于普通浆果，通常达到675~705 mg/L左右[10]。采用酵母菌发酵蓝靛果果汁可以在一定程度上缓解其酸涩的问题，而单宁含量对果汁口感及酵母菌生长均有一定影响。因此，在保证果汁口感良好且不影响发酵效果的前提下，确定最适单宁含量，对于提高蓝靛果果汁的感官品质至关重要。目前，关于浆果及果蔬中单宁的研究多集中于脱涩及提取等方面。如岳珍珍等[11]对刺梨果汁进行脱单宁处理，确定LX-60树脂对单宁的脱除效果最好。张鑫[12]在黑果腺肋花楸汁的脱涩研究中发现，单宁酶及酵母脱涩后的果汁单宁含量最低，且营养成分仍保留。李晓静等[13]确定了超声波法提取香蕉皮单宁的最优条件。然而，蓝靛果单宁提取及对酵母发酵能力影响，进而对发酵果汁品质的研究尚未见文献报道。
基于此，本实验通过超声波辅助法探索蓝靛果单宁的最优提取条件，对其纯化后，将其添加到模拟蓝靛果果汁中，考察蓝靛果中所含的单宁对发酵蓝靛果果汁中酵母菌发酵能力的影响，最后通过单宁酶对蓝靛果果汁进行处理，在获得最佳单宁含量的基础上，进行果汁发酵，以验证单宁对酵母菌生长及果汁品质的影响，从而确定蓝靛果果汁中最适合发酵的单宁含量。为发酵蓝靛果果汁的生产创造条件基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
‘蓓蕾’蓝靛果 黑龙江省七台河市，−4 ℃冷冻贮藏；LA-DE酵母菌 烟台帝伯仕自酿机有限公司；单宁酸标准品 美国Sigma公司；D101大孔树脂 天津汇达化工有限公司；福林酚 上海蓝季有限公司；无水乙醇 天津天力化学试剂有限公司；蛋白胨 北京奥博星生物技术有限公司；单宁酶（食品级，酶活力100000U/g） 安徽中旭生物有限公司。
TD5A台式高速离心机 湖南凯达仪器有限公司；UV-5200 紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；KQ-250DE超声清洗器 昆山超声仪器有限公司；折光仪 上海力辰有限公司；恒温培养箱 上海智城仪器制造公司；DK-98-IIA恒温水浴锅 天津泰斯特有限公司；ZLG-10冻干机 宁肯夏亚康设备公司。
1.2 实验方法
1.2.1 单宁酸标准曲线及得率测定
采用福林-酚法测定[14]，量取单宁酸标准溶液（0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL）移入容量瓶中，加30 mL蒸馏水、2 mL福林酚试剂和10 mL饱和碳酸钠，定容至50 mL，避光静置显色1 h，测量吸光度（765 nm）。得到标准方程为：y=0.0602x+0.0338，R2=0.9997。量取一定体积样品提取液，同上述方法显色后，根据线性方程及公式（1）计算样品得率：
(1) 式中：C为样品单宁酸浓度，mg/mL；V1为提取液总体积，mL；V2为提取液测定体积，mL；M为样品质量，g。
1.2.2 超声辅助法优化蓝靛果单宁提取条件
1.2.2.1 单因素实验设计
称量5.00 g解冻打浆后的蓝靛果于锥形瓶，与一定体积分数的乙醇溶液混匀，使蓝靛果中单宁充分扩散至溶液中。经过超声辅助提取、离心（5000 r/min、10 min）得上清液，即为蓝靛果单宁粗提液。固定提取条件：料液比1:70，乙醇体积分数60%，超声温度50 ℃，超声功率80 W，超声时间40 min。分别考察料液比（1:50、1:60、1:70、1:80 g/mL）、乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%）、超声时间（20、30、40、50 min）、超声温度（40、50、60、70 ℃）、超声功率（0、20、40、60、80、100、120、140 W）对单宁得率的影响。
1.2.2.2 正交试验设计
依据单因素实验结果，选取乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间四个对单宁得率有显著影响的因素，设计正交试验对蓝靛果单宁提取工艺参数进行优化，正交试验因素及水平见表1。
表 1 正交试验因素及水平Table 1. Orthogonal experimental factors and level水平 因素 A乙醇体积分数（%） B料液比（g/mL） C超声温度（℃） D超声时间（min） 1 50 1:60 40 30 2 60 1:70 50 40 3 70 1:80 60 50 1.2.3 蓝靛果单宁的纯化及含量测定
参照尚俊等[15]方法，利用D101大孔树脂吸附1.2.2最优条件下提取的单宁粗提液。将单宁粗提液与一定量已预处理过的树脂混合，置于30 ℃、110 r/min的摇床中，振荡24 h后过滤，以60%的乙醇溶液洗脱，再将提取液于45 ℃、0.065 MPa下旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥得蓝靛果单宁酸样品。单宁得率测定同1.2.1福林-酚法，按公式（2）计算：
