Effects of Free Phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on Apoptosis, Cell Cycle and Inflammatory Factors in CCl4 Induced Hepatocyte Injury
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摘要: 通过体外实验，研究地参游离酚对CCl4所致肝细胞损伤细胞凋亡、细胞周期及炎症因子的影响。采用流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期的分布，采用试剂盒测定肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素8（IL-8）的含量和天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）活化程度，同时采用免疫组化检测环氧化酶-2（COX-2）、白介素6（IL-6）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白表达水平。结果表明，与模型组相比，地参游离酚能显著降低CCl4引起的细胞凋亡，影响细胞周期的分布，能显著降低炎症因子TNF-α、IL-8的含量并阻滞Caspase-3的活化程度（P<0.05），并不同程度降低COX-2、IL-6和iNOS蛋白表达水平（P<0.05）。地参游离酚通过抑制细胞凋亡、影响细胞周期分布和抑制炎症反应保护CCl4所致的肝细胞损伤。Abstract: To investigate the effects of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on apoptosis, cell cycle and inflammatory factors in CCl4 induced hepatocyte injury by using a in vitro experiment. Apoptosis and the distribution of cell cycle was analyzed by flow cytometry. The contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-8 (IL-8) and the activation of Caspase-3 were measured by kits. The protein expression levels of cyclooxygenase-2 (COX-2), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and interleukin-6 (IL-6) were also detected by immunohistochemistry. The results showed that compared with the model group, the free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. could significantly reduce the apoptosis induced by CCl4 and affect the distribution of cell cycle. In addition, the free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. decreased the contents of TNF-α and IL-8 and blocked the activation of Caspase-3 (P<0.05). The free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. also decreased the expression of COX-2, IL-6 and iNOS (P<0.05). The free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. could protect the CCl4 induced hepatocyte injury through inhibiting apoptosis, affecting cell cycle distribution and inhibiting inflammatory reaction.
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肝脏在人类健康中起着至关重要的作用。当肝脏暴露于过量的某些有害物质中时，就会造成组织损伤、坏死及原有生物功能的丧失[1-2]。肝损伤伴肝代谢功能障碍可导致许多疾病，包括从肝酶水平的短暂升高到危及生命的肝纤维化、肝硬化，甚至肝肿瘤等[3]。目前，运用于治疗肝损伤和预防的药物有很多，但是，此类药物都具有相对严重的毒副作用[4]。因此，来源于天然动植物中安全高效的活性成分，用于此类疾病的防治已成为现今研究者关注的焦点[5]。已有研究表明，酚类化合物具有多种生物学作用，如抗氧化、抗动脉硬化、抑制肿瘤、抑制微生物、影响酶活性、保护CCl4肝损伤等[6-11]。
地参（Lycopus lucidus Turcz.），唇形科属多年草本植物，其形状、营养与人参相似[12]。地参含有矿物质、氨基酸、黄酮类、酚类和糖类等多种活性成分，具有增强免疫、抗氧化、降血糖、降血脂、抑制消化酶活性及抗肿瘤等作用[13-16]。前期研究结果显示，在体内动物实验中，地参游离酚提取物通过抗氧化、抗炎发挥对CCl4所致肝损伤小鼠的保护作用[17]；在体外细胞实验中，地参酚类化合物能显著降低CCl4所致BRL肝细胞损伤谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）活性的升高[17-19]，但其作用机制尚不清楚，而CCl4所致肝损伤与细胞凋亡[20]、细胞周期的分布[21]、炎症反应[22]等密切相关。
