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中国精品科技期刊2020

Box-Behnken法优化甘草多糖提取工艺及其体外抗氧化活性分析

柴美灵, 李娜, 乔宏萍, 刘地, 张晓红, 曹贵东, 武晓英

柴美灵,李娜,乔宏萍,等. Box-Behnken法优化甘草多糖提取工艺及其体外抗氧化活性分析[J]. 食品工业科技,2021,42(23):192−200. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021030248.
引用本文: 柴美灵,李娜,乔宏萍,等. Box-Behnken法优化甘草多糖提取工艺及其体外抗氧化活性分析[J]. 食品工业科技,2021,42(23):192−200. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021030248.
CHAI Meiling, LI Na, QIAO Hongping, et al. Application of Box-Behnken Design for Ultrasonic-assisted Extraction of Glycyrrhiza Polysaccharide and Its Antioxidant Activity Analysis in vitro[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(23): 192−200. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021030248.
Citation: CHAI Meiling, LI Na, QIAO Hongping, et al. Application of Box-Behnken Design for Ultrasonic-assisted Extraction of Glycyrrhiza Polysaccharide and Its Antioxidant Activity Analysis in vitro[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(23): 192−200. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021030248.

Box-Behnken法优化甘草多糖提取工艺及其体外抗氧化活性分析

基金项目: 山西省重点研发计划(201603D221008-2);山西省重点研发计划重点项目子项目(201603D21109-1-2);太原师范学院校级项目(SYYJSJC-2038)
详细信息
    作者简介:

    柴美灵(1996−),女,硕士研究生,研究方向:动物营养分子生物学,E-mail:1521341403@qq.com

    通讯作者:

    武晓英(1973−),女,博士,副教授,研究方向:动物营养与环境健康,E-mail:wuxy@tynu.edu.cn

  • 中图分类号: TS201.1

Application of Box-Behnken Design for Ultrasonic-assisted Extraction of Glycyrrhiza Polysaccharide and Its Antioxidant Activity Analysis in vitro

  • 摘要: 本研究以传统炮制甘草为原材料,采用超声辅助水浴提取法,以粉碎粒径、液料比、超声温度和超声时间为考察因素,利用Box-Behnken响应面进行试验设计和曲面响应法对最佳甘草多糖提取条件进行优化,构建预测模型的二次多项式回归方程,并测定其体外抗氧化活性。结果表明,甘草多糖提取的最佳工艺条件为:粉碎粒径127 μm,液料比19.32 mL/g,超声温度65 ℃,超声时间30.2 min,多糖得率为10.867%。甘草粗提取物对DPPH·和ABTS+·均具有不同程度的清除作用,两种不同自由基的清除率与多糖提取物浓度之间存在一定量效关系,其IC50值分别2.80 mg/mL和1.96 mg/mL。本研究建立的模型可对甘草多糖得率进行分析和预测,并为甘草资源的开发和利用提供依据。
    Abstract: In the present paper, Glycyrrhiza was selected as raw materials, and ultrasonic-assisted water bath extraction method was used to investigate crushed particle size, liquid-material ratio, ultrasonic temperature and ultrasonic time. The ultrasonic-assisted extraction technology of polysaccharide from Glycyrrhiza was optimized by Box-Behnken design methodology and the quadratic polynomial regression equation of the prediction model was established, then the antioxidant activity of the polysaccharide in vitro was determined. According to the model regression analysis, the optimum conditions were as follows: Particle size of 127 μm, liquid-material ratio of 19.32 mL/g, ultrasonic temperature of 65 ℃ and ultrasonic time of 30.2 min. Under these conditions, the yield of polysaccharide reached 10.867%. Glycyrrhiza polysaccharide showed ability to scavenge both DPPH· and ABTS+· with IC50 values of 2.80 mg/mL and 1.96 mg/mL, respectively, and there was a certain dose-effect relationship between the scavenging rate of two different free radicals and the concentration of crude polysaccharide extract. The model established in this study can analyze and predict the yield of Glycyrrhiza polysaccharide to determine the natural antioxidant activity, which can provide an experimental basis for the development and utilization of Glycyrrhiza resources.
  • 甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch),别名甜草根,豆科甘草属,味甘而药性平和,被称为“国老”(众药之王),为药食同源的中药材,常被中医处方入药,同时也作为食品、保健品、化妆品等原料在工业生产中广泛应用[1]。甘草中主要含有三萜类、黄酮类、多糖类、香豆素类、挥发油类以及氨基酸等成分[2],其提取物在抗炎、解毒、抗氧化、免疫调节等方面具有一定的药理作用,也在保护神经系统、呼吸系统、消化系统、内分泌系统等方面具有重要的研究意义[3]。甘草多糖是从甘草中提取出来的活性多糖,易溶于水,具有多种不同的功效,如调节机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、防治骨关节炎等作用[4]。陈橙等[5]分离纯化胀果甘草多糖,测定得到的3种酸性杂多糖均是由阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、半乳糖醛酸(GalA)以不同摩尔比组成;薛薇[6]将甘草多糖(GPS)降解衍生化后,通过气质色谱分析出GPS由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖三种单糖组成。

