Detection of 7 β-agonists in Animal-derived Food based on Ionic Liquid and Pre-column Fluorescence Derivatization-High Performance Liquid Chromatography
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摘要: 以荧光衍生剂2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑和7种β-受体激动剂发生反应,达到增强7种β-受体激动剂荧光强度的目的,建立了动物性食品中7种β-受体激动剂的高效液相色谱-荧光检测方法。研究了碳酸盐缓冲溶液pH、反应温度、反应时间和2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑的浓度对衍生反应的影响。结果表明:在最优实验条件下,7种β-受体激动剂在1.0~100.0 ng/mL范围内呈良好的线性关系,线性相关系数R2>0.999,检出限约为0.30 μg/kg,定量限<1.0 μg/kg。空白猪肉、羊肉、牛肉样品在1.0、10.0、50.0 μg/kg这三个不同浓度水平进行加标实验,回收率分别为81.3%~107.3%、80.5%~110.7%和80.2%~105.1%,日内相对标准偏差分别为1.48%~13.51%、1.26%~12.33%和1.23%~11.49%,日间相对标准偏差分别为2.21%~11.54%、1.82%~13.31%和1.07%~13.21%。该方法精密度好、准确度高,抗干扰能力强,适合动物性食品中7种β-受体激动剂残留量的定性确证分析和定量分析。
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关键词:
- 2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑 /
- 荧光衍生剂 /
- β-受体激动剂 /
- 动物性食品 /
- 高效液相色谱
Abstract: In order to enhance the fluorescence intensity of 7 β-agonists, the fluorescent derivatizer 2-(4-sulfoyl chloro-phenyl) benzimidazole reacted with β-agonists, a high performance liquid chromatography-fluorescence detection method for 7 β-agonists in animal-derived food was established. Effects of pH of carbonate buffer solution, reaction temperature, reaction time and concentration of 2-(4-sulfoyl chloro-phenyl) benzimidazole on the fluorescence derivatization were investigated. The results showed that 7 β-agonists had a good linearity in the range of 1.0~100.0 ng/mL and the correlation coefficient (R2) was higher than 0.999 under the optimal conditions. The limits of detection for 7 β-agonists were about 0.30 μg/kg, and the limits of quantitation were less than 1.0 μg/kg. The recoveries of blank pork, mutton and beef samples at three different concentrations of 1.0, 10.0 and 50.0 μg/kg were 81.3%~107.3%, 80.5%~110.7% and 80.2%~105.1%, the intra-day and the inter-day relative standard deviations were 1.48%~13.51%, 1.26%~12.33%, 1.23%~11.49% and 2.21%~11.54%, 1.82%~13.31%, 1.07%~13.21%, respectively. Therefore, the developed method is suitable for determination of 7 β-agonists in animal-derived food qualitatively and quantitatively with satisfactory sensitivity, selectivity, accuracy and precision. -