本研究通过建立CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤模型，采用流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期分布，检测炎症反应的介质因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素8（IL-8）的含量、Caspase-3的活化程度以及环氧化酶-2（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和白介素6（IL-6）的蛋白表达水平，从细胞及分子水平揭示地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤的保护作用机制，并作为开发地参保肝功能性食品及药品的前期基础研究，为地参资源的开发与利用和保肝药物的开发提供借鉴。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
地参 2019年10月采于云南省剑川县沙溪镇；BRL大鼠肝细胞 中国科学院细胞库；胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培养液 Gibco公司；细胞周期检测试剂盒 凯基生物技术股份有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒、Caspase-3活性测试盒 南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-8 Elisa检测试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；COX-2、iNOS、IL-6一抗、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗、组化试剂盒DAB显色剂 武汉赛维尔生物科技有限公司。
Scientz-ND真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司；RCO3000T-5-VBC 二氧化碳培养箱 美国REVCO公司；722N可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；ELx800全自动酶标仪 美国Bio-Tek基因有限公司；FACSCalibur流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司；BX53倒置荧光显微镜 日本Olympus公司；GT1001组化笔 美国Genentech公司。
1.2 实验方法
1.2.1 地参游离酚的制备
参照黄菊华等[23]的方法，并略加修改。地参粉末（地参经清洗、真空冷冻干燥、粉碎过60目筛，得到地参粉末）和80%的甲醇溶液以料液比1:20（g:mL）的比例充分混匀，在室温条件下，利用100 Hz超声波对混合溶液进行辅助提取，3次（每次10 min）后合并滤液，35 ℃减压浓缩去除甲醇，剩余液体加入适量6 mol/L的盐酸调节pH为1~2，并利用乙酸乙酯萃取，5次后合并对应的乙酸乙酯相，并在35 ℃下，减压浓缩，除去乙酸乙酯，剩余浓缩液用蒸馏水定容至15 mL，即得地参游离酚粗提物。称取一定量预处理后的X-5大孔树脂，将其加入到地参游离酚粗提物中，35 ℃水浴振荡24 h后抽滤，将树脂置于70%的乙醇溶液中水浴振荡24 h进行解析，过滤，将滤液35 ℃旋转蒸发除去乙醇，剩余浓缩液真空冷冻干燥24 h，得地参游离酚提取物纯品（得率为1.79%）。使用杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS，2.67 mmol/L KCl，1.47 mmol/L KH2PO4，137.93 mmol/L NaCl，8.06 mmol/L Na2HPO4，pH为7.4±0.1）使其充分溶解，配制成浓度为5 mg/mL的溶液，临用前用完全培养液（DMEM高糖培养液+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素溶液）稀释成各个浓度的应用液。
1.2.2 实验设计
实验分为正常对照组、地参游离酚干预组及模型组。取对数期的BRL大鼠肝细胞以5×104个/mL接种到6孔板中，每孔2 mL，37 ℃ 5% CO2培养48 h后，地参游离酚干预组分别加入2 mL不同浓度（0.4、0.8、1.6 mg/mL）的地参游离酚，并为正常组和模型组提供2 mL的完全培养液，培养4 h。随后，正常组加入800 μL完全培养液，地参游离酚干预组和模型组加入800 μL 100 mmol/L的CCl4溶液，继续培养3 h。
1.2.3 细胞凋亡的检测
按照Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒说明书进行操作，细胞按1.2.2方法处理后，4 ℃ 1100 r/min离心5 min，去上清，加入结合液500 μL，轻微重悬细胞，随后加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，轻轻摇晃，充分混匀，在25 ℃下避光反应10 min，并采用流式细胞仪（Annexin V和PI双染法）检测溶液中细胞凋亡情况。
1.2.4 细胞周期分布的检测