    现有多糖提取技术有溶剂提取法、超声辅助提取法、渗流-大孔树脂循环耦合提取法、微波辅助提取、酶提法和超临界二氧化碳(CO2)萃取技术等[7]。目前超声提取技术在实验中被广泛应用,其原理是利用超声波具有的空化效应、机械效应及热效应,加速溶剂流动、渗透、溶解、扩散等,达到提取分离的目的,提取过程实际是对植物细胞破碎而加速植物成分的提取[8],具有提取充分且效率高、提取处理量大且耗时短、提取温度低且能耗小、提取成本低且效益高、提取物易于分离和纯化和提取适应性广泛等优点[9]

    响应面试验法(RSM)是利用合理的试验设计,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过分析来寻求最优工艺参数,解决多变量问题,有助于快速建模、缩短优化时间和提高工程应用[10]。张光辉等[11]在单因素实验的基础上,采用响应面法优化甘草多糖提取工艺,表明甘草多糖的最佳提取工艺条件为提取温度60.57 ℃、提取时间1.84 h、料液比1:30.92 g/mL,此条件下甘肃、内蒙古、新疆甘草多糖得率分别为(19.89%±0.08%)、(11.25%±0.10%)、(9.60%±0.13%),当甘草多糖浓度为0.50 mg·mL−1时,甘肃、内蒙古、新疆甘草多糖对DPPH自由基的清除率分别为27.17%、31.69%、58.68%。李德龙等[12]在响应面优化药桑椹多糖超声提取工艺研究中,表明多糖得率在提取3次时最高,分析可能是因为提取次数过多时多糖中的杂质过多溶出导致得率下降,由此证明提取次数也是影响多糖提取工艺的因素之一,为接下来的研究提供有价值的参考。

    本实验主要采用超声辅助水提取法,提取3次并分别测定每次提取的多糖含量,考察提取过程中的多糖变化趋势,再利用Box-Behnken试验设计获得粉碎粒径、液料比、超声温度、超声时间对多糖得率的影响水平,得出最佳工艺参数;并采用DPPH与ABTS法在体外对其清除自由基的活性[13]进行初步研究,以期为甘草多糖的开发利用提供参考。

    甘草药材 山西瑞象生物药业有限公司(产地:甘肃宁夏);葡萄糖标准品、2, 2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 北京索莱宝科技有限公司;1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海麦克林生化科技有限公司;无水乙醇(批号:20200922)、苯酚(批号:20180328) 天津市大茂化学试剂厂;硫酸(批号:20100901) 四川西陇科学有限公司;以上试剂均为分析纯(AR)。

    BSA223S-CW型赛多利斯精密天平 赛多利斯科学仪器北京有限公司;UF-123823H型超声波清洗机 深圳市歌能超声波重子声学科技有限公司;SL-200型高速多功能粉碎机 浙江省永康市松青五金厂;HC-3018R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;V-1100型可见分光光度计 上海美析仪器有限公司;RE-5205型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;SHZ-III型循环水式多用真空泵 上海知信实验仪器技术有限公司。

    取一定量的甘草根切片,经烘箱干燥后取出,由高速多功能粉碎机粉碎一定时间后,将其用不同孔径大小的筛子筛出,分别用密封袋包装储存备用。

    精密称取干燥至恒重的不同粉碎粒径的甘草粉末各1.0 g于50 mL离心管内,按一定的液料比和超声功率,在一定的温度下反应一定的时间,待冷却至室温后离心,得甘草多糖提取液。

