Preparation and Properties of Pearl Peptide Chelated Calcium
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摘要: 为提高珍珠的利用率，生产易被人体高效吸收利用的补钙剂。以珍珠粉为原料制备珍珠肽，并对其进行钙螯合处理。以螯合物得率和螯合物中钙含量为考察指标，确定珍珠肽螯合钙的最佳制备方法。采用紫外-可见吸收光谱分析（UV-vis）、傅里叶红外光谱分析（FTIR）、圆二色谱分析（CD）、X射线衍射分析（XRD）、差示扫描量热分析（DSC）和扫描电镜分析（SEM）等比较螯合前后的变化。结果表明：珍珠粉经过丙酸酸解、重复离心除杂后得到珍珠蛋白。使用地衣芽孢杆菌蛋白酶（Bacillus licheniformis proteinase, BLP）对珍珠蛋白进行酶解得到珍珠肽，最终珍珠肽螯合钙得率为27.24%±1.29%，珍珠肽螯合钙中钙含量为48.75%±1.20%。对此条件下制备的珍珠肽和珍珠肽钙螯合物进行结构分析，发现珍珠肽的氨基和羧基都参加了螯合反应，并且螯合物的二级结构由原来的无序结构向有序、紧密的结构转变，螯合物的结晶度大幅度提高并生成结构更加稳定的新物质，而且有明显的分子聚集现象。Abstract: In order to improve the utilization of pearl, calcium supplement with high bioavailability was produced. Pearl peptide was prepared from pearl powder and chelated with calcium. The preparation process was optimized based on the chelation yield and calcium content in pearl peptide chelated calcium. The changes of chelation were compared by ultraviolet-visible absorption spectroscopy (UV-vis), fourier infrared spectroscopy (FTIR), circular dichroism (CD), X-ray diffraction (XRD), difference scanning calorimetry (DSC) and scanning electron microscopy (SEM) analysis. The results showed that pearl protein was obtained from pearl powder by acid hydrolysis and repeat centrifugation. The pearl protein was hydrolyzed by Bacillus licheniformis proteinase (BLP) to obtain pearl peptide. The final yield of pearl peptide chelated calcium was 27.24%±1.29%, and the calcium content in pearl peptide chelated calcium was 48.75%±1.20%. The structure of the pearl peptide and pearl peptide chelated calcium were then analyzed. It was found that both amino and carboxyl groups of pearl peptide were involved in the chelation reaction. And the secondary structure of pearl peptide chelated calcium changed from disordered structure to ordered and compact structure. The crystallinity increased greatly and a new substance with more stable structure was formed after the chelation reaction. And a significant aggregation was occurred in calcium-chelating peptide.
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Keywords:
