Ultrasonic-assisted Ezymatic Hydrolysis of Peanut Protein to Prepare α-Amylase Inhibitory Peptide
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摘要: 本文以花生粕为原料，通过碱溶酸沉法提取花生蛋白，利用凯式定氮法测得其含量87.7%。继续采用超声波辅助酶法制取花生多肽，以多肽得率和α-淀粉酶抑制率为指标，考察了酶的种类、超声功率、超声时间、底物浓度、酶添加量和酶解时间等因素对α-淀粉酶抑制肽的影响，确定最优蛋白酶为风味蛋白酶，在单因素的基础上设计响应面试验对酶解条件进行优化，确定制备α-淀粉酶抑制肽最佳工艺条件为：超声功率150 W、超声时间30 min、液料比20:1 mL/g、酶添加量5000 U/g、酶解时间2 h。在此条件下多肽得率为41.92%，α-淀粉酶抑制率为50.62%，与未经过超声波辅助的花生多肽α-淀粉酶抑制率35.45%相比有显著提升。根据α-淀粉酶抑制肽最佳工艺，将蛋白酶解液超滤分级分离，得到四个不同组分>10 kDa、5~10 kDa、3~5 kDa、<3 kDa，其中<3 kDa组分分子量抑制率达到最高60.21%。利用Sephadex G-15凝胶分离纯化<3 kDa组分，得到P1、P2、P3三个组份，其中P3最高抑制率可达到73.30%。花生肽具有较好的ɑ-淀粉酶抑制效果，在开发功能性食品研究中有较大的应用价值。Abstract: In this paper, peanut protein was extracted from peanut meal by alkaline solution and acid precipitation. The content of peanut protein was 87.7% by Kjeldahl method. Peanut polypeptides were prepared by ultrasonic-assisted enzymatic method. The effects of enzyme type, ultrasonic power, ultrasonic time, substrate concentration, enzyme addition amount and enzymolysis time on α-amylase inhibitory peptide were investigated using the yield of polypeptide and α-amylase inhibition rate as indexes. The optimal protease was flavor protease. Response surface test was designed to optimize the enzymolysis conditions on the basis of single factor. The optimal conditions were determined as follows: Ultrasonic power 150 W, ultrasonic time 30 min, liquid-solid ratio 20:1 mL/g, enzyme dosage 5000 U/g, enzymolysis time 2 h. Under these conditions, the yield of polypeptide was 41.92%, and the inhibitory rate of α-amylase was 50.62%, which was significantly higher than that of peanut polypeptide α-amylase which was 35.45% without ultrasonic assistance. According to the optimal process of α-amylase inhibitory peptide, the hydrolysate was separated by ultrafiltration and obtained four different fractions >10 kDa, 5~10 kDa, 3~5 kDa and <3 kDa, among which the molecular weight inhibition rate of <3 kDa fraction reached the highest 60.21%. Sephadex G-15 gel was used to separate and purify the <3 kDa components, and three components, P1, P2 and P3 were obtained. The highest inhibition rate of P3 reached 73.30%. Peanut peptide had good α-amylase inhibitory effect and had great application value in developing functional food.