(2) 式中：T为样品单宁得率，mg/L；C为样品单宁酸浓度，mg/mL；V1为样品定容体积，mL；V2为样品测定体积，L；n为稀释倍数。
1.2.4 模拟蓝靛果果汁及发酵液的制备
模拟蓝靛果果汁：参照郭换丽等[16]的方法。准确称取柠檬酸25 mmol/L，葡萄糖50 mmol/L，磷酸氢二铵25 mmol/L以蒸馏水溶解，调节pH为3.5。发酵蓝靛果果汁的制备：在模拟蓝靛果果汁中分别加入1.2.3得到的不同质量的单宁酸，得到不同单宁酸浓度（200、400、600、800、1000 mg/L）的待发酵的模拟蓝靛果果汁于无菌操作下，接种2%活化好的酵母菌，于20 ℃进行恒温培养。
1.2.5 酵母菌生长曲线测定
在无菌操作条件下，每隔4 h取发酵过程中不同浓度模拟果汁各5 mL，稀释10倍，于560 nm下测定吸光度（OD值），以未接种的模拟果汁为对照，观察不同浓度单宁酸模拟蓝靛果果汁36 h内酵母菌的生长状况，根据OD值绘制生长曲线[17]。
1.2.6 指标测定
1.2.6.1 理化指标
残糖含量测定利用折光仪[18]；酒精度测定参照 GB/T 15038-2006《葡萄酒果酒通用分析方法》酒精计法[19]；总酸含量测定参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》酸碱滴定法[20]；总酯含量测定利用皂化法[21]。
1.2.6.2 涩度指标
模拟唾液的制备：准确称取1.3 g KCl，0.1g NaCl，50 mg MgCl2，0.1 g CaCl2，25 μg NaF，27 mg KH2PO4和35 mg K2HPO4，溶解后，以蒸馏水定容至1 L，得电解质溶液；以该溶液为溶剂，溶解不同质量的蛋白胨，得模拟唾液蛋白溶液备用。
参照包赛依娜等[22]建立的涩感定量方法。将初始单宁酸含量不同的发酵模拟果汁与0～3 g/L不同梯度人体口腔模拟唾液蛋白溶液在37 ℃下作用2 h，10000 r/min离心5 min，测定上清液的吸光值（330 nm），以唾液蛋白浓度及吸光度作图，发酵后模拟果汁涩度值由对数曲线斜率绝对值表示。
1.2.7 感官评价
评价小组由经过感官培训的20人组成（男女各10人），分别以口感、香气、状态、色泽四项指标评定，具体评分标准见表2。
表 2 蓝靛果果汁的感官评价Table 2. Sensory evaluation standard for Lonicera edulis juice项目 评价标准 分数（分） 口感
（30分）果味浓郁，口感丰富，酸甜均衡，涩味适度 20~30 果味淡薄，口感欠佳，略酸或略甜，涩味微弱 10~19 无果味，口感不协调，酸甜失衡，涩味较重 0~9 香气
（30分）果香和发酵香醇厚，无异味 20~30 果香和发酵香寡淡，略有异味 10~19 无果香和发酵香，有异味 0~9 状态
（20分）质地均匀，澄清、无悬浮物 14~20 略有浑浊及沉淀物 7~13 分层明显，混浊、悬浮物较多 0~6 色泽
（20分）颜色协调，光泽度良好 14~20 颜色存在偏差，略有光泽 7~13 颜色异常或褪色，光泽度差 0~6 1.2.8 验证试验
根据以上实验确定蓝靛果果汁的最适单宁酸浓度，采用单宁酶控制果汁单宁含量，并依据前期预实验确定的单宁酶酶解最佳条件：水解时间60 min，水解温度40 ℃，单宁酶添加量1.9 mg/ml，使其接近最适含量。将原果汁及单宁酶处理后得到的果汁分别接种2%的酵母菌，在20 ℃下发酵7 d，验证最适单宁含量对蓝靛果果汁品质的影响。
1.3 数据处理
所有试验重复测定3次。通过SPSS 24.0进行实验数据的显著性差异分析（P<0.05）。利用Excel 2016及Origin Pro 8.5软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 蓝靛果单宁提取的单因素实验结果
由图1可知，单宁得率受料液比及溶剂浓度的影响显著（P<0.05），当料液比为1:70时，得率为最高值14.6%，当料液比增加至1:80时，得率呈下降趋势，说明若继续增加溶剂体积将不利于单宁的溶出，且可能导致资源浪费。而浓度为60%的乙醇溶剂极性更适宜单宁溶出，但浓度过高导致醇解反应[23]，单宁溶出速率远低于其他杂质。综合考虑，选取料液比为1:60~1:80、溶剂浓度为50%～70%进行后续研究。
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图 1 料液比（a）及乙醇体积分数（b）对单宁得率的影响Figure 1. Effects of material-liquid ratio（a） and ethanol volume fraction（b） on yield of tannins由图2可知，在时间为40 min时，单宁得率最高（P<0.05），此后时间延长，得率却降低，由于单宁属于多酚类物质，含有较多的酚羟基，其中邻位酚羟基结构具有极强的还原性，导致单宁结构稳定性差，过长的超声时间会使其结构氧化或分解。当超声温度为50 ℃时，单宁得率达到13.2%，说明此温度能够加快分子间的热运动，从而加快单宁的扩散，使溶解速率提升。但当温度持续升高，由于聚合单宁被液化而失去活性[24]，损失率增加，得率随之下降。因此，确定温度40~60 ℃，时间30~50 min的超声条件进行后续研究。