- pearl /
- pearl peptide /
- calcium /
- peptide chelated calcium /
- structural characterization
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钙是人体内含量最高的无机元素，涉及人体内多种生理功能。钙摄入充足可减少骨损失、预防骨质疏松和龋齿等，还可参与酶调节、凝血、调节细胞膜通透性、调节肌肉的正常活动等功能。人体内许多关键的过程如细胞增殖、激素调节及神经递质的释放等也与钙相关[1]，钙摄入不足时，将会导致许多不良反应，严重时导致疾病产生。
珍珠为贝类动物外套膜受刺激后，不断分泌珍珠质而形成的粒状体，除含有95%左右的碳酸钙和5%左右的有机质外[2]，还含有30多种常量和微量元素，其中相当一部分是人体容易缺乏而需要补充的矿物质元素[3]。珍珠的临床应用十分广泛[4]，目前已有研究发现珍珠粉具有抗氧化[5]、抗骨质疏松、促进修复骨损伤[6-7]、可用于治疗口疮[8]等能力，并有减少感染风险、促进凝血等效果。
肽钙螯合物中的多肽可在钙离子的跨膜运输中作为载体，有速度快、载体利用度高等优势，并且多肽种类决定了肠道钙吸收情况，其中降血压活性肽[9]、金属螯合活性肽[10-13]以及抗氧化活性肽[14]都有相关报道；酶水解法利用了酶的高效催化作用，在合适的条件下，通过酶水解蛋白释放多种生物活性的肽段[15]。酶水解法因反应条件温和，水解时间较短，且能够完整的保留蛋白质的营养功能，基本不破坏氨基酸，不易发生消旋现象[16]等优点，被广泛应用于蛋白质的水解。如刘凤茹[17]用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶等酶解麦胚蛋白以制备肽螯合钙。地衣芽孢杆菌可生成丰富的胞外酶系，其中一些蛋白酶能够有效地降解各种大分子物质，还能在有机溶剂中催化多肽的合成[18]。
目前，人类最普遍的钙来源是离子钙，如碳酸钙、葡萄糖酸钙及乳酸钙等[19]。然而，离子钙易在肠道中生成钙沉淀[20]，导致日常饮食中钙的吸收率和生物利用度会减弱许多。另外，钙摄入过多易对消化系统产生不良影响，如便秘、多气、胀气和腹胀等现象。关于肽螯合钙的研究有很多，例如崔宇、丁媛媛、曲航、詹萍等[21-24]分别以大豆肽、麦胚多肽、黑木耳肽、葵花籽粕复合肽为原料制备肽螯合钙，并对其生理活性和结构进行了研究，发现生成的肽螯合钙具有一定的生理活性。BAO等[25]和ZHANG等[26]发现大豆蛋白、磷光蛋白水解产物具有钙螯合能力，可以作为钙补充剂的生产原料。由于珍珠独特的形成过程，使得珍珠肽具有较强的钙螯合能力[27]，将珍珠肽与钙通过螯合得到珍珠肽螯合钙，可以在不影响其他微量元素及维生素等营养成分吸收的情况下，具有吸收快、营养性强等优点。珍珠肽螯合钙可作为一款新型钙补充剂，代表着补钙产品发展的新方向，具有很强的实用性和可行性，值得深入研究。
本研究以珍珠粉为原料，使用丙酸对珍珠粉进行酸解来提取珍珠蛋白，地衣芽孢杆菌源蛋白酶（BLP酶）对珍珠蛋白进行酶解，将处理后的酶解液进行冷冻干燥得到目标肽，在得到的珍珠肽里面加入钙源，于恰当的外界条件下进行螯合，最后用乙醇沉淀法使产物、游离钙离子及目标肽分开，得到珍珠肽螯合钙。并对珍珠肽和珍珠肽钙螯合物进行结构表征，可证明反应过程中螯合物的产生，为珍珠的深加工和利用提供了新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
珍珠粉 浙江长生鸟健康科技股份有限公司提供；地衣芽孢杆菌源蛋白酶（BLP，200 Ｕ/mg） 南宁东恒华道生物科技有限公司提供；碱性蛋白酶（Alkaline proteinase，≥200000 Ｕ/mg） 北京索莱宝科技有限公司；所用试剂 均为分析纯；实验室用水均为超纯水。
GZX-9076MBE电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司；Allegra 64k台式高速冷冻离心机 贝克曼库尔特商贸中国有限公司；MX-S旋涡混合器 北京科博赛尔科技有限公司；RE-2000A真空旋转蒸发仪 上海研承仪器有限公司；UV-265分光光度计 日本岛津公司；RE-2000A真空离心浓缩仪 上海研承仪器有限公司；BTP-3XL冷冻干燥仪 美国Virtis公司；K9840半自动凯氏定氮仪 海能仪器；Q20差示扫描量热仪 美国TA仪器有限公司；ARL X’TRA X射线衍射仪、Nicolet iS 5傅里叶红外光谱仪 赛默飞世尔科技公司；J-815圆二色光谱仪 北京国嘉恒业科学仪器有限公司； Nano nova 450扫描电子显微镜 FEI公司。
1.2 实验方法