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花生粕是饲料、肥料和酿造的原料，是花生油提取后的副产品[1]。花生粕的蛋白质含量约为40%~50%，包含8种必需氨基酸，但花生蛋白质中的赖氨酸和蛋氨酸含量相对不足。与大豆蛋白相比，花生粕蛋白更易于吸收且抗营养因子较低[2]。花生粕蛋白的酶促水解不仅可以充分利用花生粕中的蛋白质，而且还可以产生具有生物活性的小肽，解决了花生蛋白必需氨基酸不足的缺陷。已有研究描述了食物来源的短链生物活性肽，其残基范围为2~20个氨基酸[3]。 除了基本营养外，还具有类似激素的生理功能[4]。这些肽可能具有多种药理或生理作用，包括抗氧化剂、抗糖尿病药和降低血压[5-7]，具体取决于氨基酸的组成及其序列。Liu等[8]从花生蛋白分离物中分离出一种血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽，其氨基酸序列为Cys-Val-Thr-Pro-Ala-Leu-Arg。Ye和Ng[9]从花生中分离出一种新型的抗真菌肽，其序列与花生过敏原Ara H1相似。在人肠中对氨基酸的吸收很差，但是分子量小于1000 Da的寡肽很容易被吸收[10]。
食物来源的生物活性肽在药理活性方面被广泛研究[11-13]。 具有特定氨基酸序列的肽在减少和维持饮食相关疾病（例如糖尿病（diabetes，DM））的发作方面具有特别重要的意义[14]。DM是一种复杂的代谢综合症，由生产减少、生物利用度不足和胰岛素对血浆葡萄糖水平升高的敏感性差引起。在复杂的碳水化合物进一步转化成更简单的形式（葡萄糖）并吸收到血液系统之前，α-淀粉酶起着引发化学分解的基本作用。研究表明，在饮食混合碳水化合物后，抑制α-淀粉酶可以大大降低餐后血糖水平的升高[15]。因此为控制II型糖尿病，具有α-淀粉酶抑制潜能的功能性食品和营养保健品得到了广泛认可。本研究将花生粕提取蛋白进行酶解，以α-淀粉酶抑制率和多肽得率为评价指标，筛选出最佳蛋白酶，通过酶解条件优化实验获得最佳酶解工艺条件，获得α-淀粉酶抑制肽。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
花生粕 青岛长寿食品有限公司；风味蛋白酶（1.5万U/g）、碱性蛋白酶（20万U/g）、胰蛋白酶（250万U/g） 北京索莱宝科技有限公司；中性蛋白酶（100 U/g）、木瓜蛋白酶（≥100万U/g）、α-淀粉酶 上海源叶生物科技有限公司；牛血清蛋白 长春德尔塔生物技术有限公司。
LG0.2真空冷冻干燥机 沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司；HC-3018高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；SPD-20A UVmini-1240紫外可见分光光度计 日本岛津公司；
1.2 实验方法
1.2.1 花生蛋白制备
将花生粕以10:1 mL/g液料比与蒸馏水混合，以1 mol/L NaOH溶液将pH调至8.0，常温磁力搅拌1 h后5000 r/min离心15 min，离心后取上层清液以1 mol/L HCL溶液调节pH至4.5，4000 r/min离心10 min后取下层沉淀，加适量蒸馏水用1 mol/L NaOH溶液调至中性使其充分溶解，将溶解后的蛋白液用透析袋透析24 h后冷冻干燥备用[16]。
1.2.2 花生多肽制备
称取花生蛋白加入蒸馏水，按液料比为20:1 mL/g配制成溶液，进行超声波预处理，超声波预处理条件为超声功率150 W，超声温度35 ℃，超声时间20 min。预处理结束后调节温度和pH至各蛋白酶最适条件（见表1），蛋白酶添加量为4000 U/g，酶解3 h。酶解后沸水浴灭酶10 min，冰水浴冷却，以10000 r/min,离心20 min，收集上清液测其多肽得率及α-淀粉酶抑制率后冷冻干燥备用[17]。
表 1 不同蛋白酶最适反应条件Table 1. Optimal reaction conditions for different enzymes蛋白酶种类 酶解条件 温度（℃） pH 风味蛋白酶 50 7 胰蛋白酶 50 7 碱性蛋白酶 50 10 木瓜蛋白酶 55 7 中性蛋白酶 50 7 1.2.3 花生蛋白酶解工艺优化
1.2.3.1 蛋白酶的筛选
为了筛选出酶解花生蛋白的最优蛋白酶种类，对比了5种蛋白酶对花生蛋白的酶解效果，在表1中所列的各蛋白酶的最适条件下，以花生蛋白液料比20:1mL/g，超声功率150 W，超声时间30 min，酶添加量5000 U/g，酶解3 h。以α-淀粉酶抑制率和多肽得率为指标，筛选出最优蛋白酶，进行下一步试验。
1.2.3.2 单因素实验
准确称取一定量的花生蛋白，以1.2.2的酶解工艺，设计花生蛋白液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1）、超声功率（50、100、150、200、250 W）、超声时间（10、20、30、40、50 min）、酶添加量（2000、3000、4000、5000、6000 U/g）、酶解时间（1、2、3、4、5 h）的五个因素实验，研究五个因素对制备α-淀粉酶抑制肽的影响，进而确定因素以及水平范围内响应面试验的设计。
