Extraction and Detection Method of Lutein Ester in Bakery Food
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摘要: 为检测烘焙类食品中的叶黄素酯以及筛选无乙醚的萃取溶剂，本文对烘焙产品中的叶黄素酯皂化时间、KOH浓度以及不同萃取溶剂的萃取效果进行研究。结果表明检测烘焙食品中叶黄素酯的皂化最优条件为：2 g样品（面糊/面团），0.2 g BHT，10 mL无水乙醇，10 mL 60 g/100 mL KOH水溶液，室温振荡3 h。萃取溶剂环己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2为最佳萃取剂，回收率为94.31%~103.83%，精密度实验相对标准偏差均小于5%。表明该方法适合于烘焙类食品中叶黄素酯的提取及检测。Abstract: In order to detect the lutein esters in bakery products and select the extraction solvents without ether, this paper studied the saponification time, KOH concentration of lutein esters in bakery products, and the extraction effect of different extraction solvents. The results showed that the optimal conditions for detecting saponification of lutein esters in baked food were: 2 g sample (batter/dough), 0.2 g BHT, 10 mL absolute ethanol, 10 mL 60 g/100 mL KOH aqueous solution, shook at room temperature for 3 h. The extraction solvent cyclohexane:n-hexane:ethyl acetate=1:2:2 was the best extractant, the recovery rate was 94.31%~103.83%, and the relative standard deviation of the precision experiment was less than 5%. These indicated that the method was suitable for the extraction and detection of lutein esters in baked food.
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Keywords:
- lutein esters /
- high performance liquid chromatography /
- bakery food /
- detection /
- saponification
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叶黄素酯，一种由游离叶黄素和脂肪酸酯化形成的脂溶性类胡萝卜素脂肪酸酯[1-2]，存在于蔬菜、水果、谷物[3]、微藻中[4]，主要来源于万寿菊[5-6]，是叶黄素在自然界中的主要存在形式 [7], 在日光照射、强酸和高温环境下降解速率小于叶黄素，在中性和碱性条件下较为稳定[8-9]。研究发现增加游离叶黄素和叶黄素酯的摄入能够预防老年性黄斑褐变（Age-related Macular Degeneration, AMD）[10]，游离叶黄素和叶黄素酯均能显著提高血清叶黄素浓度和黄斑色素光密度（Macular Pigment Optical Density, MPOD），两者之间无明显差异，被认为是有效的叶黄素补充剂[11]，而且叶黄素酯分解得到的叶黄素其生物利用率优于游离叶黄素[12]。2008年，国家卫生部批准叶黄素酯为功能性新资源食品，已经应用于曲奇饼干、蛋糕、酸奶、压片糖果等食品的加工[13-16]。
万寿菊中叶黄素酯的提取方法包括有机溶剂提取、微波提取、超声辅助提取、酶辅助提取、超临界提取和亚临界提取等，其中最常用的是有机溶剂提取法[17-20]。天然叶黄素酯种类较多，在进行定量分析时，一般以全反式叶黄素的含量表示，因此需进行碱皂化前处理，将叶黄素酯皂化成叶黄素[21-23]。目前食品中叶黄素的提取检测采用GB 5009.248-2016《食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定》法，而添加到烘焙食品中的叶黄素酯需要将食品中的油脂和叶黄素酯皂化，国标中没有推荐方法，因此有必要研究皂化条件。此外，国标采用的叶黄素萃取溶剂体系有乙醚，属于受到严格安全管理的易制爆危险化学品，销售、储存和使用要求高。本文以烘焙食品为实际体系，对食品中的叶黄素酯和油脂进行皂化条件研究，另筛选不含乙醚的叶黄素萃取溶剂体系，为高效、低成本地提取叶黄素奠定一定的理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