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图 2 超声时间（a）及超声温度（b）对单宁得率的影响Figure 2. Effects of ultrasonic time（a） and temperature（b） on yield of tannins由图3可知，功率为80 W时的得率最高，而当功率升高，得率却呈下降趋势，基于超声波原理推测原因为：功率越大，超声波加速作用越强，机械冲击力推动了单宁粒子运动，加快其氧化分解，得率降低，且差异不显著（P>0.05）。因此，超声功率确定为80 W。
2.2 超声辅助提取蓝靛果单宁的正交试验结果
根据表3的极差分析R值可知，影响蓝靛果单宁得率的因素顺序为D>C>B>A，即乙醇体积分数<料液比<超声温度<超声时间。由表4可知，四个因素对单宁得率的影响均达到显著水平（P<0.05），该结果与极差分析结果一致。通过正交试验分析得出，蓝靛果单宁提取的最优条件为A1B1C2D3，即乙醇体积分数50%，料液比1:60 （g/mL），超声温度50 ℃，超声时间40 min。此条件下重复3次试验，蓝靛果单宁平均得率为14.68%。
表 3 正交试验及结果Table 3. Orthogonal experiments and results实验号 A B C D 得率（%） 1 1 1 1 1 10.81 2 1 2 2 2 10.20 3 1 3 3 3 10.80 4 2 1 2 3 13.89 5 2 2 3 1 9.74 6 2 3 1 2 7.61 7 3 1 3 2 8.24 8 3 2 1 3 11.24 9 3 3 2 1 11.69 K1 10.60 10.98 9.89 10.75 K2 10.41 10.39 11.93 8.68 K3 10.39 10.03 9.59 11.98 R 0.21 0.95 2.34 3.30 优水平 A1 B1 C2 D3 表 4 正交试验方差分析Table 4. Orthogonal experiments variance analysis来源 平方和 自由度 均方 F值 A 0.243 2 0.121 155.272* B 4.110 2 2.055 2.629×103* C 28.977 2 14.489 18.539×103* D 49.783 2 24.892 31.851×103* 误差 0.014 18 0.01 总计 3041.635 27 注：*表示P<0.05，差异显著。 2.3 单宁对酵母菌发酵能力的影响
2.3.1 单宁酸对模拟蓝靛果果汁中酵母菌生长曲线的影响
由图4可知，酵母菌在不同浓度单宁酸模拟果汁中的生长规律具有典型性，生长趋势大体一致，迟滞期均为0~4 h，在迟滞期内，400 mg/L单宁酸模拟果汁中酵母菌的活性较高，说明此浓度下酵母菌的起酵性能及对营养物质的吸收能力良好。在对数期内，浓度不同的模拟果汁中酵母菌的活性大小为400>600>200>800>1000 mg/L，且当浓度为200、600、800、1000 mg/L时，酵母菌生长稳定期均开始于20 h，此时对数期结束，直至32 h后酵母开始衰亡，生长趋势下降。相比之下，400 mg/L单宁酸模拟果汁中酵母菌生长对数期为4~16 h，随后进入稳定期，其稳定期持续时间最长、活性最高，说明此阶段微生物积累代谢产物能力最强。因此，初步判断400 mg/L单宁酸模拟果汁中酵母菌具有优良的发酵潜质。
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图 4 不同浓度单宁酸模拟果汁酵母菌生长曲线Figure 4. Growth curve of simulated fruit juice yeast with different concentrations of tannin2.3.2 单宁酸对模拟蓝靛果果汁中残糖量及酒精度的影响
酵母菌利用糖类物质进行糖酵解、丙酮酸脱羧、三羧酸循环等一系列生化反应，从而产生酒精[25]，酒精度的变化规律与残糖量相符。由图5可知，生长环境对酵母菌发酵能力变化影响显著。低浓度（200 mg/L）单宁酸模拟果汁的残糖量最高，为2.4%Brix，这是因为糖类物质作为发酵基质没有被充分消耗，发酵效果不佳；而高浓度单宁酸（600、800、1000 mg/L）模拟果汁的残糖量间无显著差异（P>0.05），且酒精度一致较低，可能是单宁酸浓度过高，由于发酵过程中酵母本身老化等原因，导致活性受到抑制，酵母菌对糖类物质消耗速率的影响较小。当单宁酸浓度为400 mg/L时，果汁的残糖含量最少，酒精度最高，分别为1.8%Brix和1.2%vol，说明此环境下酵母菌耗糖速率最快，活力充足，酒精等代谢产物的积累相对较多。