1.2.1 珍珠蛋白提取
用蒸馏水将乙酸、丙酸、柠檬酸分别配成2 mol/L的溶液。珍珠粉/酸液按1:15（w/v）混合反应至溶液完全澄清，反应完毕后，于4 ℃ 8000 r/min离心5 min，分离上清液，用蒸馏水反复清洗沉淀，合并上清液，进行冷冻干燥，冻干结束后，及时取出样品，置于干燥容器中保存备用。珍珠蛋白含量的测定使用凯氏定氮法进行测量。
1.2.2 珍珠肽的制备
称取一定量的珍珠蛋白溶于水中，配置质量浓度为50 g/L的珍珠蛋白溶液，酶与底物按1:50的比例分别加入碱性蛋白酶、BLP酶以及上述两种酶复合（1:1），用0.1 mol/L氢氧化钠调节pH至8.0，于50 ℃恒温水浴锅水解4 h后升温至100 ℃灭酶10 min，后过滤，将得到的滤过液冻干，得到珍珠肽。珍珠肽得率按照下式计算：
式中：m1为珍珠肽质量，g；m2为珍珠蛋白质量，g。
1.2.3 珍珠肽-钙络合物的制备
配制20 mmol/L的Tris-HCl（pH7.8）溶液，将珍珠肽溶于此缓冲液中，得到浓度为20 mg/mL的溶液[28]，珍珠肽与氯化钙按1:1（g/nmol）的比例，加入适量0.2 mol/L氯化钙溶液，混匀。在恒温水浴锅中40 ℃下反应1 h。离心（8000 r/min 5 min），按上清液和无水乙醇的体积比为4:3加入无水乙醇，静置，沉淀即珍珠肽-钙络合物。螯合物得率按下式计算：
式中：M1为螯合物质量，g；M2为珍珠蛋白肽质量，g；M3为添加的钙离子的质量，g。
1.2.4 钙质量分数的测定
经醇沉得到的反应产物加适量蒸馏水于锥形瓶中溶解，同时以50 mL的蒸馏水作为对照组。用氢氧化钠调节pH到10.0，再滴入3~5滴钙红指示剂。用EDTA标准溶液缓慢滴定并不断摇晃锥形瓶，直至锥形瓶内溶液变为蓝色，记录各个样品所消耗标准溶液的体积。样品中钙含量按下式计算：
式中：40.08为钙的原子量，g/moL；c为EDTA标准溶液浓度，mol/L；V为EDTA标准液体积，mL；m为肽螯合钙质量，g。
1.2.5 紫外-可见吸收光谱分析
分别称取一定量的珍珠肽和珍珠肽-钙螯合物配置为质量浓度为1 mg/mL的样品，以蒸馏水为空白对照，测定190~550 nm范围内吸光度值的变化，波长扫描间隔2 nm，以波长与吸光度值绘制该样品的光谱曲线。
1.2.6 傅里叶红外光谱分析
将约含1%样品（珍珠肽和珍珠肽钙螯合物）的KBr粉末于玛瑙研钵中研磨、压片，采用傅里叶红外光谱仪对薄片扫描，波数范围4000~400 cm−1，扫描次数32次，分辨率4 cm−1，分别测定测量珍珠肽和珍珠肽-钙螯合物的红外光谱，结果以透光率来表示[29]。
1.2.7 圆二色谱分析
分别称取一定量的珍珠肽和珍珠肽-钙螯合物配置为质量浓度为0.1 mg/mL的溶液，进行圆二色谱分析。具体测试条件：样品池厚0.1 cm，谱带宽度1.0 nm，波长范围190~320 nm，扫速100 nm/min。
1.2.8 X射线衍射分析
分别称取一定量的珍珠肽和珍珠肽-钙螯合物制成粉末，进行X射线衍射分析，管电压40 kV，管电流40 mA，扫描角度5°~ 90°，扫描速度5 deg/min，步长0.02 deg/step。
1.2.9 差示扫描量热分析
分别称取5 mg珍珠肽及珍珠肽-钙螯合物于坩埚内，再置于仪器中，进行热稳定性分析，同时设置空白对照。温度范围为25~200 ℃，升温速度10 ℃/min，N2流速50 mL/min[30]。
1.2.10 扫描电镜分析
取珍珠肽及珍珠肽螯合钙样品均匀涂在样盘的双面胶上,喷金后放入扫描电镜内抽真空, 施加一定电压后, 在设定倍数下保存扫描图像。电镜扫描条件：高压15 kV，束流6.9×10−2 mA，工作距离16.2 mm。
1.3 数据处理
实验数据通过Origin 2019软件进行计算绘图。使用IBM公司的统计软件SPSS Statistics 25.0进行显著性检验。试验数据为三组数据平均值，以平均值±标准偏差（
2. 结果与分析
2.1 珍珠肽螯合钙的制备
采用乙酸、丙酸、柠檬酸三种酸分别对珍珠粉进行酸解来提取珍珠蛋白。由于使用柠檬酸提取珍珠蛋白的溶液底部存在较多白色固体颗粒，推测为珍珠粉残留，因此柠檬酸不适用于酸解珍珠粉。如图1（A）所示，利用乙酸、丙酸酸解珍珠粉后经离心处理，再用凯氏定氮法测定所得产物，得到珍珠蛋白平均得率分别为1.07±0.02、2.13±0.05 g/100 g，且二者珍珠蛋白得率之比约为1:2，于是最终选用丙酸来酸解珍珠粉以制备珍珠蛋白。夏静芬等[2]对珍珠粉的化学成分和结构特征进行分析，研究结果表明珍珠粉平均蛋白质含量为2.21%，与本实验结果一致。