    采用苯酚-硫酸法[14]测定糖含量。精密称取葡萄糖标准品4 mg于小烧杯溶解后转到容量瓶中定容至25 mL,摇匀得0.16 mg/mL的葡萄糖标准品溶液。精密吸取不同体积葡萄糖对照品溶液于洁净的试管中,蒸馏水补足至0.2 mL,依次加入0.4 mL 5%苯酚和2.0 mL浓硫酸,摇匀后静置反应30 min,以蒸馏水加入0.4 mL 5%苯酚和2.0 mL浓硫酸作为空白对照,于490 nm处测吸光值。以葡萄糖质量浓度C(mg/mL)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线[15]

    单因素实验分别考察粉粹粒径(75、150、180、250、880 μm)、液料比(10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g)、超声温度(35、45、55、65、75 ℃)、超声时间(10、20、30、40、50 min)、超声功率(200、400、600、800、1000 W)对甘草多糖得率的影响,各因素固定值分别为180 μm、20:1 mL/g、55 ℃、30 min、600 W。以上实验分别提取3次,标记为1提、2提、3提,将3次提取液合并得合并液。

    在单因素实验基础上,采用Design Expert 10. Box-Behnken 试验设计方案,以影响显著的粉碎粒径(A)、液料比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)为影响因素,以多糖得率为响应值,设计4因素3水平的29组实验进行响应面试验,优化甘草多糖提取工艺,其因素与水平设计见表1

    表  1  响应面试验因素与水平设计
    Table  1.  Experimental factors and level of response surface design
    水平因素
    A粉碎粒径
    (μm)
    B液料比
    (mL/g)
    C超声温度
    (℃)
    D超声时间
    (min)
    −17515:14520
    015020:15530
    118025:16540
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    精密称取甘草粉末1.0 g进行单因素实验,超声提取后过滤提取液、离心取上清液备用。以葡萄糖标准溶液绘制的标准曲线,来计算甘草多糖的多糖得率,实验重复3次,取平均值,按照以下式(1)计算多糖得率[16]

    甘草多糖得率(%)=c×n×vm×1000×100
    (1)

    式中:c表示根据吸光度值计算出的多糖质量浓度,mg/mL;v表示提取液体积,mL;n表示提取液稀释倍数;m表示称取的甘草粉末质量,g。

    精确配制一定质量浓度梯度的甘草多糖溶液,分别取每个浓度的多糖样品溶液0.3 mL于刻度试管中,在避光条件下依次在试管中加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH乙醇溶液,室温条件下避光反应30 min,以无水乙醇溶液为空白对照,以BHT为阳性对照[17],于517 nm处测定溶液的吸光度值。所有实验重复3次。根据式(2)计算多糖样品对DPPH自由基的清除率,并计算半数抑制率IC50[18]

    DPPH自由基清除率(%)=(1AsArA0)×100
    (2)

    式中:A0表示0.3 mL蒸馏水+2.7 mL DPPH溶液的吸光度值;As表示0.3 mL样品溶液+2.7 mL DPPH溶液反应后的吸光度值;Ar表示0.3 mL样品溶液+2.7 mL无水乙醇溶液的吸光度值。

    精确配制7 mmol/L ABTS溶液与2.5 mmol/L过硫酸钾溶液,室温下将两者等体积混合,避光处反应12~16 h,获得所需ABTS工作液备用,使用前以80%的乙醇稀释,使其734 nm处OD值为(0.7±0.02)。准确配制不同浓度的样品溶液,分别取每个浓度的多糖样品溶液0.3 mL于刻度试管中,在避光条件下依次在试管中加入2.7 mL ABTS溶液,室温条件下避光反应30 min,于734 nm波长下测定吸光度值,无水乙醇调零,以BHT[16]为阳性对照。所有实验重复3次。按式(3)计算甘草多糖对ABTS自由基的清除率,并计算半数抑制率IC50[19]

    ABTS自由基清除率(%)=(1ASArA0)×100
    (3)