β-受体激动剂属苯乙醇胺类药物,一般可分为三大类,含取代基的苯胺型(如克伦特罗)、苯酚型(如沙丁胺醇)、苯二酚型(如特布他林),结构式见图1[1-3]。该类药物的主要作用是加强心脏收缩、扩张骨骼肌血管支气管平滑肌,用于休克和哮喘的临床治疗[4-5]。β-受体激动剂类药物常被非法添加到饲料中,可以促进动物生长,减少脂肪沉积,提高瘦肉率,但长期使用会在动物组织中富集,人类食用后会产生很严重的毒副作用,从而危害人类健康[6-8]。欧美等发达国家已严禁在畜牧生产中应用[9],我国原农业部176号、1519号公告中明确规定严禁在动物饲养过程中使用该类药物,并将β-受体激动剂类列为动物源性食品中残留的重点监控药物[10-11]。
目前对β-受体激动剂的检测方法有免疫法[12-14]、电化学传感器法[15-16]、高效液相色谱法[17-18]、质谱法[19-22]等。其中,免疫法检测速度快,但易出现假阳性,稳定性和灵敏性有待提高,仅作为初筛方法,适用于大批量样品的快速筛查[3]。电化学传感器法目前还不够完善,在实际检测工作中应用较少,需进一步研究[23]。质谱法灵敏度高,重复性好,假阳性低,但仪器昂贵,过程较繁琐,前处理步骤复杂[24]。高效液相色谱是常见检测β-受体激动剂的方法,但由于受基质干扰,导致检测灵敏度降低,需要对样品进行提纯或富集预处理[25]。离子液体因不易挥发、温度范围广、对有机物无机物溶解性好、阴阳离子的组合可设计性等独特的优势而得到广泛应用,尤其在样品前处理中起到提纯和富集目标检测物的作用,达到减少基质干扰和提高检测灵敏度的目的,从而成为研究的热点[26]。陈惠芳等[27]采用绿色环保的离子液体1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和双三氟甲烷磺酰亚胺锂,超声原位合成了1-己基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐,应用于萃取富集样品中的硫酸沙丁胺醇和盐酸莱克多巴胺,建立了离子液体液液微萃取-高效液相色谱分析饲料、动物内脏和肌肉中的硫酸沙丁胺醇和盐酸莱克多巴胺的方法,该方法具有简便快捷、萃取效果好和试验仪器简单的优点。
本研究在已有研究的基础上[28-31],利用实验室合成的荧光衍生剂离子液体2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑[30]和动物性食品中β-受体激动剂发生反应,极大提高了β-受体激动剂检测灵敏度,以期达到简单、快速、准确的检测目的。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
氯化钠和碳酸钠 分析纯,天津市凯信化学工业有限公司;正己烷、乙腈和甲醇 色谱纯,北京百灵威科技有限公司;盐酸和乙酸铵 色谱纯,西陇科技股份有限公司;克伦特罗(97.5%)、莱克多巴胺(99.0%)、沙丁胺醇(98.7%)、西马特罗(99.0%)、苯乙醇胺A(99.6%)、特布他林(98.0%)、福莫特罗(96.0%) 德国Dr. Ehrenstorfer公司;邻苯二胺、苯甲酰氯、氯磺酸、丹磺酰氯 分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;1-丁基-3甲基咪唑六氟磷酸盐 本实验室合成;牛肉、羊肉和猪肉 随机购于市场及超市。
20A型液相色谱仪(荧光检测器) 日本岛津科技有限公司;RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;RX-II型离心机 天美中国科学仪器有限公司;JJ500电子天平 常熟市双杰测试仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 荧光衍生剂合成
荧光衍生剂2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑合成过程详见本实验室已发表文章[30],其合成路线见图2。
1.2.2 样品处理
称取5.00 g样品于50 mL离心管中,加入25 mL样品提取液(甲醇:0.2 mol/L盐酸:20 g/L氯化钠的体积比为1:1:1),涡旋混匀后超声提取2 min,于8000 r/min离心5 min,上清液转移至鸡心瓶中,使用5 mL提取液重复提取(甲醇:0.2 mol/L盐酸:20 g/L氯化钠的体积比为1:1:1),合并上清液至鸡心瓶中,50 ℃浓缩至小于5 mL,加入10 mL正己烷,涡旋混匀,静置分层后弃去上层正己烷,下层用蒸馏水定容至5 mL,待用[27]。
1.2.3 衍生反应
准确吸取1 mL 1.2.2处理的样液于具塞试管中,加入1 mL衍生缓冲液(pH10.0,0.1 mol/L碳酸钠溶液),1 mL衍生剂2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑溶液(2.0 mg/mL溶于丙酮),混匀后加塞,在避光的条件下85 ℃反应9 min,冷却后加入0.05 mL浓盐酸混匀,过0.45 μm的滤膜,待测。
1.2.4 标准溶液配制
分别准确称取七种β-受体激动剂标准品100 μg于100 mL容量瓶,甲醇定容配制成浓度为1.0 μg/mL的混合标准储备液,分别吸取0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mL于10.0 mL容量瓶,甲醇定容得1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 ng/mL 7种β-受体激动剂系列混合标准溶液,准确吸取1 mL按1.2.3进行衍生处理后,待测。
1.2.5 色谱条件