叶黄素酯浸膏 河北晨光生物科技集团股份有限公司；低筋蛋糕粉 新良面粉公司；鸡蛋 北京德青源公司；烘焙细砂糖 结晶糖粉，广州华糖食品有限公司；Crisco人造黄油 美国J. M. Smucker公司；无碘食用盐 中盐集团；碳酸氢钠 食品级，上海枫未实业有限公司；碳酸氢铵 食品级，海祥食品有限公司；双效泡打粉 北京古松食品有限公司；氢氧化钾 分析纯，福晨（天津）化学试剂公司；2, 6-二叔丁基对甲酚（BHT） 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、甲基叔丁基醚、甲醇、环己烷、正己烷 色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司；乙醚 分析纯，北京迈瑞达科技有限公司；乙酸乙酯、丙酮 分析纯，福晨（天津）化学试剂公司；叶黄素标准品 97%纯度，美国Chromadex公司。
HM600和面机 海氏Hauswirt公司；打蛋器 千团精工厨具（浙江）公司；KB5010振荡器 其林贝尔仪器制造有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣公司生化仪器厂；ME203E分析天平 德国赛多利斯公司；TDZ4-WS离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；W2695高效液相色谱 配有二极管阵列检测器，美国Waters公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
蛋糕制备工艺：参考El-Sayed M[24]玛芬蛋糕的制作并做修改，将90 g全蛋液低速打散，加入含有叶黄素酯的黄油中；加入70 g糖和1 g盐；加30 g水；加130 g低筋蛋糕粉和4 g泡打粉，用刮刀翻拌；再放入到和面机中，第4挡搅拌5 min，第5挡搅拌10 min，制成面糊。
蛋卷制备工艺：借鉴《焙烤食品工艺》[25]，将165 g人造黄油软化，与0.06 g叶黄素酯浸膏混合；180 g全蛋液和2 g盐、90 g细砂糖混合加入油脂中；加入110 g低筋蛋糕粉搅匀；再放入到和面机中，第4挡搅拌5 min，第5挡搅拌10 min，制成面糊。
饼干制备工艺：参考Zou等[26]酥性饼干的制作并修改，称取0.05 g叶黄素酯浸膏与软化后的20 g人造黄油混匀；将30 g细砂糖、1 g盐、0.8 g碳酸氢钠、0.4 g碳酸氢铵放入16 g水中搅拌；相互混匀，与70 g低筋魔堡蛋糕粉混合制成面团，用刮刀翻拌直至颜色均匀分布在面团中。
1.2.2 叶黄素酯浸膏中的叶黄素组成分析
叶黄素酯浸膏溶液的配制：取一定量的叶黄素酯浸膏溶解于0.1% BHT无水乙醇中，配制0.5 mg/L叶黄素酯浸膏溶液，用0.22 μm尼龙膜过滤，进行色谱分析。
1.2.3 叶黄素酯皂化条件研究
叶黄素酯的皂化[27]：准确称取2 g样品（面糊或者面团）于50 mL离心管中，加入0.2 g BHT和10 mL无水乙醇，振荡均匀。分别加入10 mL 20、40、60 g/100 mL KOH水溶液，涡旋振荡1 min混匀，用锡纸包裹样品后在室温下分别振荡1、2、3、4 h，每个样品5次平行。
皂化后的样品加入10 mL萃取剂避光振荡5 min后，4500 r/min离心3 min，再重复提取2次，合并提取液。萃取后的样品以10 mL水洗涤，4500 r/min离心3 min分层，再重复洗涤1次，合并有机相。在水温30℃下旋转蒸发至近干，用0.1% BHT乙醇溶液润洗圆底烧瓶并振荡溶解残渣[28]，最终定容于25 mL棕色容量瓶中，过0.22 μm尼龙膜，进行色谱分析。
1.2.4 萃取溶剂筛选
吸取5 mL 0.02 g/100 mL的叶黄素酯乙醇溶液于50 mL离心管中，加入10 mL 60 g/100 mL KOH，10 mL 0.1% BHT无水乙醇，涡旋振荡1 min混匀，室温下皂化3 h，每个样品平行5次。皂化后的样品处理同1.2.3。
参照国标 [28]、孔凡华等[29] 、溶剂极性，萃取溶剂体系选取见表1。
表 1 萃取溶剂体系Table 1. Extraction solvent萃取溶剂体系 溶剂体系比例 萃取溶剂体系1 环己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2 萃取溶剂体系2 环己烷:正己烷:丙酮=2:2:1 萃取溶剂体系3 正己烷:丙酮=7:3 萃取溶剂体系4 正己烷:乙酸乙酯=7:3 1.2.5 检测方法
1.2.5.1 高效液相色谱法
HPLC-PDA条件[28]：Venusil XBP C30色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱温：30℃；流动相：甲醇/水（88/12，v/v）和甲基叔丁基醚；梯度洗脱，0~18 min，甲醇/水由100%变换至10%；18.1 min，甲醇/水由10%变换至100%，保留10 min；流速：1.0 mL/min；检测波长：445 nm；进样量：50 μL。
1.2.5.2 叶黄素酯含量测定
(1) 式中，X表示样品中叶黄素酯的含量，μg/g；m表示样品重量，g；c表示由标准曲线而得的样液中标准品的含量，μg/mL；V表示样品最终定容体积，mL；F表示校正系数。用液相色谱分析试样溶液,将反式叶黄素与异构体的色谱峰面积加合作为总峰面积，其中反式叶黄素峰面积除以总峰面积所得值为校正系数。本研究中叶黄素酯含量以总叶黄素计。
1.2.5.3 叶黄素标准曲线