1.2.3.3 响应面试验
在单因素实验结果的基础上，以α-淀粉酶抑制率为主要指标，采用单因素实验结果中对花生粕蛋白酶解效果影响较大的三个因素进行响应面试验。采用Design-Expert.V8.0.6统计软件，设计三因素三水平二次回归方程，拟合各因素和α-淀粉酶抑制率的函数关系。试验因素水平见表2。
表 2 酶解工艺响应面水平与因素设计Table 2. Response surface level and factor design table of enzymatic hydrolysis process水平 因素 A液料比（mL/g） B超声时间（min） C酶添加量（U/g） −1 15:1 20 4000 0 20:1 30 5000 1 25:1 40 6000 1.2.4 测定方法
1.2.4.1 花生蛋白含量测定
利用凯氏定氮法测定花生粕蛋白含量，方法参考国标GB 5009.5-2016《食品安全国家标准—食品中蛋白质的测定》。
1.2.4.2 α-淀粉酶活性抑制率的测定
在0.5 mL PBS溶液中加入0.25 mL酶解溶液和等体积的1.5 U/mL α-淀粉酶溶液，于37 ℃加热10 min后，再加入0.5 mL 1%可溶性淀粉溶液，取0.25 mL酶解溶液和等体积的1.5 U/mL α-淀粉酶溶液，加入到0.5 mL PBS溶液中于37 ℃加热10 min后，再加入0.5 mL 1%可溶性淀粉溶液，充分混匀，反应5 min后加入1 mL DNS终止反应，沸水浴10 min冷却至室温后加入5 mL水，于540 nm测定吸光度OD值[18-22]。
α−淀粉酶抑制率(%)=(1−ODC−ODDODA−ODB)×100 式中：ODA为空白管；ODB为空白对照管；ODB为抑制管；ODD为抑制对照管。
1.2.4.3 多肽得率测定
采用双缩脲法绘制牛血清蛋白标准曲线[23-24]。将牛血清蛋白配制成10 mg/mL的标准蛋白溶液，分别取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，加蒸馏水补至1 mL，再加入4 mL双缩脲试剂，混匀均匀后静置30 min，于540 nm处分别测其OD值。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线为y=0.04136x+0.05146，R2=0.9997。
多肽液样品含量测定：取1 mL样品溶液加入等体积的10%（W/V）的三氯乙酸混合均匀后，静止10 min，于4000 r/min离心20 min，取上清液1 mL，并加入4 mL双缩脲试剂，混合后室温静置30 min，测定540 nm处吸光度。
W(%)=c×D×Vm×100 式中：W表示多肽得率，%；c表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度，mg/mL；D表示溶液稀释倍数；V表示溶液体积，mL；m表示花生蛋白取样量，mg。
1.2.5 超滤分离
花生蛋白酶解液经水相0.45 µm微孔滤膜过滤，选择截取分子量分别为10、5、3 kDa的超滤膜对酶解液进行分级分离,将所得多肽组分分别收集后迅速冷冻干燥，−20 ℃保存备用。
1.2.6 Sephadex G-15凝胶分离纯化
方法根据江明珠、陈佳欣等人的修改稍作调改[25-26]。将处理好的Sephadex G-15装入1.6 cm×100 cm的玻璃层析柱中。选取无菌水进行洗脱试验，上样浓度为10 mg/mL，上样量为2 mL，洗脱流速为0.8 mL/min，用紫外检测仪在220 nm处进行检测，收集器每4 min一管，将收集的各个洗脱峰冷冻干燥得到花生多肽，测定各组分ɑ-淀粉酶抑制率。
1.3 数据处理
所有实验均进行三次平行实验，数据采用平均值±标准差的形式，采用Orign 8.5、Design Expert 8.0.6 软件对试验数据进行处理。
2. 结果与分析
2.1 蛋白酶筛选结果
由图1可知，五种蛋白酶的多肽得率都超过了30%，对α-淀粉酶也有一定的抑制效果，说明五种酶对花生多肽都有一定得酶解效果，其中风味蛋白酶无论是在α-淀粉酶抑制率还是多肽得率，都表现出不错的结果。碱性蛋白酶和中性蛋白酶的多肽得率也表现出不错的效果，但其α-淀粉酶抑制率低于风味蛋白酶，考虑可能是由于蛋白酶解程度越大，多肽得率越高，生成的小分子肽段越多导致具有抑制活性的肽段越少，因此，选择风味蛋白酶进行后续实验。
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图 1 不同蛋白酶酶解液的α-淀粉酶抑制率和多肽得率Figure 1. α-Amylase inhibition rate and polypeptide yield of hydrolysates of different proteases2.2 单因素实验结果
2.2.1 料液比对蛋白酶解液的影响
由图2可知，酶添加量一定时，多肽得率随液料比的增大而降低，这是因为底物浓度越低，其与酶结合的几率就越低，多肽得率也越低[25]。α-淀粉酶活性抑制率呈现先上升后下降的趋势，在液料比为20:1 mL/g时α-淀粉酶活性抑制率最高为42.19%。因此风味蛋白酶制备花生粕多肽的最佳料液比为20:1 mL/g。
