Study on Bacteriostasis of Purple Potato Anthocyanin and Its Fresh-keeping Effect on Strawberry
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摘要: 为研究紫色马铃薯花青素的抑菌性及其对草莓保鲜的作用,考察了紫色马铃薯花青素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉菌和酵母菌的抑菌能力、最低抑菌浓度和紫色马铃薯花青素与山梨酸钾、对羟基苯甲酸乙酯及其混合液的抑菌效果；测定紫色马铃薯花青素对室温贮藏条件下的草莓失重率、腐败率、可溶性固形物含量和菌落总数的影响。结果表明：紫色马铃薯花青素的抑菌能力为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>青霉菌>酵母菌；对四种菌的最低抑菌浓度分别为5.625、11.25、22.5和45 mg/mL。25 mg/mL紫色马铃薯花青素+0.5 μg/mL对羟基苯甲酸乙酯混合液处理组草莓的失重率、腐败率显著低于对照CK（P<0.05），可溶性固形物含量显著高于对照CK（P<0.05），菌落总数极显著低于对照CK（P<0.0001）。保鲜能力为对羟基苯甲酸乙酯+花青素>对羟基苯甲酸乙酯>花青素>对照。综上，紫色马铃薯花青素具有一定的抑菌和保鲜效果，但效果差于对羟基苯甲酸乙酯，与其联合使用效果最佳。Abstract: In order to study the bacteriostasis of purple potato anthocyanin and its effect on strawberry fresh-keeping, the bacteriostasis of purple potato anthocyanin to Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Penicillium and yeast, the lowest bacteriostasis concentration and the bacteriostasis of purple potato anthocyanin to potassium sorbate, ethylparaben were analyzed; the effects of purple potato anthocyanin on the weight loss rate, spoilage rate, soluble solid content and total number of colony of strawberry stored at room temperature were determined. The results showed that the antibacterial ability of purple potato anthocyanin was Staphylococcus aureus>E.coli>Penicillium>yeast; the minimum inhibitory concentrations for the four bacterias were 5.625, 11.25, 22.5 and 45 mg/mL, respectively. The weight loss and spoilage rate of strawberries in the 25 mg/mL purple potato anthocyanin+0.5 μg/mL ethylparaben treatment group were significantly lower than those of the control CK(P<0.05), and the soluble solid content was significantly higher than that of the control CK(P<0.05), the total number of colonies was extremely significantly lower than the control CK(P<0.0001). The fresh-keeping ability was ethylparaben+anthocyanins>ethylparaben>anthocyanins>control. In summary, the purple potato anthocyanin had certain antibacterial and fresh-keeping effects, but the effect was worse than that of ethylparaben, and the combination with it had the best effect.
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Keywords:
- purple potato /
- anthocyanin /
- antibacterial /
- strawberry /
- fresh-keeping
