Establishment and Application of HPLC-FLD Method for Fipronil Sulfoxide Detection by Pre-column Fluorescence Derivatization
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摘要: 建立了氟虫腈代谢物-氟虫腈亚砜的柱前荧光衍生化方法，并将其应用于鸡蛋中的残留检测。优化后的柱前荧光衍生化反应主要条件如下：催化缩合剂为EDC/DMAP；反应溶剂为二氯甲烷；氟虫腈亚砜与荧光衍生试剂的用量比为1:8；45 ℃水浴中反应75 min。衍生产物为N-（3-氰基-1-（2, 6-二氯-4-（三氟甲基）苯基)-4-（（三氟甲基）硫代）-1H-吡唑-5-基）-4-（2-（9-乙基-9H-咔唑-3-基）-1H-菲并[9, 10-d]咪唑-1-基）丁酰胺（DX1），具有很高的荧光强度。衍生化产物DX1的高效液相色谱-荧光检测（HPLC-FLD）的主要条件如下：C18色谱柱；等度洗脱；流动相：乙腈/水（80/20，v/v）；流速：1.0 mL/min；λex=310 nm，λem=404 nm；进样量20 μL；柱温40 ℃。在上述检测条件下，氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的检测限为0.033 μg/L，定量限为0.092 μg/L。在此基础上，建立了鸡蛋残留氟虫腈亚砜提取和检测的HPLC-FLD方法，检测限和定量限分别达到了0.052和0.132 µg/kg，精密度、稳定性和重现性在保留时间和峰面积上的RSD分别小于0.04%和2.7%，上机检测可在20 min内完成。该方法具有较好的灵敏度、精确性和可靠性，可应用于鸡蛋中残留氟虫腈亚砜的检测。
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关键词:
- 氟虫腈亚砜 /
- 柱前荧光衍生化 /
- 高效液相色谱-荧光检测 /
- 氟虫腈代谢物 /
- 定量检测
Abstract: A method of precolumn fluorescence derivatization of fipronil sulfoxide (a metabolite of fipronil) was established and applied in the residue detection of chicken eggs. The main optimized parameters of precolumn fluorescence derivatization were as follows: catalyzer for condensation: EDC/DMAP; reaction solvent: dichloromethane; ratio of fipronil sulfoxide to fluorescence derivatization reagent: 1/8; reaction temperature: 45 ℃ (water bath); reaction time: 75 min. The target product of the fluorescence derivatization reaction was (N-(3-cyano-1-(2, 6-dichloro-4-(trifluoromethyl)phenyl)-4-((trifluoromethyl)thio)-1H-pyrazol-5-yl)-4-(2-(9-ethyl-9H-carbazol-3-yl)-1H-phenanthro[9, 10-d]imidazol-1-yl)butanamide (DX1), with high fluorescence intensity when excited. The main conditions for HPLC-FLD of DX1 were as following: C18 chromatographic column; isocratic elution; mobile phase: acetonitrile/water (80/20, v/v), flow rate: 1.0 mL/min, wavelength of the exciting light: 310 nm, emission wavelength: 404 nm, injection volume: 20 μL, column temperature: 40 ℃. Under the above-mentioned conditions, the limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were 0.033 and 0.092 μg/L respectively. Meanwhile, the