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图 2 液料比对α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影响Figure 2. Effects of solid-liquid ratio on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield2.2.2 超声功率对蛋白酶解液的影响
超声波预处理能破坏花生蛋白的结构，使酶的结合位点增多，更容易使花生蛋白酶解为小分子肽段。由图3可知，多肽得率和α-淀粉酶抑制率都随超声功率的增大呈现先上升后下降的趋势，当超声功率为150 W时，α-淀粉酶活性抑制率为最大值36.7%，但当超声功率继续升高时，花生蛋白结构被破坏，酶结合位点持续增多，大分子蛋白被酶解为更小的分子量的短肽，导致α-淀粉酶抑制率降低。因此风味蛋白酶制备花生粕多肽的最佳超声功率为150 W。
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图 3 超声功率对α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影响Figure 3. Influence of ultrasonic power on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield2.2.3 超声时间对蛋白酶解液的影响
由图4可知，超声功率一定时，随着超声时间的延长，多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率都呈现出先上升再下降的趋势，当超声时间为30 min时，多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率达到最大值分别为42.3%和40.07%。这可能是因为超声波空化作用对蛋白分子产生的剪切作用力和瞬间高压，能够使花生蛋白结构被破坏，酶结合位点增多，具有抑制活性的产物抑制率随之增加，因此风味蛋白酶制备花生粕多肽的最佳超声时间为30 min。
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图 4 超声时间对α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影响Figure 4. Influence of ultrasonic time on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield2.2.4 酶添加量对蛋白酶解液的影响
由图5可知，随着酶添加量的增大，蛋白液不断被酶解解，多肽得率随之上升，α-淀粉酶抑制率先上升后下降，增大酶添加量使其与底物充分接触，大分子蛋白质被水解成不同分子量的肽段，α-淀粉酶抑制率出现降低[27]。当酶添加量为5000 U/g时，α-淀粉酶活性抑制率达到最大值为51.62%。因此风味蛋白酶制备花生粕多肽的最佳酶添加量为5000 U/g。
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图 5 酶添加量对α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影响Figure 5. Effects of enzyme dosage on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield2.2.5 酶解时间对蛋白酶解液的影响
由图6可知，随着酶解时间的延长，多肽得率逐渐升高，ɑ-淀粉酶活性抑制率出现先升高后降低的趋势，这是因为具有ɑ-淀粉酶抑制作用的有效肽段随着水解的继续进行，被酶解成无抑制活性的小肽，从而活性抑制率降低[28]，当酶解时间为2 h时，ɑ-淀粉酶活性抑制率达到最大值40.78%。考虑到以上原因，风味蛋白酶制备花生粕多肽最佳酶解时间为2 h。
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图 6 酶解时间对α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影响Figure 6. Effects of enzymatic hydrolysis time on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield2.3 响应面优化试验设计及结果
采用Design-Expert．V8.0.6统计软件设计，响应面优化试验结果见表3，回归方差分析见表4。