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花青素是存在于植物中的水溶性黄酮多酚类化合物[1-2]，可以起到抑菌、防突变、降血糖等作用[3]，广泛应用于医药保健品和食品、化妆品中[4-5]。紫色马铃薯种植技术成熟，在我国的马铃薯主、次产区都有种植，产量大，其块茎富含花青素，提取花青素具有来源丰富，生产成本低等优点[6]，具有较好的开发前景。戴妙妙等[7]发现紫娟茶中花青素对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌能力。陈婵等[8]报道紫甘薯原花青素对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，但是目前对紫色马铃薯花青素抑菌性和防腐性方面的报道较少。
关于草莓保鲜，目前广泛应用化学和生物保鲜法，孙娜等[9]对五叶草莓保鲜性研究发现，采用1%壳聚糖处理保鲜效果最好，赵亚珠等[10]用百里香精油制备抗菌纸箱储藏草莓，能较好保持草莓的感官品质。本试验研究紫色马铃薯花青素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉菌菌和酵母菌的抑菌性，并对紫色马铃薯花青素与对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸钾单独和结合使用的抑菌效果对比。同时对紫色马铃薯花青素对草莓的保鲜性能进行了探讨，以期为紫色马铃薯花青素作为生物抑菌剂和保鲜剂的开发提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
紫色马铃薯“黑美人” 采收于内蒙古武川县；草莓 采摘于呼和浩特讨思浩种植大棚；LB培养基、PDA培养基、醋酸、氯化钾、醋酸钠、无水乙醇、磷酸、乙酸乙酯、磷酸二氢钠、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸钾 均为分析纯，内蒙古爱尔法生物科技公司；大肠杆菌、酵母菌、青霉菌和金黄色葡萄球菌 呼和浩特职业学院生化实验室提供。
H/716M高速台式离心机机 湖南赫西仪器公司；HWS-24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-ID超净工作台 天津科赛特实验室设备有限公司；WZS20折光仪 上海圣科仪器设备有限公司；YXQ-LS-75SII立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DPX-9272生化培养箱 上海福玛实验设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 紫色马铃薯花青素的提取
取紫色马铃薯用自来水冲洗干净削去表皮，切成薄片，干燥至恒重，打碎成粉末，过滤，收集筛下物。参照李玲等[11]的方法提取花青素，适当进行调整。称取10 g紫色马铃薯粉末放于圆底蒸馏烧瓶与一定体积的1%酸化乙醇提取液按照液料比为20:1（mL/g）混匀，提取温度65 ℃、超声功率300 W条件下浸提。获得的浸提液4500 r/min离心，萃取、蒸发、浓缩、真空干燥后得花青素提取物[12]，配制成55、45、35、25、22.5、15、11.25、5.625、2.8125、1.40625 mg/mL待用。
1.2.2 抑菌试验
1.2.2.1 菌悬液的制备
将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌转接至LB固体培养基表面，放置于培养箱中37 ℃培养24～36 h[13]；青霉菌和酵母菌接种于PDA培养基28 ℃培养48 h；活化后将上述供试菌接种在相应的液体培养基中，恒温振荡培养10～24 h左右[14]。调整各种菌悬液浓度为105 CFU/mL待用。以下各处理均进行3次重复。
1.2.2.2 紫色马铃薯花青素的抑菌性
通过滤纸扩散法形成的抑菌区域直径大小来评估紫色马铃薯花青素的抑菌效果。取上述菌悬液0.01 mL接种于各培养基平板上[15]；将滤纸打成直径6 mm圆形小片，置洁净小盒内高压灭菌，待其干燥后分别放入浓度为15、25、35、45和55 mg/mL的紫色马铃薯花青素溶液中浸泡20 min，沥干放入上述接菌培养板上，倒置培养箱内37 ℃恒温培养24 h，测量每种处理抑菌区域直径[1]。
1.2.2.3 最低抑菌浓度（MlC）
采用二倍稀释法，配制紫色马铃薯花青素水溶液，浓度分别为45、22.5、11.25、5.625、2.8125、1.40625 mg/mL，把灭菌后的滤纸片放入其中浸泡20 min，沥干放入1.2.2.2各接菌培养板上，37 ℃恒温培养24 h后，测量每种处理抑菌区域直径。判断依据是无抑菌圈出现的最低浓度为紫色马铃薯花青素的最低抑菌浓度[16]。
1.2.2.4 紫色马铃薯花青素与对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸钾单独和结合使用的抑菌效果对比
将高压蒸汽灭菌的滤纸片分别浸泡于25 mg/mL的紫色马铃薯花青素溶液、25 mg/mL的紫色马铃薯花青素+0.5 μg/mL对羟基苯甲酸乙酯溶液（体积比1:1）、25 mg/mL的紫色马铃薯花青素+5 μg/mL山梨酸钾溶液（体积比1:1）、0.5 μg/mL对羟基苯甲酸乙酯溶液、5 μg/mL山梨酸钾紫色马铃薯花青素溶液，浸泡20 min，沥干放入1.2.2.1各接菌培养板上，测量每种处理抑菌区域直径来判断抑菌差异性。