色谱柱:C18(4.6×250 mm)分析柱;流动相:pH3.5的乙酸铵缓冲液(v)+乙腈(v)=40+60;流速:1 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:20 μL;激发波长:365 nm,发射波长:405 nm。
1.2.6 碳酸盐缓冲溶液pH优化
本试验为了研究不同pH对衍生剂2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑与7种β-受体激动剂反应的影响,配制pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的碳酸盐缓冲溶液。不同pH条件下在猪肉中加标10.0 ng/mL 7种β-受体激动剂混合标准溶液,按照1.2.2和1.2.3步骤进行处理。
1.2.7 衍生反应温度和反应时间优化
在猪肉中加标 10.0 ng/mL 7种β-受体激动剂混合标准溶液,按照1.2.2和1.2.3步骤,在不同温度75、80、85、90、95 ℃条件下,分别反应3、6、9、12、15 min。
1.2.8 2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑浓度优化
分别配制浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL荧光衍生剂2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑。在猪肉中加标 10.0 ng/mL 7种β-受体激动剂混合标准溶液,按照1.2.2和1.2.3步骤,不同浓度荧光衍生剂2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑分别与10 ng/mL 7种β-受体激动剂混合标准溶液进行衍生反应。
1.2.9 荧光强度对比
按照步骤1.2.3分别利用2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑和丹磺酰氯衍生含有1.0 μg/kg莱克多巴胺的阳性样品,对比衍生产物荧光强度,以色谱峰面积大小评价荧光强度大小。
1.2.10 加标回收实验
对阴性样品进行加标回收实验来考察方法的准确度和精密度。按照1.2.2处理样品,各加入1.0 μg/mL的七种β-受体激动剂储备液5、50、250 μL,得到低、中、高三个不同浓度1.0、10.0、50.0 μg/kg加标水平的阳性样品,不同基质和不同加标水平的阳性样品各制备5份,依据1.2.3衍生,1.2.5测定,计算平均回收率、日内相对标准偏差和日间相对标准偏差。
1.2.11 实样分析
利用1.2.2和1.2.3步骤处理,对市场购买的10份猪肉、10份羊肉和10份牛肉样品进行定性定量分析。
1.3 数据处理
数据均采用Excel软件进行计算分析,图采用ChemDraw和Origin 8.5软件进行绘制分析。
2. 结果与分析
2.1 碳酸盐缓冲溶液pH对衍生反应的影响
由图3结果可知,随着pH的增加,7种β-受体激动剂峰面积先增加后减小,当pH为10.0时峰面积最大,说明衍生剂2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑可以快速有效的进攻β-受体激动剂中的仲胺基团,生成唯一产物,便于分析检测。当pH为酸性时,不利于衍生反应的进行;当pH为弱碱性时,衍生反应速度慢,前处理比较费时;当pH>10.0时由于碱性过强,衍生剂2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑会与目标物中仲胺基以外的基团反应,导致目标物含量减少,副产物含量增加,不利于分析检测[30]。故本实验选择pH10.0为最佳碳酸盐缓冲溶液条件。
2.2 温度和时间对衍生反应的影响
由于常温条件下,该衍生反应耗时较长,故对本实验进行加热处理,选择合理的反应温度与反应时间,从而减少前处理时间。由图4可知,随着温度和时间的增加,7种β-受体激动剂峰面积随之增加,当温度升至85 ℃,反应9 min时,峰面积基本达到最大,之后随温度和时间的增加,峰面积增加不明显。说明在温度85 ℃,反应9 min条件下衍生反应基本能反应完全,故本实验选择85 ℃环境中反应9 min为最佳衍生条件。
2.3 2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑浓度对衍生反应的影响
由图5可知,随衍生剂浓度的增加,衍生产物的峰面积也相应增加,当衍生剂浓度达到2.0 mg/mL后,衍生产物峰面积基本不再增加,说明当衍生剂浓度达到2.0 mg/mL时,能够保证衍生反应的完全进行,且衍生产物峰面积并不随衍生液浓度而增加,故本实验选择2.0 mg/mL为最佳衍生剂浓度。
2.4 荧光强度对比
2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑为苯并含氮杂环,丹磺酰氯为萘环,无给电子基团,对衍生产物的荧光强度增加作用不明显。而2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑结构中有氨基为给电子基团,能使得杂环的电子共轭区域增大,大幅增加衍生产物的荧光强度,在液相色谱中得到更强的荧光信号,从而有利于提高方法的灵敏度,更适用于痕量检测工作中。由表1可知,2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑衍生产物的荧光强度是丹磺酰氯衍生产物的1.82倍。