    式中:A0表示0.3 mL蒸馏水+2.7 mL ABTS工作液的吸光度值;As表示0.3 mL样品溶液+2.7 mL ABTS工作液反应后的吸光度值;Ar表示0.3 mL样品溶液+2.7 mL无水乙醇溶液的吸光度值。

    单因素实验和抗氧化实验数据采用Origin 9.1进行整理和绘图;响应面试验数据利用Design-Expert 10软件中的Box-Behnken法进行回归模型方程的建立及方差分析,实验均重复三次。

    本实验建立的葡萄糖标准曲线,其回归方程为:y=8.3949x−0.0115,R2=0.9970,葡萄糖在0~0.16 mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。本实验可根据该标准曲线方程计算甘草多糖中的多糖含量。

    粉碎粒径对甘草多糖得率的影响如图1A所示,在3次提取过程中,多糖得率随着粉碎粒径的增大而呈现先增大后减小的趋势,当粉碎粒径为150 μm时,多糖得率最大。可能是因为粉碎粒径过小时,物料过细,使甘草粉末易结块,从而增加传质阻力使传质速率降低,不利于甘草多糖分子的溶出[20],当粉碎粒径继续增大时,多糖得率降低,分析原因可能是粉碎粒径过大,溶剂不能有效浸润样品,无法完全提取,因而得率降低[21]。因此选择粉碎粒径为150 μm。

    图  1  粉碎粒径、液料比、超声时间、超声温度和超声功率对多糖得率的影响
    Figure  1.  Effects of particle size, liquid-material ratio, ultrasonic time, ultrasonic temperature and ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

    图1B所示,在液料比10~30 mL/g范围内,1提与合并液的甘草多糖得率呈现先增大后减少后增大的趋势;2提与3提的甘草多糖得率均呈现先增大后逐渐减小的趋势。这可能是因为第一次提取时溶质没有完全浸透在溶液中,当溶液体积过小时,多糖在水中溶解不完全而且黏度过大;水体积超过20倍时,多糖在大量溶剂中的传递效果和传热效果受到影响[22],此外,过高的液料比也可能会导致其他杂质的溶出从而抑制多糖的溶出[23],当液料比达到20 mL/g时,提取剂已经达到饱和状态,再增大液料比多糖得率反而会下降,因此选择液料比20:1 mL/g为宜。

    图1C所示,随着超声温度增加,1提与合并液的多糖得率呈现先增大后减少的趋势,且55 ℃时甘草多糖得率最高;2提与3提的甘草多糖得率均呈现逐渐增大的趋势。这可能是由于:第一次提取时,随着温度的升高使分子运动加速了提取溶剂的渗入和细胞内多糖的释放,大部分多糖已经释放到溶质中,但温度过高会破坏多糖结构[24],尤其对高温较敏感的多糖;当进行2次和3次提取时,大部分对高温较敏感的多糖已经遭到破坏,胞内较少量的多糖可能对高温不敏感,从而随温度的增大而逐渐释放。因此,选择温度55 ℃为宜。

    图1D所示,随着超声时间的延长,1提与合并液的多糖得率呈现先增大后减少后增大的趋势,当提取时间30 min时达到最大;2提与3提的甘草多糖得率均呈现逐渐减小的趋势。其原因可能是在第一次提取的过程中,甘草物料所含多糖在短时间内不能完全溶解释放,但随着提取时间的延长,较多的多糖逐渐溶解并释放到溶质中,使得得率提高,当提取时间继续增加,持续的高温与超声作用可能在一定程度上破坏多糖分子的结构,使多糖降解为单糖[25]。因此,选择最佳提取时间为30 min。

    图1E所示,随着超声功率的增加,1提的甘草多糖得率逐渐增大,2提、3提以及合并液的多糖得率均呈现先增大后减小的趋势,可能是由于在第一次提取过程中,甘草细胞壁首次遭到超声波的破坏,随着功率的增大,越来越多的细胞遭到破坏,多糖分子被逐渐释放到溶质中,而在2提和3提的过程中,大多数甘草细胞壁已经在超声的过程中被破碎,随着超声功率的增大,超声波直接作用于多糖分子,大分子多糖在超声波的强剪切作用下发生断裂,导致多糖得率降低[26],因此选择超声功率600 W为宜。