1.2.3 紫色马铃薯花青素对草莓的保鲜性试验
1.2.3.1 草莓处理
鉴于对羟基苯甲酸乙酯是一种广谱型食品添加剂，可应用于多种类型物质的保鲜，以下实验采用对羟基苯甲酸乙酯和花青素作为保鲜剂。取成熟度一致、果型相似、无损伤新鲜草莓120个，分成4组，称重。3组草莓分别用25 mg/mL紫色马铃薯花青素溶液、0.5 μg/mL对羟基苯甲酸乙酯溶液、25 mg/mL的紫色马铃薯花青素+0.5 μg/mL对羟基苯甲酸乙酯混合液（体积比为1:1）浸泡10 min；以蒸馏水处理的一组为对照CK。各组处理后放于干净滤纸吸干水分，用厚度为0.1 mm的普通PE保鲜膜单层包装，室温（26±2 ℃）保藏[4]，每隔24 h测定以下参数，共检测5 d。所测参数均重复3次，分别取其均值。
1.2.3.2 失重率
采用称重法计算1.2.3.1中4组草莓的失重率[9]。
(1) 式中：M0为处理前的质量，g；Mi为第i天的质量，g。
1.2.3.3 腐烂率
方法参考文献[17]，草莓果肉有褐变、表面有霉斑或腐烂汁水流出判定为腐烂。统计1.2.3.1中4组草莓的腐烂率。
(2) 1.2.3.4 可溶性固形物含量（Brix值）
取1.2.3.1中4组草莓各10 g，研碎取汁用双层纱布过滤，用手持折光仪测定草莓汁不同处理条件下的Brix值。
1.2.3.5 菌落总数测定
参照GB 4789.2-2016[18]《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》的方法对1.2.3.1中4组草莓菌落总数测定。
1.3 数据处理
本实验数据统计和作图采用Excel 2010；显著性分析采用SPSS Statistics 18.0和GraphPad8软件分析。表中抑菌区直径为三次平行的均值±标准偏差，包含抑菌滤纸片直径6 mm。
2. 结果与分析
2.1 紫色马铃薯花青素对供试菌的抑菌性
2.1.1 紫色马铃薯花青素对不同供试菌的抑菌作用
从表1可以看出，紫色马铃薯花青素对供试菌的抑制效果为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>青霉菌>酵母菌。酵母菌对紫色马铃薯花青素不敏感，只有花青素溶液为高浓度时才会起作用，与陈虎[19]的研究结论一致。前三种供试菌随着紫色马铃薯花青素浓度提高,抑菌区直径都在增大，说明高浓度花青素有利于增强抑菌效果。当紫色马铃薯花青素浓度为55 mg/mL时，金黄色葡萄球菌的抑菌区直径可达到15.73 mm。
表 1 不同浓度紫色马铃薯花青素对供试菌的抑菌作用Table 1. Antibacterial effect of purple potato anthocyanins at different concentrations on the tested bacteria2.1.2 紫色马铃薯花青素对不同供试菌的最低抑菌浓度（MIC）
根据表2得到，紫色马铃薯花青素对供试四种菌的最低抑菌浓度分别为11.25、5.625、22.5和45 mg/mL。在花青素浓度为45 mg/mL时，酵母菌的抑菌区直径仅为6.27 mm，低于青霉菌的抑菌区直径8.20 mm，但两者抑菌区直径都小于10 mm，说明紫色马铃薯花青素对青霉菌和酵母菌的生长有影响，但作用效果不显著（P>0.05），再次证明酵母菌对花青素不敏感。
表 2 紫色马铃薯花青素对供试菌的最低抑菌浓度（MIC）Table 2. MIC of purple potato anthocyanin solution on the tested bacteria紫色马铃薯花青素浓度
（mg/mL）供试菌抑菌区直径（mm） 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 青霉菌 酵母菌 1.40625 / / / / 2.8125 / / / / 5.625 / 6.43±0.06 / / 11.25 6.97±0.23 10.23±0.15 / / 22.5 8.70±0.10 11.40±0.15 7.03±0.10 / 45 12.03±0.15 14.20±0.10 8.20±0.15 6.27±0.12 2.1.3 紫色马铃薯花青素与对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸钾单独和结合使用的抑菌效果对比
根据表3得出，紫色马铃薯花青素对前三种供试菌均具有抑制作用；对羟基苯甲酸乙酯和山梨酸钾对供试四种菌都有影响；当紫色马铃薯花青素分别与对羟基苯甲酸乙酯和山梨酸钾混合使用时，前三种供试菌的抑菌区直径都明显大于用单一试剂处理的抑菌区直径，说明花青素有助于增强抑菌效果，青霉菌的抑菌区直径可达到40.87 mm，增强效果最明显；酵母菌的抑菌区直径变化不明显。