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图 1 酸种类对珍珠蛋白（A）得率，酶种类对珍珠肽（B）、珍珠肽螯合钙（C）得率以及珍珠肽螯合钙钙含量（D）的影响注：不同小写字母表示差异性显著，P<0.05。Figure 1. Effect of acid types on the yield of pearl protein （A），effects of enzyme types on the yield of pearl peptide（B），the yield of calcium chelate of pearl peptide （C） and calcium content of pearl peptide chelate calcium（D）将得到的珍珠蛋白离心后，分别用碱性蛋白酶、BLP酶及两酶复合（1:1）使用对珍珠蛋白进行酶解，把处理后的酶解液进行冷冻干燥得到珍珠肽，按照步骤1.2.3，使珍珠肽与氯化钙螯合得到珍珠肽螯合钙。
如图1（B）所示，碱性蛋白酶、BLP酶以及上述两种酶复合（1：1）的珍珠肽平均得率分别为68.60%±8.40%、52.42%±10.00%、61.30%±4.30%。珍珠肽螯合钙平均得率如图1（C）所示，分别为17.97%±1.60%、27.24%±1.29%、22.51%±1.79%。接着使用EDTA滴定法测得珍珠肽螯合钙钙含量见图1（D），珍珠肽螯合钙中平均钙含量分别为35.53%±0.92%、48.75%±1.20%、39.86%±1.00%，可知BLP酶处理珍珠蛋白所得珍珠肽与钙螯合所得产物的钙含量相对较高，其次为两酶复合处理所得珍珠肽与钙螯合产物。
综上，结果表明，珍珠肽得率、珍珠肽螯合钙得率以及珍珠肽螯合钙钙含量有显著性差异（P<0.05）。相比较之下，BLP酶处理珍珠蛋白所得肽钙螯合物钙含量最高，这极有可能与酶对底物的作用位点相关。在BLP酶作用下，珍珠肽暴露出的基团更易与钙螯合，故使用BLP酶对珍珠蛋白进行酶解效果最优。
2.2 珍珠肽螯合钙的结构表征
2.2.1 紫外-可见吸收光谱分析
珍珠肽与珍珠肽螯合钙的溶液在190~550 nm波长范围内的扫描曲线如图2所示。从图2中可以看出，珍珠肽与珍珠肽螯合物的部分紫外吸收光谱发生了明显的改变。珍珠肽在223 nm和267 nm处具有明显的吸收峰，而珍珠肽与Ca2+螯合后，其吸收峰分别移至228 nm和270 nm处。此外，珍珠肽螯合物的吸光度与珍珠肽吸光度相比，明显升高。珍珠肽的最大吸收峰在220 nm左右，主要是由肽键中C=O的n→π*跃迁引起的[31-32]；当珍珠肽与Ca2+发生螯合反应后，Ca2+与珍珠肽中的N、O形成配位键后，影响了肽键上C=O的n→π*电子跃迁，从而使其发生红移现象。此外，珍珠肽在267 nm处的强吸收峰通常是苯丙氨酸的特征吸收峰，当其与Ca2+发生螯合反应后红移[33-34]至270 nm，这是配体N-C-O中π→π*电子跃迁所导致[35]。由此可知珍珠肽与Ca2+之间发生了相互作用，并生成了一种不同于珍珠肽的新化合物。紫外可见光谱证明了珍珠肽与Ca2+发生螯合反应并生成螯合物[36-38]。
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图 2 珍珠肽及珍珠肽螯合钙的紫外-可见吸收光谱Figure 2. UV spectra of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide2.2.2 傅里叶红外光谱分析
图3是珍珠肽和珍珠肽螯合钙在400~4000 cm−1范围内的傅里叶红外光谱图，两种物质在吸收峰强度和位置方面均发生变化，可用来证明肽钙螯合物的生成及螯合过程中发生反应的具体基团。如图3所示，珍珠肽于1665.17 cm−1处吸收峰属于酰胺Ⅰ带，是由C=O的伸缩振动引起的；1417.41 cm−1处的吸收峰属于酰胺Ⅱ带，是由C-N键的伸缩振动和N-H键的面内弯曲振动引起的；珍珠肽光谱图中3376.44 cm−1处吸收峰是由N-H伸缩振动引起的，而在珍珠肽螯合钙光谱图中，该伸缩振动吸收峰蓝移到3353.53 cm−1处，吸收峰的改变说明Ca2+与-NH2发生结合；于1690~1650 cm−1范围的特征吸收峰主要源于C=O的伸缩振动[39-40]，螯合后由原来的1665.17 cm−1移动到1661.83 cm−1处，此峰位置的改变说明羧酸基团以共价键的形式与钙离子发生了结合；-COO-羧酸盐基团的特征吸收峰从1417.41 cm−1移到1411.62 cm−1，蓝移了6个波数，表明-COOH参与了金属离子的结合形成相应的盐，类似于-COO-Ca-结构[41]；C−O单键的伸缩振动与−OH的弯曲振动引起的特征吸收峰在1100~1000 cm−1范围内，图3中1048.66 cm−1处的吸收峰来源于C-O的伸缩振动[42]，螯合后发生红移，于1094.19 cm−1处出现新吸收峰；由于螯合过程中-C-H弯曲振动，珍珠肽于900~800 cm−1范围内的吸收峰消失。傅里叶红外光谱分析结果表明N、O原子与钙形成了配位键，并参与了肽钙螯合物的形成[43-46]，该结果与刘玉玉等[47]利用FTIR研究发现白鲢鱼皮胶原蛋白肽的羧基和氨基与钙离子螯合后生成肽-钙螯合物结果趋于一致。