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2.3.3 单宁酸对酵母菌产酸能力的影响
由图6可知，不同浓度的单宁酸模拟果汁在产酸量与耗糖量方面的发酵特性相似，总酸含量变化各不相同。低浓度单宁酸（200 mg/L）模拟果汁的产酸能力最弱，说明此时酵母菌的分解代谢及启酵速率迟缓；浓度为400和600 mg/L单宁酸模拟果汁的总酸含量相对较高，当单宁酸浓度继续增大，产酸速率明显下降且变化幅度较小，这表明当单宁酸浓度达到饱和时对酵母菌产酸速率基本无影响，即高浓度的单宁酸对酵母菌产酸速率基本无影响。
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图 6 不同浓度单宁酸对模拟果汁总酸含量的影响Figure 6. Effects of different concentration tannic acid on total acid content of simulated juice2.3.4 单宁酸对酵母菌产酯能力的影响
酯类作为蓝靛果果汁香气物质的主要载体[26]，发酵过程中成分变化复杂。由图7可知，当模拟果汁中单宁酸的浓度增大，总酯含量呈开口向下的折线趋势，即浓度为400 mg/L单宁酸模拟果汁的产酯能力显著高于其它浓度模拟果汁（P<0.05），其总酯含量达到2.87 g/L，说明在相同培养条件下，400 mg/L单宁酸模拟果汁中酵母菌自身代谢所需的营养物质（醇类、有机酸等）充足，利于酯类物质积累。
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图 7 不同浓度单宁酸对模拟果汁总酯含量的影响Figure 7. Effects of different concentration tannic acid on total ester content of simulated juice2.3.5 单宁酸对模拟蓝靛果果汁涩度的影响
根据浓度不同的单宁酸模拟果汁与唾液蛋白溶液（0、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3 g/L）反应，建立吸光度与唾液蛋白质量浓度的对数曲线，如图8所示。对数曲线方程及斜率绝对值见表5，以对数曲线斜率绝对值大小衡量果汁涩度的相对强弱。不同浓度单宁酸模拟蓝靛果果汁涩度值结果见图9。
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图 8 不同浓度单宁酸对模拟果汁与唾液蛋白反应曲线注：a~e分别表示为200、400、600、800、1000 mg/LFigure 8. Reaction curve of different concentrations of tannic acid on simulation juice and salivary protein表 5 对数曲线方程及相关系数Table 5. Logarithmic curve equation and correlation coefficient单宁酸浓度（mg/L） 曲线方程 系数绝对值 200 y=−0.033ln（x）+0.0466 0.033 400 y=−0.019ln（x）+0.1726 0.019 600 y=−0.036ln（x）+0.3269 0.036 800 y=−0.079ln（x）+0.2801 0.079 1000 y=−0.090ln（x）+0.5676 0.090 ![]()
图 9 不同浓度单宁酸对模拟果汁涩度的影响Figure 9. Effect of different concentrations of tannic acid on the astringency of simulated juice由图9可知，模拟果汁的初始单宁酸浓度对涩感强度有着直接影响，浓度为400 mg/L单宁酸模拟蓝靛果果汁的涩度值最低（P<0.05），而高于400 mg/L时，涩度加重。一方面，因为高浓度单宁酸产生的涩味与酸性模拟果汁中的涩味重叠，使涩感更强烈；另一方面，因为唾液蛋白的结构在酸性环境中不稳定，增大了其与单宁酸的结合几率[27]，因此，对涩度的感知力增强。此外，有研究表明单宁的平均聚合度（Mean Degree of Polymerization，MDP）对涩感有一定影响[28]，当单宁MDP在酵母菌发酵过程中发生变化时，涩度值随之改变。
2.4 单宁酸浓度对蓝靛果果汁影响的验证试验
由上述分析初步确定蓝靛果果汁中最适单宁酸含量为400 mg/L，而蓝靛果果汁实际单宁含量为872 mg/L。在1.2.8中单宁酶酶解的最佳条件下，单宁含量可降低为401 mg/L，与最适含量接近。对原果汁及单宁酶处理得到的最适单宁含量的果汁进行酵母菌发酵，理化指标及感官评价结果见表6及图10。