extraction and determination method for the residual fipronil sulfoxide in chicken eggs were further developed with a LOD of 0.052 µg/kg and a LOQ of 0.132 µg/kg, whose RSDs of the retention time and peak area of precision, stability and reproducibility were respectively less than 0.04% and 2.7%. What's more, the operation of the HPLC-FLD detection could be completed in 20 min. The method had good sensitivity, accuracy and reliability, and could be used to the determination of residual fipronil sulfoxide in eggs. -
氟虫腈（fipronil），又名锐劲特，是罗纳-普朗克公司（Rhone-Poulenc，法国）于1987年研制的一种新型含氯、氟的苯基吡唑类杀虫剂[1]。该物质于1993年作为杀虫剂投入到市场中，我国于1994年开始将其应用于虫害防治，由于杀虫效果好、使用剂量低、有效作用时间长，曾在农业生产中被广泛地使用，但其自然降解较慢，可通过食物链富集，且其对人体有较强的毒性，因此对人类健康和安全有较大的危害[2-4]。氟虫腈可转化生成其他化合物[5]，如厌氧条件下可转化为氟虫腈亚砜（fipronil sulfide）[6]，而氟虫腈亚砜又可光解成氟甲腈，进而氧化形成氟虫腈砜[7]。氟虫腈亚砜与氟虫腈均具有较强的毒性，其毒性甚至高于其母体氟虫腈[8-10]，研究表明，氟虫腈亚砜经代谢可分布于体内不同组织和器官中，存留时间较长，可蓄积产生毒性作用[11-13]。因此，对农产品中氟虫腈亚砜残留进行检测和控制是非常有必要的。
目前在研究或使用的氟虫腈亚砜检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）以及高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）等。龚震等[14]采用固相萃取-高效液相色谱法对鸡蛋中残留的氟虫腈亚砜进行了检测，结果显示检出限和定量限分别为60、200 μg/kg；戴尽波等[15]建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS /MS）检测禽源性食品中氟虫腈亚砜的方法，其检测限在0.1~0.2 μg/kg之间，定量限为0.5 μg/kg。吴洁珊等[16]建立了气相色谱快速测定氟虫腈亚砜残留量的分析方法，其检出限和定量限分别为0.2和0.5 μg/kg；高霞等[17]的报道表明，气相色谱-负化学源电离-质谱法（GC-NCI/MS）测定蔬菜中氟虫腈亚砜残留量的检测限在0.2~0.3 μg/kg之间，定量限为1.0 μg/kg。从目前的氟虫腈亚砜检测研究报道来看，HPLC法操作简单易行，但无法满足痕量检测的要求；HPLC-MS法虽然具有较高的灵敏度和较低检测限，但需要高端精密的仪器设备，成本较高；GC法有一定的灵敏度，但不适用沸点高、遇热不稳定的物质，应用范围受限；GC-MS检测虽然所需样品少且快速，但也需要贵重设备，干扰也较多，同时检测范围也受限。因此，探索高灵敏度、低成本、简便快速的氟虫腈亚砜痕量检测方法是很有必要的，对氟虫腈亚砜残留检测与控制有重要意义。
高效液相色谱-荧光检测方法（HPLC-FLD）灵敏度较高，结果稳定可靠，是目前研究和应用的重要痕量检测方法。赵文晋等[18]建立了一种测定水样中苯胺的HPLC-FLD检测法，检出限可达0.022 μg/L，定量限为0.073 μg/L。目前尚未见关于氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法方面的研究报道。本文基于实验室前期合成的、结构新颖的、高荧光强度的咔唑类荧光衍生试剂L2，建立了氟虫腈亚砜柱前荧光衍生HPLC-FLD检测方法，以期为鸡蛋中氟虫腈亚砜残留痕量检测提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