按1.2.2方法处理细胞后，4 ℃ 1100 r/min离心5 min，去上清，用500 μL 70%的冰乙醇固定。D-PBS洗去固定液，4 ℃1100 r/min离心5 min，去上清，加入PI/RNase A染色工作液500 μL，室温下避光反应60 min，采用流式细胞仪分析细胞周期的变化。
1.2.5 炎症因子的测定
按1.2.2方法处理细胞后，收集各实验组细胞培养上清液，4 ℃ 3000 r/min离心20 min，BRL大鼠肝细胞培养上清液中TNF-α、IL-8含量分别按TNF-α、IL-8 Elisa检测试剂盒说明书进行测定。TNF-α、IL-8标准曲线的回归方程分别为y=0.0042x+0.0439（R2=0.9912，0～320 pg/mL）和y=0.0069x+0.0014（R2=0.9992，0～240 pg/mL）。
1.2.6 Caspase-3活化程度的测定
按1.2.2方法处理细胞后，各孔均加入0.5 mL的1% Triton X-100裂解细胞，充分吹打混匀，无菌离心管收集培养液，4 ℃ 1100 r/min离心5 min，取上清液。BRL大鼠肝细胞Caspase-3活化程度按Caspase-3活性测试盒说明书进行测定。
1.2.7 蛋白表达水平检测
将处理好的盖玻片（24×24 mm）放入6孔板中制备细胞爬片，然后按1.2.2方法处理细胞后，吸走上清液，使用通用组织固定液固定15~20 min，吸走固定液，用D-PBS清洗1~2次。使用免疫组化方法检测相关因子蛋白表达水平，具体步骤有：细胞破膜、血清封闭、加COX-2/iNOS/IL-6一抗、加HRP标记的山羊抗兔IgG二抗、DAB显色、复染细胞核、脱水封片，最后在显微镜下观察并拍照（400×），并使用Image-Pro Plus 6.0软件读取积分光密度值定量分析蛋白表达情况。阳性表达结果为：若细胞质呈棕黄色至深棕黄色定义为阳性，若只有细胞核着色，细胞质不着色或细胞核、细胞质均不着色定义为阴性[24]。
1.3 数据处理
实验均设置5个复孔，数据以均数±标准差（
2. 结果与分析
2.1 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤细胞凋亡的影响
图1中左上象限代表坏死细胞，左下象限代表正常细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞，右下象限代表早期凋亡细胞。与正常组（图1a）相比，CCl4模型组中凋亡细胞明显增多，正常细胞明显减少（图1b）；经不同浓度的地参游离酚干预后，凋亡细胞不断减少，正常细胞逐渐增多（图1c、d、e）。定量分析结果显示（图2），与正常组相比，CCl4模型组的正常细胞减少85.67%（P<0.05），早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞分别增加32.92%和47.77%（P<0.05），表明CCl4可诱导细胞凋亡，导致肝细胞坏死。与CCl4模型组相比，0.4、0.8、1.6 mg/mL的地参游离酚干预组正常细胞分别增加27.16%、41.43%和68.00%（P<0.05），早期凋亡细胞分别减少33.53%、37.89%、32.06%（P<0.05），晚期凋亡细胞分别减少39.31%、36.16%、39.01%（P<0.05），表明地参游离酚在一定程度上可以降低细胞凋亡率，抑制肝细胞坏死，从而发挥保护作用，这与喻铭佳[25]的研究结果一致。
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图 1 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤细胞凋亡的影响注：a：正常组；b：模型组；c~e：分别为0.4、0.8和1.6 mg/mL地参游离酚干预组；图3、图5同。Figure 1. Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell apoptosis of BRL hepatocyte injured by CC14![]()
图 2 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤细胞凋亡影响的定量分析注：1：正常组；2：模型组；3~5：分别是浓度为0.4、0.8和1.6 mg/mL的地参游离酚干预组；图4、图6同。Figure 2. Quantitative analysis of the effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell apoptosis of BRL hepatocyte injured by CC142.2 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤细胞周期分布的影响
图3中最高峰为G1期，最高峰前出现的小峰为sub-G1期（细胞凋亡峰），最高峰后面依次为S期和G2期。与正常组（图3a）相比，CCl4模型组出现明显的细胞凋亡峰（图3b）；经不同浓度的地参游离酚干预后，细胞凋亡峰逐渐降低（图3c、d、e）。由图4可以看出，相较于正常组而言，CCl4模型组中，处于sub-G1期的BRL大鼠肝细胞的比例显著升高（P<0.05），而处于G0/G1、G2/M期的肝细胞比例显著降低（P<0.05）。这一实验结果说明CCl4可将BRL大鼠肝细胞大部分阻滞于sub-G1期，起到诱导细胞凋亡的作用，此结果与WU等[26]的研究结果一致。与模型组相比，0.4、0.8、1.6 mg/mL的地参游离酚预处理后，BRL大鼠肝细胞的凋亡程度明显降低，且随着浓度的增加，处于sub-G1期的细胞比例逐渐下降（P<0.05），G0/G1、G2/M期的比例不同程度升高（P<0.05）。刘静、步犁[27-28]的研究表明，当DNA分子受损时，细胞周期会停滞在G0/G1期以便让DNA进行修复，若修复成功则进行正常分裂增殖。本研究结果表明地参游离酚能抑制细胞凋亡，使细胞阻滞在G0/G1期并能正常修复，从而发挥保护肝细胞损伤的作用。