衍生剂 色谱峰高 色谱峰面积 2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑 5.63 35573 丹磺酰氯 2.94 19546 2.5 线性范围、检出限和定量限
按照1.2.4步骤配制标准溶液进行检测,在最佳的实验条件下测定,7种β-受体激动剂的荧光衍生产物分离度良好,且由于衍生的原因,选择性的减少基质杂质峰对目标峰的影响。以浓度为横坐标和峰面积为纵坐标绘制标准曲线,结果见表2。由表2可知,7种β-受体激动剂在1.0~100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,线性相关系数R2>0.999。以3倍信噪比(S/N)计算检出限,得到7种β-受体激动剂检出限约为0.30 μg/kg,以10倍信噪比(S/N)得到7种β-受体激动剂定量限<1.0 μg/kg。
药物名称 线性范围(ng/mL) 回归方程 相关性系数R2 检出限(μg/kg) 定量限(μg/kg) 克伦特罗 1.0~100 y=93322x−18378 0.9992 0.30 0.90 莱克多巴胺 1.0~100 y=83342x−47769 0.9994 0.25 0.75 沙丁胺醇 1.0~100 y=123338x−47769 0.9991 0.30 0.90 西马特罗 1.0~100 y=137428x−51006 0.9995 0.35 0.96 苯乙醇胺A 1.0~100 y=925730x−13268 0.9997 0.26 0.78 特布他林 1.0~100 y=875506x−28490 0.9992 0.31 0.93 福莫特罗 1.0~100 y=113648x−36067 0.9996 0.29 0.87 2.6 准确度和精密度
结果由表3可知,7种β-受体激动剂在猪肉、羊肉和牛肉中回收率分别为81.3%~107.3%、80.5%~110.7%和80.2%~105.1%,日内相对标准偏差分别为1.48%~13.51%、1.26%~12.33%和1.23%~11.49%,日间相对标准偏差分别为2.21%~11.54%、1.82%~13.31%和1.07%~13.21%,说明了本研究的方法具有良好的准确度和精密度,可以满足动物性食品中7种β-受体激动剂残留的日常检测要求。
药物名称 添加量
(μg/kg)猪肉 羊肉 牛肉 平均回收率
(%)日内RSD
(%)日间RSD
(%)平均回收率
(%)日内RSD
(%)日间RSD
(%)平均回收率
(%)日内RSD
(%)日间RSD
(%)克伦特罗 1 94.60 6.14 5.49 91.3 7.51 5.09 90.9 7.84 8.06 10 89.60 3.62 6.39 92.5 8.51 13.31 94.1 2.38 1.62 50 88.10 6.50 7.31 93.5 1.26 2.53 91.7 9.13 10.43 莱克多巴胺 1 89.90 10.53 11.54 90.5 8.72 7.99 96.4 1.50 2.79 10 87.30 5.41 3.66 90.2 3.25 5.62 91.1 4.95 4.83 50 89.10 2.42 6.54 102.5 6.60 4.93 97.5 4.55 5.14 沙丁胺醇 1 91.40 1.48 2.21 92.1 2.42 3.24 91.4 10.31 7.21 10 97.40 9.26 8.72 92.3 5.61 4.78 87.4 1.23 2.83 50 90.90 8.37 9.01 84.6 10.25 8.02 99.0 7.53 6.37 西马特罗 1 99.40 9.26 8.53 92.4 6.31 2.63 94.4 6.37 9.54 10 96.80 8.31 4.12 110.7 12.33 10.07 105.1 9.25 7.87 50 90.30 1.72 3.51 88.3 2.54 1.82 81.7 3.36 6.35 苯乙醇胺A 1 107.30 13.51 9.27 87.3 11.32 9.57 94.5 6.72 6.47 10 99.50 4.23 6.54 89.5 5.63 3.21 92.3 7.15 5.61 50 91.70 5.06 5.38 90.1 9.34 6.67 96.4 9.30 7.32 特布他林 1 84.70 5.58 3.88 93.1 4.51 3.54 90.6 3.35 2.59 10 97.40 6.32 7.09 100.2 8.73 6.95 80.2 11.49 13.21 50 87.12 1.58 2.51 84.6 5.85 7.41 99.5 1.47 1.07 福莫特罗 1 105.20 2.31 4.82 93.2 9.63 6.58 91.5 8.80 9.24 10 81.30 10.39 9.06 95.7 10.51 8.60 90.7 5.47 5.33 50 95.52 8.51 6.87 80.5 4.56 2.58 97.0 3.27 4.07 2.7 实样检测
本方法应用于市场购买的10份猪肉、10份羊肉和10份牛肉中7种β-受体激动剂的检测,结果发现30份样品中均未检测到7种β-受体激动剂。
3. 结论