表 6 发酵蓝靛果果汁理化指标Table 6. Physical and chemical indexes of fermented Lonicera edulis juice样品 酒精（%vol） 残糖（%Brix） 总酸（g/L） 总酯（g/L） 涩度 原发酵果汁 0.3±0.04b 3.35±0.05a 12.71±0.05b 3.01±0.12b 0.095±0.02a 最适单宁含量的发酵果汁 1.9±0.03a 1.41±0.02b 14.88±0.13a 4.89±0.09a 0.013±0.07b 注：同列的不同字母代表样品的差异具有显著性（P<0.05）。 由表6可知，与原发酵果汁相比，单宁酶处理过的蓝靛果果汁经发酵后，糖类物质的消耗量明显升高，酒精度、总酸含量分别提高84.21%和14.58%，总酯提高38.45%，涩度值降低86.32%。这表明，该最适单宁含量对发酵蓝靛果果汁中酵母菌的发酵效果具有显著促进作用，而且对果汁起到一定产酯增香作用，有效降低了果汁涩感。
由图10可知，感官差异性主要表现为：原发酵果汁的酸涩感突出，残存于喉咙的后味时间较长，果香味淡薄，沉淀物肉眼可见，总体评分为66±1分。而最适单宁含量的发酵果汁口感饱满，酸甜均衡且涩味适中，果香及发酵香醇厚，光泽度悦目，总体评分为（88±1）分。
3. 结论
以单因素实验为基础，通过正交优化试验确定超声辅助法提取蓝靛果单宁的条件为：乙醇体积分数50%，料液比1:60（g/mL），超声温度50 ℃，超声时间40 min，此时蓝靛果单宁得率为14.68%。
最优条件下提取的单宁粗提液经纯化、浓缩，得单宁酸样品。研究不同质量浓度单宁酸模拟果汁中酵母菌的发酵能力，并验证最适单宁含量对发酵蓝靛果果汁的影响。研究结果表明：浓度为400 mg/L单宁酸模拟果汁中酵母菌的生长规律具有典型性且趋势良好，稳定期内活性最高。与原发酵果汁相比，采用单宁酶处理后，最适单宁含量对发酵蓝靛果果汁中酵母菌的发酵效果具有显著促进作用，果汁的涩感明显降低且酸甜适中，果香及发酵香浓郁，酒精度为1.9%vol，总酸含量为14.88 g/L，分别提高84.21%和14.58%，残糖含量降低57.91%。此外，总酯含量提高38.45%，涩度值降低86.32%，这是由于单宁酶的作用使果汁中部分缩合单宁被水解，同时较好地保存了发酵果汁所积累的香气成分。
综上所述，蓝靛果果汁的最适单宁含量为400 mg/L，此时对酵母菌的发酵能力具有一定提升作用。研究结果可为后续深入探讨蓝靛果果汁的发酵技术及酚类物质浓度变化对果汁发酵品质的影响提供理论支持。
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图 1 料液比（a）及乙醇体积分数（b）对单宁得率的影响
Figure 1. Effects of material-liquid ratio（a） and ethanol volume fraction（b） on yield of tannins
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图 2 超声时间（a）及超声温度（b）对单宁得率的影响
Figure 2. Effects of ultrasonic time（a） and temperature（b） on yield of tannins
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图 4 不同浓度单宁酸模拟果汁酵母菌生长曲线
Figure 4. Growth curve of simulated fruit juice yeast with different concentrations of tannin
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图 6 不同浓度单宁酸对模拟果汁总酸含量的影响
Figure 6. Effects of different concentration tannic acid on total acid content of simulated juice
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图 7 不同浓度单宁酸对模拟果汁总酯含量的影响
Figure 7. Effects of different concentration tannic acid on total ester content of simulated juice
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图 8 不同浓度单宁酸对模拟果汁与唾液蛋白反应曲线
注：a~e分别表示为200、400、600、800、1000 mg/L
Figure 8. Reaction curve of different concentrations of tannic acid on simulation juice and salivary protein