准确称取5 mg叶黄素标准品，以0.1% BHT乙醇溶液溶解并定容于25 mL棕色容量瓶，配制200 μg/mL标准溶液。母液避光储藏于−80℃冰箱。从母液200 μg/mL中移取100、250、500、750、1000、1250、1500 μL溶液至10 mL棕色容量瓶中，用0.1% BHT乙醇溶液定容，得到浓度依次为2、5、10 、15 、20 、25 、30 μg/mL的标准液。将不同浓度的叶黄素标准液用0.22 μm尼龙膜过滤，进行色谱分析。以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制叶黄素的标准曲线。
1.2.6 方法的评价
分别向50 mL离心管中加入2 mL 30、60、90 μg/mL叶黄素标品，用10 mL去离子水代替上述60 g/100 mL KOH，加入10 mL 0.1% BHT无水乙醇后，漩涡振荡1 min混匀，用1.2.4筛选出的萃取溶剂体系进行加标回收。在水温30 ℃下旋转蒸发近干，用0.1% BHT乙醇溶液润洗圆底烧瓶并振荡溶解残渣，最终定容于10 mL棕色容量瓶，每个实验平行3组。
1.3 数据处理
用SPSS软件对数据进行分析，在数据满足正态分布的前提下用单因素方差分析叶黄素酯含量，P<0.05，认为具有显著性差异。
2. 结果与讨论
2.1 叶黄素酯的皂化条件优化及组成分析
用20、40、60 g/100 mL KOH水溶液分别在室温下进行1、2、3、4 h皂化振荡，得到的叶黄素含量曲线如图1所示。由图1得知，1~4 h 60 g/100 mL KOH皂化下蛋糕面糊、蛋卷面糊和饼干面团中皂化出来的叶黄素含量趋于平稳。
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图 1 不同皂化条件下蛋糕面糊（a）、蛋卷面糊（b）、饼干面团（c）中叶黄素的含量Figure 1. Lutein content in cake batter （a）, egg roll batter （b） and biscuit dough （c） in different saponification conditions图2为20 g/100 mL KOH皂化后从蛋糕面糊、蛋卷面糊和饼干面团提取的叶黄素乙醇溶液照片，此条件下提取出来的叶黄素乙醇溶液中含有白色的絮状析出物。油脂（如棕榈油、柴油）不能在乙醇中均匀分散，溶解性差，因此推测白色絮状物质为未皂化的油脂[31]。随着时间的推移，白色絮状物质逐渐减少，可以推断出对于本研究的样品，KOH皂化焙烤样品中的油脂和叶黄素酯是同时进行的，但是水解油脂速率大于叶黄素酯。在图1中40 g/100 mL KOH条件下叶黄素含量呈上升趋势，因为碱液浓度的提升加快了KOH与油脂、叶黄素酯碰撞的概率。当皂化条件为60 g/100 mL KOH、3 h时叶黄素的含量达到最大值，之后趋于平稳。
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图 2 20 g/100 mL KOH皂化后从蛋糕面糊（a）、蛋卷面糊（b）和饼干面团（c）提取的叶黄素乙醇溶液图注：图片中的溶液从左到右依次为1、2、3、4 h。Figure 2. Lutein ethanol solutions extracted from cake batter （a）, egg roll batter （b） and biscuit dough （c） after 20 g/100 mL KOH saponification从图3（A）可以看出，谱图主要有4种峰，其中d峰是溶剂中的BHT，用于阻碍叶黄素酯和皂化出来的叶黄素在操作中的氧化[32]。与标准反式叶黄素的色谱图对比，确定a峰为反式叶黄素。叶黄素酯分为单酯和二酯，种类较多，其中含量最多的为叶黄素二棕榈酸酯，与叶黄素二棕榈酸酯标准品的色谱图对比，确定c中含有大量的叶黄素二棕榈酸酯，则推断c峰为叶黄素二酯。
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图 3 叶黄素酯浸膏（A）、叶黄素二棕榈酸酯标准品（B）、叶黄素标准品（C）、0.1% BHT乙醇溶剂（D）色谱图Figure 3. HPLC chromatogram of lutein ester extract（A）, lutein dipalmitate standard（B）, lutein standard（C）, 0.1% BHT ethanol solvent（D）图4为用60 g/100 mL KOH皂化3 h后蛋糕面糊、蛋卷面糊和饼干面团中叶黄素酯的液相谱图。由图4可以看出，此皂化条件下的液相色谱图上只有反式叶黄素和其异构体[33]，叶黄素酯皂化完全，说明60 g/100 mL KOH 室温振荡3 h，叶黄素酯全部从油中分离且皂化完全。此外，皂化之后，图4（A）中的b、c峰消失，a峰面积增加，则推断b峰为叶黄素单酯[34]。刘春菊等[35]报道发酵面包中皂化叶黄素酯条件为160 mL 40 g/100 g KOH溶液条件下60 ℃回流皂化3 h，在60 ℃ 3 h的皂化过程中，温度可能会对叶黄素造成损失。本方法利用振荡器可以同时皂化更多的样品，耗能低，操作简便，而且有研究证明，影响叶黄素的稳定性因素温度>pH[36]，因此本方法采用室温、高浓度碱的方法进行皂化。