在动物性食品前处理过程中应用荧光衍生剂2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑和7种β-受体激动剂反应,产物具有荧光强度高和荧光性能稳定的特点,建立了高效液相色谱-荧光检测器检测动物性食品中7种β-受体激动剂的方法。优化了反应最优条件为碳酸盐缓冲液pH为10.0、85 ℃温度下反应9 min、2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑的浓度2.0 mg/mL。方法的线性范围为1.0~100 ng/mL,相关系数为R2>0.999,检出限约为0.30 μg/kg,定量限为<1.0 μg/kg。该方法荧光衍生剂能高效快速地与β-受体激动剂中仲胺基基团发生反应,副产物少,最大程度提高衍生产物荧光强度,提高检测灵敏度,精密度和准确度高。且该检测方法前处理简单易操作,无需固相萃取操作,适用于猪肉、牛肉和羊肉中β-受体激动剂残留的批量检测。
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表 1 两种衍生剂荧光强度比较
Table 1 Comparison of fluorescence intensity of two derivatives
衍生剂 色谱峰高 色谱峰面积 2-(4-磺酰氯基苯基)苯并咪唑 5.63 35573 丹磺酰氯 2.94 19546 表 2 7种β-受体激动剂线性方程、检出限和定量限
Table 2 Linear equations, detection limits and quantification limits of 7 β-agonists
药物名称 线性范围(ng/mL) 回归方程 相关性系数R2 检出限(μg/kg) 定量限(μg/kg) 克伦特罗 1.0~100 y=93322x−18378 0.9992 0.30 0.90 莱克多巴胺 1.0~100 y=83342x−47769 0.9994 0.25 0.75 沙丁胺醇 1.0~100 y=123338x−47769 0.9991 0.30 0.90 西马特罗 1.0~100 y=137428x−51006 0.9995 0.35 0.96 苯乙醇胺A 1.0~100 y=925730x−13268 0.9997 0.26 0.78 特布他林 1.0~100 y=875506x−28490 0.9992 0.31 0.93 福莫特罗 1.0~100 y=113648x−36067 0.9996 0.29 0.87 表 3 猪肉、羊肉、牛肉中7种β-受体激动剂的平均回收率和日内、日间相对标准偏差
Table 3 Average recoveries, intra-RSD and inter-RSD of 7 β-agonists in pork, mutton and beef
药物名称 添加量
(μg/kg)猪肉 羊肉 牛肉 平均回收率
(%)日内RSD
(%)日间RSD
(%)平均回收率
(%)日内RSD
(%)日间RSD
(%)平均回收率
(%)日内RSD
(%)日间RSD
(%)克伦特罗 1 94.60 6.14 5.49 91.3 7.51 5.09 90.9 7.84 8.06 10 89.60 3.62 6.39 92.5 8.51 13.31 94.1 2.38 1.62 50 88.10 6.50 7.31 93.5 1.26 2.53 91.7 9.13 10.43 莱克多巴胺 1 89.90 10.53 11.54 90.5 8.72 7.99 96.4 1.50 2.79 10 87.30 5.41 3.66 90.2 3.25 5.62 91.1 4.95 4.83 50 89.10 2.42 6.54 102.5 6.60 4.93 97.5 4.55 5.14 沙丁胺醇 1 91.40 1.48 2.21 92.1 2.42 3.24 91.4 10.31 7.21 10 97.40 9.26 8.72 92.3 5.61 4.78 87.4 1.23 2.83 50 90.90 8.37 9.01 84.6 10.25 8.02 99.0 7.53 6.37 西马特罗 1 99.40 9.26 8.53 92.4 6.31 2.63 94.4 6.37 9.54 10 96.80 8.31 4.12 110.7 12.33 10.07 105.1 9.25 7.87 50 90.30 1.72 3.51 88.3 2.54 1.82 81.7 3.36 6.35 苯乙醇胺A 1 107.30 13.51 9.27 87.3 11.32 9.57 94.5 6.72 6.47 10 99.50 4.23 6.54 89.5 5.63 3.21 92.3 7.15 5.61 50 91.70 5.06 5.38 90.1 9.34 6.67 96.4 9.30 7.32 特布他林 1 84.70 5.58 3.88 93.1 4.51 3.54 90.6 3.35 2.59 10 97.40 6.32 7.09 100.2 8.73 6.95 80.2 11.49 13.21 50 87.12 1.58 2.51 84.6 5.85 7.41 99.5 1.47 1.07 福莫特罗 1 105.20 2.31 4.82 93.2 9.63 6.58 91.5 8.80 9.24 10 81.30 10.39 9.06 95.7 10.51 8.60 90.7 5.47 5.33 50 95.52 8.51 6.87 80.5 4.56 2.58 97.0 3.27 4.07 -
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