    通过以上单因素实验分析且综合考虑多糖得率及实验成本等因素,最终确定甘草多糖提取的最佳基本条件为:粉碎粒径150 μm、液料比20:1 mL/g、超声温度55 ℃、超声时间30 min和超声功率600 W。在以上5个单因素中,除超声功率外,其余4个因素对甘草多糖得率的影响范围均大于1%,因此,将粉碎粒径、液料比、超声温度和超声时间作为Box-Behnken响应面试验设计的优化参数。

    根据单因素实验结果,采用Box-Behnken试验设计对甘草多糖提取工艺进行优化,选择超声波功率600 W作为响应面优化恒定条件,对粉碎粒径、液料比、温度、时间4个影响显著的因素进一步优化,以多糖得率为评定指标,试验设计方案及结果如表2所示。

    表  2  甘草多糖提取得率的Box-Behnken 试验设计与结果
    Table  2.  Box-Behnken experimental design and results of the extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides
    试验号粉碎粒径液料比超声温度超声时间多糖得率(%)
    100008.95591
    2−10107.11861
    3−100−15.13645
    401109.33186
    5010−17.07811
    611008.37413
    7−10−105.89501
    8001−19.54675
    900009.08170
    100−1017.12575
    1110−105.45283
    1200008.88349
    13−11007.14005
    1401017.02093
    1500119.20750
    16−10015.62056
    17100−17.18341
    181−1009.19272
    1910017.48836
    2000009.50482
    2101−105.57720
    220−1109.44431
    230−1−105.85355
    2400−1−15.99030
    2500−115.65105
    2610109.86694
    270−10−16.52253
    2800008.48706
    29−1−1007.64035
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    采用Design-Expert 10软件对表2的试验数据进行响应面回归拟合,得到甘草多糖得率响应值(Y)和各因子(A、B、C、D)之间的二次回归模型为:

    Y=8.98−0.75A−0.10B+1.67C+0.055D+0.080AB−0.80AC+0.045AD+0.041BC−0.17BD+(2.500E-010)CD-1.00A2−0.47B2−0.64C2−1.31D2。对该方程的回归分析和方差分析如表3所示。

    表  3  响应面方差分析
    Table  3.  ANOVA for response surface quadratic model
    方差来源平方和自由度均方FP
    模型58.80144.209.85<0.0001**
    A6.7616.7615.850.0014**
    B0.1310.130.310.5873
    C33.65133.6578.90<0.0001**
    D0.03610.0360.0840.7759
    AB0.02510.0250.0590.8110
    AC2.5412.545.970.0284*
    AD8.024E-00318.024E-0030.0190.8929
    BC6.716E-00316.716E-0030.0160.9019
    BD0.1110.110.260.6210
    CD0.00010.0000.0001.0000
    A26.4416.4415.110.0016**
    B21.4511.453.400.0865
    C22.6912.696.300.0250*
    D211.20111.2026.250.0002**
    残差5.97140.43
    失拟项5.43100.544.030.0955
    纯误差0.5440.13
    总和64.7728
    R20.9078
    注:**表示差异极显著(P<0.01);*表示差异显著(P<0.05)。
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    表3可知,二次多项式拟合模型极显著(P<0.0001),F值为9.85,表明此模型极为显著,即各因素与其响应值之间有着极为显著的相关性。其失拟项P=0.0955>0.05并不显著,表明在实验范围内,该模型与实验数据的拟合性较好;拟合系数R2值为0.9078,可以认为模型解释了90.78%响应值的变化。由此说明,该模型可对甘草多糖得率进行分析和预测。

    表3所示,由F值可知单因素对甘草多糖得率的影响顺序依次为:C(超声温度)>A(粉碎粒径)>B(液料比)>D(超声时间),一次项A和C差异极显著(P<0.01),一次项B和D不显著(P>0.05);交互项AC显著(P<0.05),AB、AD、BC、BD和CD不显著(P>0.05);二次项A2和D2极显著(P<0.01),C2显著(P<0.05)。这表明粉碎粒径和超声温度这两个因素对甘草多糖得率具有显著的影响,其交互作用也对多糖得率具有显著的影响。