表 3 紫色马铃薯花青素与对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸钾单独和结合使用抑菌效果对比Table 3. Comparison of antibacterial effects of purple potato anthocyanin, ethylparaben and potassium sorbate alone and in combination抑菌剂 供试菌抑菌区直径（mm） 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 青霉菌 酵母菌 紫色马铃薯花青素 8.53±0.15 11.37±0.15 7.21±0.23 / 紫色马铃薯花青素+对羟基苯甲酸乙酯 15.23±0.12 21.33±0.31 40.87±0.10 26.03±0.15 紫色马铃薯花青素+山梨酸钾 21.27±0.15 27.43±0.42 34.65±0.15 20.53±0.38 对羟基苯甲酸乙酯 11.73±0.06 15.43±0.21 30.12±0.15 25.93±0.25 山梨酸钾 17.23±0.64 19.03±0.87 25.97±0.16 20.67±0.15 2.2 紫色马铃薯花青素对草莓的保鲜作用
2.2.1 紫色马铃薯花青素对草莓腐烂率的影响
从图1可以看出，采用不同方式处理的草莓腐烂率有明显差异。CK从贮藏的第2 d腐烂率明显升高，腐烂率显著高于另外三组（P<0.05）。4 d后，对照草莓、花青素处理草莓、对羟基苯甲酸乙酯处理草莓、花青素和对羟基苯甲酸乙酯混合液处理草莓腐烂率分别为79.7%、70.2%、50.0%和43.1%，表明处理过的草莓腐烂率显著低于未处理草莓（P<0.05）。用紫色马铃薯花青素和对羟基苯甲酸乙酯混合处理的草莓在试验期内各阶段腐烂率显著低于花青素处理组（P<0.05）。这可能是由于花青素的强抗氧化特性影响细菌的代谢反应[20]，能抑制微生物的生长，但是紫色马铃薯花青素单独使用时对草莓腐烂率的影响小于对羟基苯甲酸乙酯。
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2.2.2 紫色马铃薯花青素对草莓失重率的影响
草莓在贮藏中由于水分的蒸发和营养物质消耗，会影响其外观品质和口感。由图2可以看出，在储藏1～5 d，各组草莓重量都有不同程度的变化。对照CK失重率上升幅度最高达到23.09%；其次是A、B和C。说明不同处理方法在一定程度上能减缓草莓果实中水分的流失。单独用花青素处理和对羟基苯甲酸乙酯处理后草莓失重率在第2、4和5 d差异不显著（P>0.05）；用花青素和对羟基苯甲酸乙酯复合处理组效果最佳，失重率显著低于其它各处理组（P<0.05）。
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图 2 不同处理对草莓贮藏失重率的影响Figure 2. Influence of different treatments on the rate of weight loss in strawberry storage2.2.3 紫色马铃薯花青素对草莓可溶性固形物含量的影响
可溶性固形物含量（Brix值）是反映果实营养价值及判断果实耐贮藏能力的重要指标[21-23]。根据图3得到，在1～5 d，所有处理组草莓Brix值都在减少，可能是果实自身呼吸作用消耗糖分而使Brix值下降[17]。花青素+对羟基苯甲酸乙酯混合处理组草莓第1 d时Brix值为19.4%，第5 d时Brix值为13.2%，降低幅度为6.2%，显著低于对羟基苯甲酸处理组和花青素处理组（P<0.05）；对照草莓的Brix值降低幅度最多达到13.4%，显著高于其它组（P<0.05）。这可能是因为保鲜剂形成的透明薄膜，抑制了草莓采后贮藏期的呼吸作用[24]，减缓Brix值下降速度，延长货架期。用花青素处理的草莓Brix高于对照CK，但低于对羟基苯甲酸乙酯处理，说明花青素在一定程度上可以抑制脱离母体的草莓果实的呼吸作用，但是单独使用效果有限。
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图 3 不同处理对草莓可溶性固形物含量的影响Figure 3. Influence of different treatments on the soluble solid content of strawberry2.2.4 紫色马铃薯花青素对草莓菌落数的影响
如图4所示,随着贮藏时间的延长，各组草莓菌落总数都出现升高趋势。其中第1 d花青素+对羟基苯甲酸乙酯混合处理的草莓菌落总数最低（3.91 lg CFU/g），花青素处理草莓菌落数（4.41 lg CFU/g）低于对照CK（4.54 lg CFU/g）,但差异不显著（P>0.05）。第2、3和5 d时，对羟基苯甲酸乙酯处理草莓菌落数显著低于对照CK（P<0.001），花青素+对羟基苯甲酸乙酯混合处理草莓菌落数极显著低于对照CK（P<0.0001），说明花青素能有效增强对羟基苯甲酸乙酯的抑菌效果。总体来看，紫色马铃薯花青素对草莓菌落数有影响，但效果差于对羟基苯甲酸乙酯和紫色马铃薯花青素+对羟基苯甲酸乙酯。
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图 4 不同处理对草莓菌落总数的影响注：**P<0.001表示差异显著；****P<0.0001表示差异极显著。Figure 4. Influence of different treatments on the total number of strawberry colonies3. 结论