表 3 响应面试验设计及结果Table 3. Design and results of response surface experiment试验号 液料比 超声时间 酶添加量 α-淀粉酶抑制率（%） 1 0 1 1 44.76 2 0 0 0 50.51 3 0 0 0 49.58 4 0 1 −1 39.9 5 1 1 0 41.58 6 1 −1 0 43.76 7 0 −1 −1 41.63 8 0 0 0 51.62 9 −1 0 1 45.52 10 0 0 0 51.07 11 −1 −1 0 40.85 12 1 0 1 47.31 13 1 0 −1 42.55 14 −1 1 0 39.01 15 0 −1 1 46.55 16 −1 0 −1 40.89 17 0 0 0 50.99 表 4 响应面试验回归模型方差分析Table 4. Variance analysis for the fitted regression equation方差来源 平方和 自由度 均平方 F值 P值 显著性水平 模型 450.15 9 50.02 114.92 < 0.0001 *** A 12.60 1 12.60 28.95 0.0010 ** B 2.49 1 2.49 5.71 0.0482 * C 97.02 1 97.02 222.92 < 0.0001 *** AB 0.065 1 0.065 0.15 0.7106 AC 5.59 1 5.59 12.85 0.0089 ** BC 1.78 1 1.78 4.09 0.0827 A2 14.78 1 14.78 33.97 0.0006 ** B2 28.00 1 28.00 64.33 < 0.0001 ** C2 267.04 1 267.04 613.55 < 0.0001 *** 残差 3.05 7 0.44 失拟项 1.85 3 0.62 2.05 0.2489 不显著 净误项 1.20 4 0.30 总离差 453.20 16 注：“***”表示差异极显著P<0.001；“**”表示差异较显著P<0.01；“*”表示差异显著P<0.05；R2=0.9306，R2Adj=0.9846。 采用Design-Expert.V8.0.6统计软件，对表3中的试验数据进行二次多项式回归拟合，最终获得二次项回归方程为：
α-淀粉酶抑制率Y=+55.88+1.26A−0.0.56B+3.48C+0.13AB−1.18AC+0.67BC−1.87A2−2.582−7.96C2。
从表4可以看出，该模型P<0.0001，差异极显著，因变量与所考察的自变量之间线性关系显著R2=0.9306，模型调整确定系数R2Adj=0.9846，说明该模型可信度较高，拟合度较好[29]。失拟项不显著P=0.2489>0.05，说明本实验所得二次回归方程能够很好对响应值进行预测[30-31]。从方差分析结果可以看出各因素对ɑ-淀粉酶抑制率的影响力大小的顺序为：C>A>B，即酶添加量>液料比>超声时间。
2.4 响应面分析及最优条件确定
通过回归方程绘制花生粕多肽酶解工艺条件的响应面分析图，响应面图呈开口向下的凹形曲面，表明ɑ-淀粉酶抑制率存在极大值，由等高线的中心位置可以表明ɑ-淀粉酶抑制率的最优条件存在于设计因素水平的范围之内。响应面交互作用受曲面坡度的影响，曲面陡表明该因素对ɑ-淀粉酶抑制率的影响显著，曲面平缓表明该因素ɑ-淀粉酶抑制率的影响不显著[32]；等高线形状反映两因素交互作用的强弱，椭圆形表明两因素交互作用强，圆形则表明两因素交互作用弱；等高线密集表明对ɑ-淀粉酶抑制率的影响较大，稀疏表明对ɑ-淀粉酶抑制率的影响较小，结果如图7所示。
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图 7 α-淀粉酶抑制率响应面优化试验两因素交互作用影响Figure 7. Interaction of two factors in response surface optimization experiment of α-amylase inhibition rate通过Design-Expert 8.0.6软件优化得到花生蛋白制备α-淀粉酶抑制肽的最佳工艺条件：液料比为21.35 mL/g，超声时间为29.25 min，酶添加量为5195.75 U/g，在此试验下，α-淀粉酶抑制率为51.4112%。采用这一结果并根据实际情况，将工艺条件改为：液料比为20:1 mL/g，超声时间为30 min，酶添加量为5000 U/g，得到实验结果为50.62%。与理论值较为接近，说明经过响应面优化得到的超声波辅助酶解花生蛋白制备α-淀粉酶抑制肽工艺参数具有较高可靠性。
2.5 超滤分离纯化花生粕多肽的结果
花生蛋白酶解液经超滤分级分离后得到分子量不同的四个组分，取样品浓度为5 mg/mL分别测定各个多肽组分对ɑ-淀粉酶的抑制率，结果如表5所示。
表 5 超滤后各组分间对α-淀粉酶的抑制率Table 5. Inhibition rates of α -amylase among components after ultrafiltration组分 分子量（kDa） 抑制率（%） 1 >10 13.20±0.03 2 5~10 22.89±0.05 3 3~5 45.77±0.07 4 <3 60.21±0.04 由表5可知，不同分子量组分的ɑ-淀粉酶抑制活性不同。ɑ-淀粉酶抑制活性随着分子量的降低而显著增加。当花生粕多肽分子量<3 kDa时，其对ɑ-淀粉酶抑制率最高。Gu X从榨油后的杏仁残渣中提取的两种降血糖肽，肽A肽B的分子量分别为341.37和291.31[33]。Yuwen Fang从丝胶中提取纯化鉴定出的降血糖肽的分子量为632、689、774 kDa[34]。由此可以看出，超滤后具有较高活性的肽段分子量都比较小，因此选择分子量<3 kDa的组分进一步纯化。