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图 4 用60 g/100 mL KOH皂化3 h后蛋糕面糊（A）、蛋卷面糊（B）和饼干面团（C）中叶黄素酯的液相谱图Figure 4. HPLC chromatogram of lutein esters in cake batter （A）, egg roll batter （B） and biscuit dough （C） after saponification with 60 g/100 mL KOH for 3 h2.2 萃取溶剂体系的效果分析
所选萃取溶剂体系的效果如表2，其中萃取溶剂体系3的提取效果最差，萃取溶剂体系1、2、4无显著性差异。
表 2 不同萃取溶剂体系萃取效果Table 2. Extraction effect of different extraction solvent systems萃取溶剂体系 叶黄素含量（μg/mL） 萃取剂1 环己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2 25.31a 萃取剂2 环己烷:正己烷:丙酮=2:2:1 25.50a 萃取剂3 正己烷:丙酮=7:3 24.05b 萃取剂4 正己烷:乙酸乙酯=7:3 25.13ab 注：同列不同字母表示各萃取溶剂体系之间存在显著性差异（P<0.05）。 在萃取过程中，尤其是第二次萃取时（图5），含丙酮组试剂出现明显的三层分层，且中间层颜色较深。对中间层试剂单独处理，进行1.2.3中的去离子水润洗步骤中发现二者不分层，而丙酮与水任意比例互溶，猜测其为丙酮。考虑其中含有一定量的叶黄素，为避免误差，用正己烷进行重复提取，合并有机相。
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图 5 不同萃取剂第二次萃取时效果图Figure 5. Effect diagram of different extractants during the second extraction因丙酮组萃取过程繁琐，萃取剂1和2无明显差异，乙醚的沸点为34.5 ℃，乙酸乙酯的沸点为73.94 ℃，属于低毒性化学品，通过表3对比萃取剂成本，萃取溶剂1成本最低。综上，选择萃取剂1为最佳萃取剂。
表 3 萃取溶剂成本对比Table 3. Comparison of extraction solvent cost萃取溶剂体系 单位成本
（元/L）相对国标价格比率
（%）萃取剂1 环己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2 46.6 27.6 萃取剂2 环己烷:正己烷:丙酮=2:2:1 137 81.1 国标萃取剂 环己烷:正己烷:乙醚=1:2:2 169 100 2.3 方法线性范围、检出限
如图6所示，叶黄素在0~30 μg/mL范围内线性关系良好，线性方程为y=174.31x−15.898，相关系数R2=1。根据检出限为信噪比S/N=3时的浓度，得到此方法的检出限为0.5 μg/mL。国标方法食品中叶黄素的检出限为3 μg/100 g，经公式（1）换算，检出限为0.012F μg/mL（F为校正系数，反式叶黄素峰面积除以总峰面积所得值为校正系数，0<F<1），色谱条件相同，但检出限存在差异，推测其误差可能为HPLC仪器型号的不同，以及仪器在工作过程中产生的噪音不同。检出限不但与仪器噪音有关，还与样品在处理过程中的每一个环节有关。
2.4 方法回收率和精密度
如表4所示，用环己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2提取回收，叶黄素回收率为94.31%~103.83%，相对标准偏差均小于5%（1.78%~4.08%）。
表 4 叶黄素加标回收和方法精密度结果Table 4. Lutein spiked recovery and method precision results编号 加入浓度（μg/mL） 加入量（mL） 测得浓度（μg/mL） 回收率（%） 相对标准偏差（%） 1 30.0 2.0 5.77 96.18 2.96 2 30.0 2.0 6.12 102.01 3 30.0 2.0 5.98 99.72 4 30.0 2.0 6.17 102.78 5 60.0 2.0 11.99 99.91 1.78 6 60.0 2.0 12.08 100.63 7 60.0 2.0 12.32 102.69 8 60.0 2.0 12.46 103.83 9 90.0 2.0 17.34 96.31 4.08 10 90.0 2.0 18.65 103.61 11 90.0 2.0 16.97 98.00 12 90.0 2.0 17.64 94.31 3. 结论
通过对烘焙食品中叶黄素酯的皂化条件进行研究，得到最佳皂化时间为3 h，KOH水溶液浓度为60 g/100 mL。此外，通过对比不同萃取溶剂的萃取效果显示，环己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2萃取效果较佳，单位萃取剂成本比国标降低了72.4%，该方法精密度实验的相对标准偏差均小于5%，回收率为94.31%~103.83%，表明该方法准确度较高。
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图 1 不同皂化条件下蛋糕面糊（a）、蛋卷面糊（b）、饼干面团（c）中叶黄素的含量