本试验结果表明紫色马铃薯花青素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉菌的生长有抑制作用。对大肠杆菌杆菌和金黄色葡萄球菌的作用较好，青霉菌次之；只有花青素为高浓度时才会对酵母菌产生一定的抑制作用。紫色马铃薯花青素对四种供试菌的最低抑菌浓度（MIC）依次为11.25、5.625、22.5和45 mg/mL。25 mg/mL的紫色马铃薯花青素与对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸钾结合使用有助于增强抑菌效果，从紫色马铃薯中提取的花青素可做为安全、无毒的生物抑菌性深度开发，与化学抑菌剂协同使用，可降低化学药剂的使用剂量，应用于食品和药品中。
紫色马铃薯花青素对草莓具有一定保鲜效果。用25 mg/mL的紫色马铃薯花青素+0.5 μg/mL对羟基苯甲酸乙酯混合液处理组草莓的失重率、腐败率显著低于对照CK（P<0.05），可溶性固形物含量显著高于对照CK（P<0.05），菌落总数极显著低于对照CK（P<0.0001）。保鲜能力依次为对羟基苯甲酸乙酯+花青素>对羟基苯甲酸乙酯>花青素。说明紫色马铃薯花青素在一定程度上能抑制草莓水分的散失，减缓草莓呼吸速度，延长储藏时间，起到保鲜剂的作用，但其效果有效，与对羟基苯甲酸联合使用效果最佳。微生物安全是食品中的关键问题[25-26]。相比于化学保鲜防腐剂，花青素用作保鲜剂，天然、安全并节约成本，二者联用可为新型环保生物防腐剂的开发提供一种新思路。
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图 2 不同处理对草莓贮藏失重率的影响
Figure 2. Influence of different treatments on the rate of weight loss in strawberry storage
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图 3 不同处理对草莓可溶性固形物含量的影响
Figure 3. Influence of different treatments on the soluble solid content of strawberry
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图 4 不同处理对草莓菌落总数的影响
注：**P<0.001表示差异显著；****P<0.0001表示差异极显著。
Figure 4. Influence of different treatments on the total number of strawberry colonies
表 1 不同浓度紫色马铃薯花青素对供试菌的抑菌作用
Table 1 Antibacterial effect of purple potato anthocyanins at different concentrations on the tested bacteria
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表 2 紫色马铃薯花青素对供试菌的最低抑菌浓度（MIC）
Table 2 MIC of purple potato anthocyanin solution on the tested bacteria
紫色马铃薯花青素浓度
（mg/mL）供试菌抑菌区直径（mm） 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 青霉菌 酵母菌 1.40625 / / / / 2.8125 / / / / 5.625 / 6.43±0.06 / / 11.25 6.97±0.23 10.23±0.15 / / 22.5 8.70±0.10 11.40±0.15 7.03±0.10 / 45 12.03±0.15 14.20±0.10 8.20±0.15 6.27±0.12
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表 3 紫色马铃薯花青素与对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸钾单独和结合使用抑菌效果对比
Table 3 Comparison of antibacterial effects of purple potato anthocyanin, ethylparaben and potassium sorbate alone and in combination
抑菌剂 供试菌抑菌区直径（mm） 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 青霉菌 酵母菌 紫色马铃薯花青素 8.53±0.15 11.37±0.15 7.21±0.23 / 紫色马铃薯花青素+对羟基苯甲酸乙酯 15.23±0.12 21.33±0.31 40.87±0.10 26.03±0.15 紫色马铃薯花青素+山梨酸钾 21.27±0.15 27.43±0.42 34.65±0.15 20.53±0.38 对羟基苯甲酸乙酯 11.73±0.06 15.43±0.21 30.12±0.15 25.93±0.25 山梨酸钾 17.23±0.64 19.03±0.87 25.97±0.16 20.67±0.15
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