    实验数据的残差和响应设计如图2所示。图2A显示了不同水平甘草多糖响应值的残差正态分布概率图,由图可知,29组响应值较为合理地分布于一条直线两侧,且其方差无偏差显示。本实验的实验值与预测值非常接近(图2B),表明本实验所建立的模型成功地加强了四个变量参数与响应之间的联系。通过建模拟合,对内部学生化残差与29组实验运行数据进行分析(图2C),结果显示,所有数据点都位于极值之间,所有杠杆点的值都小于1,处于样本空间中心,表明实验模型中没有有效误差存在(图2D)。相反,由dfbeta值差异图(图2E)可知,29组运行数据对其回归系数都没有显著影响;Cook’D用来发现对统计量影响较大的实验数据元素,图2F显示,Cook’D的值在确定的范围内,说明29组实验数据中没有影响模型的观察值。通过以上回归诊断分析,说明本实验建立的甘草多糖提取工艺模型准确性较高,可以用于甘草多糖的提取制备。

    图  2  Box-Behnken 模型准确性诊断图
    Figure  2.  Diagnostic plots for the Box-Behnken model accuracy

    三维响应面图和等高线图是Box-Behnken响应面法建立的多元非线性模型和回归方程的直观表示[27],其等高线形状的椭圆化程度与两因素交互作用的显著程度呈正相关,椭圆化程度越大,说明交互作用越显著[28]

    图3可知,等高线近似椭圆,曲面图陡峭,说明二者的交互作用显著,结合表3中的方差分析显示,粉碎粒径与超声温度对多糖得率的交互作用与数据拟合较好,且随着超声温度的增加,多糖得率逐渐增大,而多糖得率随着粉碎粒径的增大则表现为先增大后减小的趋势,当粉碎粒径为126.57 μm时,多糖得率最高。

    图  3  粉碎粒径与超声温度交互作用对多糖得率的影响
    Figure  3.  Effect of particle size and ultrasonic temperature on extraction rate of polysaccharides

    采用Design-Expert 10软件预测超声辅助提取甘草多糖的最佳工艺参数。结果显示甘草多糖提取的最佳工艺参数为粉碎粒径126.57 μm,液料比19.3175 mL/g,超声温度65 ℃,超声时间30.1732 min,此条件下,甘草多糖的得率最高,预测值为10.6237%。为方便实验,在粉碎粒径127 μm,液料比19.32 mL/g,超声温度65 ℃,超声时间30.2 min的条件下进行验证实验。上述实验条件下得到的甘草多糖的得率为(10.867%±0.53%),与理论预测值比较接近(RSD=0.179%),说明用该模型可以较好地反映甘草多糖提取的条件。

    图4A所示,随着甘草多糖质量浓度增大,其对DPPH自由基清除率也随之升高,当浓度达到6 mg/L时曲线趋于平缓,表明在一定浓度范围内,甘草多糖对DPPH自由基清除能力与其浓度呈剂量效应关系,其最大清除率为91.00%,半数抑制率IC50值为2.80 mg/mL。在实验浓度范围内,BHT对DPPH自由基具有清除能力,且其清除率随着BHT浓度的增大而呈现增大的趋势,BHT对DPPH自由基清除能力的IC50值为4.10 μg/mL,其最大清除率高达95.89%。通过对比甘草多糖和BHT对DPPH自由基的清除作用可知,甘草多糖对DPPH自由基的清除效果显著弱于化学合成的抗氧化剂BHT。

    图  4  甘草多糖对DPPH自由基(A)和ABTS自由基(B)的清除率
    Figure  4.  Clearance of DPPH radical(A)and ABTS radical(B) by crude polysaccharides from Glycyrrhiza

    图4B所示,在实验浓度范围内,随着甘草多糖和BHT浓度的增加,二者对ABTS自由基清除能力均呈现对数增加趋势,二者对ABTS自由基清除能力的IC50值分别为1.96 mg/mL和1.36 μg/mL,最大清除率分别为85.59%(甘草多糖浓度为6 mg/mL)和99.65%(BHT浓度为8 μg/mL)。由此可见,实验所制备的甘草多糖对ABTS自由基具有清除作用,且其清除能力与甘草多糖浓度呈量效关系,但实验所制备的甘草多糖对ABTS自由基清除能力显著低于BHT,二者对ABTS自由基清除能力存在数量级差异。