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图 3 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤细胞周期的影响Figure 3. Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell cycle of BRL hepatocyte injured by CC14![]()
图 4 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤细胞周期分布影响的定量分析Figure 4. Quantitative analysis of the effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell cycle of BRL hepatocyte injured by CC142.3 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤TNF-α、IL-8和Caspase-3的影响
TNF-α主要由活化的单核细胞或巨噬细胞产生，其在机体中存在的水平高低与机体对应的炎症严重程度呈现出正相关的趋势，并作为体内重要的炎性因子之一，在肝损伤中发挥重要作用[29-30]。IL-8是机体内重要的中性粒细胞趋化因子，其通过激活中性粒细胞，促进胞内溶酶体活化和吞噬，进而引起局部炎症反应[31-32]。综上所述，TNF-α、IL-8两种细胞因子在体内的水平高低，可作为监测指标，较敏感地反映出体内肝脏的损伤程度。
由表1可知，与正常组相比，CCl4模型组肝细胞中TNF-α和IL-8的含量均显著升高（P<0.05），表明CCl4所致肝细胞损伤产生了大量的活性氧自由基，破坏了肝细胞内氧化还原的稳态，从而使肝细胞发生炎症反应，产生了大量炎症介质[33-34]。与模型组相比，经地参游离酚处理的大鼠肝细胞中TNF-α和IL-8的含量均有不同程度的降低（P<0.05），表明地参游离酚能够在一定程度上抑制促炎因子的表达，减轻肝损伤的炎症反应。
表 1 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤TNF-α、IL-8和Caspase-3的影响Table 1. Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on TNF-α、IL-8 and Caspase-3 of BRL hepatocyte injured by CC14组别 TNF-α（pg/mL） IL-8（pg/mL） Caspase-3活化程度 正常组 20.42±1.13a 23.18±0.30a 0.88±0.17a CCl4模型组 39.94±1.79d 32.89±0.22d 1.28±0.15c 0.4 mg/mL地参游离酚干预组 33.12±1.90c 27.04±0.14c 1.06±0.04ab 0.8 mg/mL地参游离酚干预组 30.15±1.79c 25.55±0.60b 1.03±0.04ab 1.6 mg/mL地参游离酚干预组 24.63±1.79b 25.06±0.65b 1.07±0.05b 注：同列不同字母表示不同组别间差异显著（P<0.05）。 Caspase-3是Caspase家族的核心酵素（一类天冬氨酸或半胱氨酸蛋白酶），被称为“死亡蛋白酶”。在细胞降解过程中，Caspase-3活化后，对应的细胞质、细胞核及细胞骨架的重要蛋白质会呈现出降解失活的状态，从而导致细胞凋亡[35]。因此，Caspase-3的活化程度可以从侧面反映出细胞的凋亡水平。
由表1可知，与正常组相比，CCl4模型组肝细胞中Caspase-3活化程度增加了44.95%（P<0.05），表明CCl4作用于肝细胞后，通过脂质过氧化等途径激活了Caspase-3，使其在肝细胞中广泛表达，从而导致肝细胞凋亡[36-37]。与模型组相比，0.4、0.8、1.6 mg/mL地参游离酚组Caspase-3活化程度分别减少了17.03%、19.69%和16.37%（P<0.05）。表明地参游离酚可降低Caspase-3的活化程度，抑制凋亡级联反应。
2.4 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤COX-2、iNOS和IL-6蛋白表达水平的影响
由图5可以看出，正常组细胞质呈浅蓝色，而模型组细胞质呈浅棕或棕褐色，表明CCl4诱导损伤的肝细胞中COX-2、iNOS、IL-6蛋白表达不同程度的增加。与模型组相比，随着地参游离酚处理浓度的升高，细胞质阳性染色深度逐渐下降，表明细胞中的COX-2、iNOS、IL-6蛋白含量随地参游离酚浓度的升高而逐渐降低。定量分析结果（图6）进一步表明，与正常组相比，CCl4模型组肝细胞中COX-2、iNOS、IL-6蛋白表达显著增高（P<0.05）。与模型组相比，地参游离酚不同剂量干预组均能够不同程度降低细胞中由CCl4所致的COX-2、iNOS蛋白表达的升高（P<0.05）；0.8和1.6 mg/mL地参游离酚干预组能显著降低IL-6蛋白的表达（P<0.05）。总体而言，研究结果表明，机体发生炎症反应或氧化应激时，促炎性酶COX-2，iNOS及致炎性因子IL-6等的表达显著升高。地参游离酚预处理后，肝细胞中COX-2、iNOS、IL-6蛋白表达不同程度降低，表明地参游离酚可抑制炎症反应，发挥对CCl4所致肝细胞损伤的保护作用。
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图 5 地参游离酚对BRL大鼠肝细胞损伤COX-2、iNOS、IL-6表达水平的影响（400×）Figure 5. Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on expression levels of COX-2, iNOS and IL-6 of BRL hepatocyte injured by CC14（400×）![]()