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图 9 不同浓度单宁酸对模拟果汁涩度的影响
Figure 9. Effect of different concentrations of tannic acid on the astringency of simulated juice
表 1 正交试验因素及水平
Table 1 Orthogonal experimental factors and level
水平 因素 A乙醇体积分数（%） B料液比（g/mL） C超声温度（℃） D超声时间（min） 1 50 1:60 40 30 2 60 1:70 50 40 3 70 1:80 60 50 
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表 2 蓝靛果果汁的感官评价
Table 2 Sensory evaluation standard for Lonicera edulis juice
项目 评价标准 分数（分） 口感
（30分）果味浓郁，口感丰富，酸甜均衡，涩味适度 20~30 果味淡薄，口感欠佳，略酸或略甜，涩味微弱 10~19 无果味，口感不协调，酸甜失衡，涩味较重 0~9 香气
（30分）果香和发酵香醇厚，无异味 20~30 果香和发酵香寡淡，略有异味 10~19 无果香和发酵香，有异味 0~9 状态
（20分）质地均匀，澄清、无悬浮物 14~20 略有浑浊及沉淀物 7~13 分层明显，混浊、悬浮物较多 0~6 色泽
（20分）颜色协调，光泽度良好 14~20 颜色存在偏差，略有光泽 7~13 颜色异常或褪色，光泽度差 0~6
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表 3 正交试验及结果
Table 3 Orthogonal experiments and results
实验号 A B C D 得率（%） 1 1 1 1 1 10.81 2 1 2 2 2 10.20 3 1 3 3 3 10.80 4 2 1 2 3 13.89 5 2 2 3 1 9.74 6 2 3 1 2 7.61 7 3 1 3 2 8.24 8 3 2 1 3 11.24 9 3 3 2 1 11.69 K1 10.60 10.98 9.89 10.75 K2 10.41 10.39 11.93 8.68 K3 10.39 10.03 9.59 11.98 R 0.21 0.95 2.34 3.30 优水平 A1 B1 C2 D3
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表 4 正交试验方差分析
Table 4 Orthogonal experiments variance analysis
来源 平方和 自由度 均方 F值 A 0.243 2 0.121 155.272* B 4.110 2 2.055 2.629×103* C 28.977 2 14.489 18.539×103* D 49.783 2 24.892 31.851×103* 误差 0.014 18 0.01 总计 3041.635 27 注：*表示P<0.05，差异显著。
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表 5 对数曲线方程及相关系数
Table 5 Logarithmic curve equation and correlation coefficient
单宁酸浓度（mg/L） 曲线方程 系数绝对值 200 y=−0.033ln（x）+0.0466 0.033 400 y=−0.019ln（x）+0.1726 0.019 600 y=−0.036ln（x）+0.3269 0.036 800 y=−0.079ln（x）+0.2801 0.079 1000 y=−0.090ln（x）+0.5676 0.090
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表 6 发酵蓝靛果果汁理化指标
Table 6 Physical and chemical indexes of fermented Lonicera edulis juice
样品 酒精（%vol） 残糖（%Brix） 总酸（g/L） 总酯（g/L） 涩度 原发酵果汁 0.3±0.04b 3.35±0.05a 12.71±0.05b 3.01±0.12b 0.095±0.02a 最适单宁含量的发酵果汁 1.9±0.03a 1.41±0.02b 14.88±0.13a 4.89±0.09a 0.013±0.07b 注：同列的不同字母代表样品的差异具有显著性（P<0.05）。
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