    本研究采用超声波辅助提取技术,设计单因素实验和响应面优化甘草多糖提取工艺,利用软件建立回归模型预测甘草多糖的最佳提取工艺条件,实验条件下得到的甘草多糖的得率为(10.867%±0.53%)。通过体外抗氧化实验表明,实验制备的甘草多糖对DPPH自由基和ABTS自由基均有清除作用,且清除能力的强弱与多糖样品浓度存在量效关系,当甘草多糖提取物浓度为14 mg/mL和6 mg/mL时,分别对DPPH自由基和ABTS自由基清除效果最好,清除率分别为91.00%、85.59%,其IC50值分别2.80 mg/mL和1.96 mg/mL,表现出较好的体外抗氧化活性。其创新之处在于分别测定三次提取液及合并液的多糖得率,优化出最佳提取工艺,使甘草提取物充分释放,有效避免了资源的浪费。

    近年来,随着对中草药药效作用要求的提高,对中药提取工艺的技术研究也越来越受重视,然而在提取工艺上还存在一些问题,例如提取甘草以多糖得率为指标,其提取方法不同,剂量差异也较大,提取次数和提取量都会影响得率,提取工艺不同其化学组分含量也不一致,因而提取次数对甘草多糖的化学组分造成的差异还有待于进一步实验研究。

  • 图  1   粉碎粒径、液料比、超声时间、超声温度和超声功率对多糖得率的影响

    Figure  1.   Effects of particle size, liquid-material ratio, ultrasonic time, ultrasonic temperature and ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

    图  2   Box-Behnken 模型准确性诊断图

    Figure  2.   Diagnostic plots for the Box-Behnken model accuracy

    图  3   粉碎粒径与超声温度交互作用对多糖得率的影响

    Figure  3.   Effect of particle size and ultrasonic temperature on extraction rate of polysaccharides

    图  4   甘草多糖对DPPH自由基(A)和ABTS自由基(B)的清除率

    Figure  4.   Clearance of DPPH radical(A)and ABTS radical(B) by crude polysaccharides from Glycyrrhiza

    表  1   响应面试验因素与水平设计

    Table  1   Experimental factors and level of response surface design

    水平因素
    A粉碎粒径
    (μm)
    B液料比
    (mL/g)
    C超声温度
    (℃)
    D超声时间
    (min)
    −17515:14520
    015020:15530
    118025:16540
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    表  2   甘草多糖提取得率的Box-Behnken 试验设计与结果

    Table  2   Box-Behnken experimental design and results of the extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

    试验号粉碎粒径液料比超声温度超声时间多糖得率(%)
    100008.95591
    2−10107.11861
    3−100−15.13645
    401109.33186
    5010−17.07811
    611008.37413
    7−10−105.89501
    8001−19.54675
    900009.08170
    100−1017.12575
    1110−105.45283
    1200008.88349
    13−11007.14005
    1401017.02093
    1500119.20750
    16−10015.62056
    17100−17.18341
    181−1009.19272
    1910017.48836
    2000009.50482
    2101−105.57720
    220−1109.44431
    230−1−105.85355
    2400−1−15.99030
    2500−115.65105
    2610109.86694
    270−10−16.52253
    2800008.48706
    29−1−1007.64035
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    表  3   响应面方差分析

    Table  3   ANOVA for response surface quadratic model

    方差来源平方和自由度均方FP
    模型58.80144.209.85<0.0001**
    A6.7616.7615.850.0014**
    B0.1310.130.310.5873
    C33.65133.6578.90<0.0001**
    D0.03610.0360.0840.7759
    AB0.02510.0250.0590.8110
    AC2.5412.545.970.0284*
    AD8.024E-00318.024E-0030.0190.8929
    BC6.716E-00316.716E-0030.0160.9019
    BD0.1110.110.260.6210
    CD0.00010.0000.0001.0000
    A26.4416.4415.110.0016**
    B21.4511.453.400.0865
    C22.6912.696.300.0250*
    D211.20111.2026.250.0002**
    残差5.97140.43
    失拟项5.43100.544.030.0955
    纯误差0.5440.13
    总和64.7728
    R20.9078
    注:**表示差异极显著(P<0.01);*表示差异显著(P<0.05)。
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-03-21
  • 网络出版日期:  2021-09-25
  • 刊出日期:  2021-11-30

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