图 6 COX-2、iNOS、IL-6表达水平的定量分析结果注：不同字母表示不同组别之间差异显著（P<0.05）。Figure 6. Quantitative analysis results of COX-2, iNOS and IL-63. 结论
地参游离酚能显著降低CCl4引起的细胞凋亡，通过减少sub-G1期细胞、增加G0/G1期、G2/M期细胞影响细胞周期的分布，并显著降低炎症因子TNF-α、IL-8的含量及阻滞Caspase-3的活化程度，且不同程度降低COX-2、iNOS和IL-6蛋白的表达水平，从而发挥肝细胞损伤的保护作用。其机制可能与炎症信号转导有关，今后可深入揭示地参游离酚对肝损伤保护作用的抗炎分子机制。研究结果初步表明，地参游离酚可用于肝脏炎性疾病的预防，可为天然抗炎护肝药物的研发和临床应用提供借鉴，同时为地参的开发和利用开拓了新的方向。
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图 1 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤细胞凋亡的影响
注：a：正常组；b：模型组；c~e：分别为0.4、0.8和1.6 mg/mL地参游离酚干预组；图3、图5同。
Figure 1. Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell apoptosis of BRL hepatocyte injured by CC14
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图 2 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤细胞凋亡影响的定量分析
注：1：正常组；2：模型组；3~5：分别是浓度为0.4、0.8和1.6 mg/mL的地参游离酚干预组；图4、图6同。
Figure 2. Quantitative analysis of the effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell apoptosis of BRL hepatocyte injured by CC14
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图 3 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤细胞周期的影响
Figure 3. Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell cycle of BRL hepatocyte injured by CC14
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图 4 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤细胞周期分布影响的定量分析
Figure 4. Quantitative analysis of the effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell cycle of BRL hepatocyte injured by CC14
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图 5 地参游离酚对BRL大鼠肝细胞损伤COX-2、iNOS、IL-6表达水平的影响（400×）
Figure 5. Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on expression levels of COX-2, iNOS and IL-6 of BRL hepatocyte injured by CC14（400×）
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图 6 COX-2、iNOS、IL-6表达水平的定量分析结果
注：不同字母表示不同组别之间差异显著（P<0.05）。
Figure 6. Quantitative analysis results of COX-2, iNOS and IL-6
表 1 地参游离酚对CCl4所致BRL大鼠肝细胞损伤TNF-α、IL-8和Caspase-3的影响
Table 1 Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on TNF-α、IL-8 and Caspase-3 of BRL hepatocyte injured by CC14
组别 TNF-α（pg/mL） IL-8（pg/mL） Caspase-3活化程度 正常组 20.42±1.13a 23.18±0.30a 0.88±0.17a CCl4模型组 39.94±1.79d 32.89±0.22d 1.28±0.15c 0.4 mg/mL地参游离酚干预组 33.12±1.90c 27.04±0.14c 1.06±0.04ab 0.8 mg/mL地参游离酚干预组 30.15±1.79c 25.55±0.60b 1.03±0.04ab 1.6 mg/mL地参游离酚干预组 24.63±1.79b 25.06±0.65b 1.07±0.05b 注：同列不同字母表示不同组别间差异显著（P<0.05）。 
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