Figure 1. Lutein content in cake batter （a）, egg roll batter （b） and biscuit dough （c） in different saponification conditions
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图 2 20 g/100 mL KOH皂化后从蛋糕面糊（a）、蛋卷面糊（b）和饼干面团（c）提取的叶黄素乙醇溶液图
注：图片中的溶液从左到右依次为1、2、3、4 h。
Figure 2. Lutein ethanol solutions extracted from cake batter （a）, egg roll batter （b） and biscuit dough （c） after 20 g/100 mL KOH saponification
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图 3 叶黄素酯浸膏（A）、叶黄素二棕榈酸酯标准品（B）、叶黄素标准品（C）、0.1% BHT乙醇溶剂（D）色谱图
Figure 3. HPLC chromatogram of lutein ester extract（A）, lutein dipalmitate standard（B）, lutein standard（C）, 0.1% BHT ethanol solvent（D）
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图 4 用60 g/100 mL KOH皂化3 h后蛋糕面糊（A）、蛋卷面糊（B）和饼干面团（C）中叶黄素酯的液相谱图
Figure 4. HPLC chromatogram of lutein esters in cake batter （A）, egg roll batter （B） and biscuit dough （C） after saponification with 60 g/100 mL KOH for 3 h
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图 5 不同萃取剂第二次萃取时效果图
Figure 5. Effect diagram of different extractants during the second extraction
表 1 萃取溶剂体系
Table 1 Extraction solvent
萃取溶剂体系 溶剂体系比例 萃取溶剂体系1 环己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2 萃取溶剂体系2 环己烷:正己烷:丙酮=2:2:1 萃取溶剂体系3 正己烷:丙酮=7:3 萃取溶剂体系4 正己烷:乙酸乙酯=7:3 
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表 2 不同萃取溶剂体系萃取效果
Table 2 Extraction effect of different extraction solvent systems
萃取溶剂体系 叶黄素含量（μg/mL） 萃取剂1 环己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2 25.31a 萃取剂2 环己烷:正己烷:丙酮=2:2:1 25.50a 萃取剂3 正己烷:丙酮=7:3 24.05b 萃取剂4 正己烷:乙酸乙酯=7:3 25.13ab 注：同列不同字母表示各萃取溶剂体系之间存在显著性差异（P<0.05）。
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表 3 萃取溶剂成本对比
Table 3 Comparison of extraction solvent cost
萃取溶剂体系 单位成本
（元/L）相对国标价格比率
（%）萃取剂1 环己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2 46.6 27.6 萃取剂2 环己烷:正己烷:丙酮=2:2:1 137 81.1 国标萃取剂 环己烷:正己烷:乙醚=1:2:2 169 100
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表 4 叶黄素加标回收和方法精密度结果
Table 4 Lutein spiked recovery and method precision results
编号 加入浓度（μg/mL） 加入量（mL） 测得浓度（μg/mL） 回收率（%） 相对标准偏差（%） 1 30.0 2.0 5.77 96.18 2.96 2 30.0 2.0 6.12 102.01 3 30.0 2.0 5.98 99.72 4 30.0 2.0 6.17 102.78 5 60.0 2.0 11.99 99.91 1.78 6 60.0 2.0 12.08 100.63 7 60.0 2.0 12.32 102.69 8 60.0 2.0 12.46 103.83 9 90.0 2.0 17.34 96.31 4.08 10 90.0 2.0 18.65 103.61 11 90.0 2.0 16.97 98.00 12 90.0 2.0 17.64 94.31
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