2.6 Sephadex G-15凝胶分离纯化结果
将分子量<3 kDa的多肽组分进行Sephadex G-15凝胶纯化，得到三个组分峰（P1、P2、P3），结果见图8，由图可知，P3为主要组分峰。分别收集各个组分峰，−20 ℃冷冻干燥，测定各组分峰对α-淀粉酶抑制率。结果见图9。
将收集后的3个组分峰多肽，配制成1 mg/mL浓度相同的溶液，分别测其对ɑ-淀粉酶的抑制率。由图9可知，P1、P2、P3三个组分的抑制率分别为63.08%、57.56%、73.30%。P3组分多肽明显高于其他组分。凝胶过滤层析中，大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，较大分子化合物后洗脱出来，由此可以推测，三个组分的分子质量大小为P1>P2>P3。
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图 9 Sephadex G-15 分离纯化后花生蛋白酶解液各组分抑制率Figure 9. Inhibition rate of each component of peanut proteolytic solution after separation and purification by Sephadex G-153. 结论
本实验以花生粕为原料提取花生蛋白，经过超声波预处理后酶解花生蛋白获得粗肽，以多肽得率和α-淀粉酶抑制率为指标筛选最适蛋白酶，在单因素实验上，选取液料比、超声时间、酶添加量进行Box-Behnken试验设计，得到最优工艺条件为：液料比为20:1 mL/g，超声时间为30 min，酶添加量为5000 U/g，在此条件下，α-淀粉酶抑制率为50.62%。与未经过超声处理组的α-淀粉酶抑制率35.45%相比，有显著提升，为继续提高多肽的抑制活性，对粗肽进行分离纯化。经超滤分级分离，得到四个不同组分，分别为>10 kDa、5~10 kDa、3~5 kDa、<3 kDa，其中<3 kDa分子量抑制率达到最高60.21%。利用Sephadex G-15凝胶分离纯化<3 kDa组分，得到P1、P2、P3三个组份，其中P3最高抑制率可达到73.30%。由此可见，花生多肽对ɑ-淀粉酶抑制率效果显著，当然如果想要继续提高抑制率，还需对酶解液进一步纯化处理。
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图 1 不同蛋白酶酶解液的α-淀粉酶抑制率和多肽得率
Figure 1. α-Amylase inhibition rate and polypeptide yield of hydrolysates of different proteases
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图 2 液料比对α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影响
Figure 2. Effects of solid-liquid ratio on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield
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图 3 超声功率对α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影响
Figure 3. Influence of ultrasonic power on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield
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图 4 超声时间对α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影响
Figure 4. Influence of ultrasonic time on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield
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图 5 酶添加量对α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影响
Figure 5. Effects of enzyme dosage on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield
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图 6 酶解时间对α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影响