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图 3 珍珠肽及珍珠肽螯合钙的傅里叶红外光谱Figure 3. FTIR of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide2.2.3 圆二色光谱分析
圆二色光谱是目前应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法；多肽的圆二色谱分为190~250 nm的远紫外区和250~320 nm的近紫外区，前者范围内的主要发色基团为肽键及多肽侧链上的芳环，而在远紫外区，通常其图谱中包含一个在190 nm附近的正峰及一个在205~240 nm范围内的负峰，其中负峰的形状主要由多肽主链的结构决定[48]。对珍珠肽和珍珠肽钙螯合物的二级结构用圆二色谱仪进行分析，如图4所示，珍珠肽的圆二色光谱图在190 nm附近有一正峰，于208 nm和220 nm附近出现两个负的特征肩峰谱带；当珍珠肽与钙螯合后，珍珠肽在远紫外区205 nm 附近的负峰消失，且峰明显减弱；近紫外区260 nm、278 nm附近的正峰位置发生改变，且峰增强。综上，珍珠肽与钙离子螯合过程中，有新的离子键和共价键等产生，导致珍珠肽的二级结构发生改变，由原来的无序结构向更加有序、规则的结构转变，体现为圆二色谱中峰的位置及吸收强弱的变化。在对鸡肉蛋白肽螯合钙进行圆二色谱检测时，魏新颜[49]发现，在螯合钙离子后，240 nm处的负峰减小，两旁的肩峰也略有减小。
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图 4 珍珠肽及珍珠肽螯合钙的圆二色谱Figure 4. CD of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide2.2.4 X射线衍射分析
利用晶体形成的X射线衍射，对物质内部原子在空间分布状况的结构进行分析的一种方法。分别对珍珠肽、珍珠肽钙螯合物进行XRD分析，结果如图5所示，由图可见珍珠肽与钙离子螯合前后，X射线衍射结果发生显著的变化。珍珠肽作为有机物，仅在22°附近有一较宽的峰，且强度较低，说明珍珠肽的内部状态还较为松散，在珍珠肽和CaCl2反应后，珍珠肽钙螯合物于22°附近存在两处衍射峰，且角度较小处的峰强度远大于原珍珠肽在此处的峰强度，同时，在39°~42°也存在新的衍射峰，原峰的变化及新峰的出现说明珍珠肽与钙离子间通过共价键与离子键螯合，形成了新的产物。珍珠肽螯合钙的X射线衍射图谱具有多个典型晶型的尖锐的衍射峰，同时也存在着几个弱的弥散型衍射峰。这表明珍珠肽在螯合Ca2+之后，自身的结构发生了较大的变化，由结晶结构和无定型结构两部分组成，结晶度较螯合前有大幅度提高。同样的王俊强[50]在大豆肽钙螯合物的结合机理及其性质研究中发现，当大豆肽与CaCl2反应后，其特征衍射峰会消失，并且大豆肽于20°的衍射峰强度下降，峰宽变窄，并衍射峰向右偏移，同时出现了一个新的衍射峰。
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图 5 珍珠肽及珍珠肽螯合钙的X射线衍射Figure 5. XRD of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide2.2.5 差示扫描量热分析
扫描差示量热法是热分析的一种方法，其在程序升温的条件下，测量试样与参比物之间的能量差随温度变化，可用来分析蛋白质、核酸等的构象变化。图6是对珍珠肽和珍珠肽螯合钙进行DSC分析的图谱，由图6（A）可知，珍珠肽在119.4 ℃处有一吸热峰，主要由珍珠肽中的化学键断裂吸热导致，其键能为279.9 J/g。由图6（B）可知，在珍珠肽与钙螯合后，其吸热峰左移至108.3 ℃处，键能则变为306.5 J/g。珍珠肽与钙离子螯合后发生热变性，生成结构更稳定的新物质[51-52]，由于螯合后自然结构被改变导致了键能的升高，珍珠肽的化学键受到了钙的影响，于是可初步判断珍珠肽与钙离子发生了螯合。
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图 6 珍珠肽（A）和珍珠肽螯合钙（B）的差示扫描量热曲线Figure 6. DSC of pearl peptide（A）and calcium chelate by pearl peptide（B）2.2.6 扫描电镜分析