Figure 6. Effects of enzymatic hydrolysis time on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield
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图 7 α-淀粉酶抑制率响应面优化试验两因素交互作用影响
Figure 7. Interaction of two factors in response surface optimization experiment of α-amylase inhibition rate
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图 9 Sephadex G-15 分离纯化后花生蛋白酶解液各组分抑制率
Figure 9. Inhibition rate of each component of peanut proteolytic solution after separation and purification by Sephadex G-15
表 1 不同蛋白酶最适反应条件
Table 1 Optimal reaction conditions for different enzymes
蛋白酶种类 酶解条件 温度（℃） pH 风味蛋白酶 50 7 胰蛋白酶 50 7 碱性蛋白酶 50 10 木瓜蛋白酶 55 7 中性蛋白酶 50 7 
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表 2 酶解工艺响应面水平与因素设计
Table 2 Response surface level and factor design table of enzymatic hydrolysis process
水平 因素 A液料比（mL/g） B超声时间（min） C酶添加量（U/g） −1 15:1 20 4000 0 20:1 30 5000 1 25:1 40 6000
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表 3 响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiment
试验号 液料比 超声时间 酶添加量 α-淀粉酶抑制率（%） 1 0 1 1 44.76 2 0 0 0 50.51 3 0 0 0 49.58 4 0 1 −1 39.9 5 1 1 0 41.58 6 1 −1 0 43.76 7 0 −1 −1 41.63 8 0 0 0 51.62 9 −1 0 1 45.52 10 0 0 0 51.07 11 −1 −1 0 40.85 12 1 0 1 47.31 13 1 0 −1 42.55 14 −1 1 0 39.01 15 0 −1 1 46.55 16 −1 0 −1 40.89 17 0 0 0 50.99
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表 4 响应面试验回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis for the fitted regression equation
方差来源 平方和 自由度 均平方 F值 P值 显著性水平 模型 450.15 9 50.02 114.92 < 0.0001 *** A 12.60 1 12.60 28.95 0.0010 ** B 2.49 1 2.49 5.71 0.0482 * C 97.02 1 97.02 222.92 < 0.0001 *** AB 0.065 1 0.065 0.15 0.7106 AC 5.59 1 5.59 12.85 0.0089 ** BC 1.78 1 1.78 4.09 0.0827 A2 14.78 1 14.78 33.97 0.0006 ** B2 28.00 1 28.00 64.33 < 0.0001 ** C2 267.04 1 267.04 613.55 < 0.0001 *** 残差 3.05 7 0.44 失拟项 1.85 3 0.62 2.05 0.2489 不显著 净误项 1.20 4 0.30 总离差 453.20 16 注：“***”表示差异极显著P<0.001；“**”表示差异较显著P<0.01；“*”表示差异显著P<0.05；R2=0.9306，R2Adj=0.9846。
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表 5 超滤后各组分间对α-淀粉酶的抑制率
Table 5 Inhibition rates of α -amylase among components after ultrafiltration
组分 分子量（kDa） 抑制率（%） 1 >10 13.20±0.03 2 5~10 22.89±0.05 3 3~5 45.77±0.07 4 <3 60.21±0.04
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