图7是珍珠肽及珍珠肽螯合钙的电镜扫描图，从图中可以看出，珍珠肽的微观表面光滑平整，且聚集成团；而肽钙螯合后，珍珠肽与钙离子主要通过共价键、离子键等作用形成粗糙的小颗粒聚集现象[53-54]，并可以看出一些小颗粒附着在结构表面，类似盐的结构；这是由于珍珠肽与钙螯合过程中形成了多肽螯合钙，结构发生改变并且分子量由小变大，同时在螯合过程中出现了一定量的钙晶体，并附着在螯合物表面，因此由原来的细腻变的粗糙；证明珍珠肽与钙离子螯合后生成螯合盐类物质[55]，也佐证了珍珠肽与珍珠肽螯合钙的X射线衍射结果中，珍珠肽呈无定型状态且螯合后的产物向晶体态转变的结论[56]。丁媛媛等[22]在麦胚多肽-钙螯合物研究中，通过扫描电子显微镜发现麦胚多肽之间通过钙离子连接发生交联，形成较大颗粒，而且这些颗粒之间相互吸引进而发生聚集。
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图 7 珍珠肽（A）和珍珠肽螯合钙（B）的扫描电镜图Figure 7. SEM of pearl peptide（A） and calcium chelate by pearl peptide（B）3. 结论
珍珠粉经过丙酸酸解、重复离心除杂后，使用BLP酶对珍珠蛋白进行酶解，最终珍珠肽螯合钙得率和珍珠肽螯合物中钙含量相对较高。紫外-可见吸收光谱，傅里叶红外光谱说明珍珠肽的氨基和羧基都参与了螯合反应。圆二色谱、X射线衍射分析结果表明在珍珠肽与钙离子螯合过程中，有新的离子键和共价键等产生，并且珍珠肽的二级结构发生改变。差示扫描量热和扫描电镜分析结果表明在珍珠肽螯合钙之后，珍珠肽钙螯合物的热稳定变差并且键能升高，并且微观表面由光滑平整且聚集成团变为粗糙的小颗粒聚集现象，生成类似螯合盐类物质。
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图 1 酸种类对珍珠蛋白（A）得率，酶种类对珍珠肽（B）、珍珠肽螯合钙（C）得率以及珍珠肽螯合钙钙含量（D）的影响
注：不同小写字母表示差异性显著，P<0.05。
Figure 1. Effect of acid types on the yield of pearl protein （A），effects of enzyme types on the yield of pearl peptide（B），the yield of calcium chelate of pearl peptide （C） and calcium content of pearl peptide chelate calcium（D）
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图 2 珍珠肽及珍珠肽螯合钙的紫外-可见吸收光谱
Figure 2. UV spectra of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide
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图 3 珍珠肽及珍珠肽螯合钙的傅里叶红外光谱
Figure 3. FTIR of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide
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图 4 珍珠肽及珍珠肽螯合钙的圆二色谱
Figure 4. CD of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide
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图 5 珍珠肽及珍珠肽螯合钙的X射线衍射
Figure 5. XRD of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide
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图 6 珍珠肽（A）和珍珠肽螯合钙（B）的差示扫描量热曲线
Figure 6. DSC of pearl peptide（A）and calcium chelate by pearl peptide（B）
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1. 何军波，贾庆超. 模糊数学评价结合响应面法优化黑蒜香菇酱制备工艺及抗氧化活性和储藏分析. 食品工业科技. 2023(19): 47-56 . 
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