氟虫腈亚砜（HPLC≥98%） 本实验室合成；荧光衍生试剂L2（HPLC≥98%） 本实验室合成；二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、氯化钠和无水硫酸钠 分析纯，西陇科学股份有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和N,N-二环己基碳酰亚胺（DCC） 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司采购；乙腈 色谱纯，美国Tieda试剂有限公司；三乙胺（TEA）和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP） 分析纯，西宝生物科技（上海）股份有限公司；四氢呋喃 化学纯，国药集团化学试剂有限公司；二甲基亚砜（纯度为99%） 上海索来宝科技有限公司；鸡蛋样品 市购。
DEAAXO4033高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）、GC-MS5975C质谱仪 美国安捷伦科技有限公司；400/500MHZ Advance核磁共振波谱仪 布鲁克科技有限公司；MR Hei-End恒温加热磁力搅拌器 德国海道夫集团；FSH-2A高速匀浆机 金坛区西城新瑞仪器厂；TD4低速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；HZQ-2冷冻恒温振荡器 金坛市国旺实验仪器厂；Precision MLG3旋转蒸发仪 德国海道夫集团；超纯水制备仪 美国Milli-Q科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 氟虫腈亚砜柱前荧光衍生化方法
1.2.1.1 柱前荧光衍生化反应的原理和操作步骤
反应原理：荧光衍生试剂L2的羧基与氟虫腈亚砜的氨基之间进行脱水缩合，经酰胺化反应后生成荧光衍生化产物DX1，反应如图1所示。具体操作步骤如下：向2 mL安瓿瓶中依次加入600 µL二氯甲烷（DCM）、200 µL浓度为0.1 mol/L的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、200 µL浓度为0.2 mol/L的4-二甲氨基吡啶（DMAP）、50 µL浓度为1.0×10−3 mol/L的氟虫腈亚砜和800 µL浓度为5.0×10−4 mol/L的荧光衍生试剂L2，以上溶液均用乙腈溶解，密封；充分混匀后置于45 ℃水浴中振荡反应75 min；随后取出冷却至室温，乙腈定容至10 mL；取样进行HPLC-FLD检测。
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图 1 氟虫腈亚砜与荧光衍生试剂L2柱前衍生化反应方程式Figure 1. Reaction equation of precolumn fluorescence derivatization reaction between L2 and fipronil sulfide1.2.1.2 荧光衍生化反应参数优化试验设计
为了提高衍生效率，以衍生化反应后HPLC-FLD检测所得的衍生产物DX1的峰面积作为衡量指标，采用单因素试验对衍生化反应主要条件进行了优化，试验梯度水平设置如下：a.催化剂：选取EDC/DMAP、DCC/DMAP和PyBOP/TEA三种催化剂进行试验，其他试验条件如下：反应时间30 min、反应温度45 ℃、荧光衍生试剂与氟虫腈亚砜的用量比6:1、反应溶剂为乙腈；b.反应时间：选取15、30、45、60、75、90、105、120 min不同反应时间进行试验，其他试验条件如下：以EDC/DMAP为催化剂、反应温度45 ℃、荧光衍生试剂与氟虫腈亚砜的用量比6:1、反应溶剂为乙腈；c.反应温度：选取5、15、25、35、45、55、65 ℃不同反应温度进行试验，其他试验条件如下：以EDC/DMAP为催化剂、反应时间为75 min、荧光衍生试剂与氟虫腈亚砜的用量比6:1、反应溶剂为乙腈；d. n（荧光衍生试剂）/n（氟虫腈亚砜）：选取荧光衍生试剂与氟虫腈亚砜用量比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1进行试验，其他试验条件如下：以EDC/DMAP为催化剂、反应时间为75 min、反应温度45 ℃、反应溶剂为乙腈；e.反应溶剂：选取DCM、THF、乙腈、DMF、DMSO五种溶剂进行试验，其他试验条件如下：以EDC/DMAP为催化剂、反应时间为75 min、反应温度45 ℃、荧光衍生试剂与氟虫腈亚砜的用量比8:1。
1.2.2 荧光衍生化反应产物分离、纯化及表征方法
1.2.2.1 荧光衍生化反应产物的分离和纯化
以EDC/DMAP为催化缩合剂、二氯甲烷为反应溶剂，氟虫腈亚砜与荧光衍生试剂L2的用量比为1:8，在45 ℃水浴中反应75 min；反应结束后，以硅胶柱层析法对衍生产物N-（3-氰基-1-（2,6-二氯-4-（三氟甲基）苯基）-4-（（三氟甲基）硫代）-1H-吡唑-5-基）-4-（2-（9-乙基-9H-咔唑-3-基）-1H-菲并[9,10-d]咪唑-1-基）丁酰胺（DX1）进行分离和纯化。
1.2.2.2 荧光衍生化反应产物的结构表征
分离、纯化后的衍生化产物DX1，采用1H NMR、13C NMR和HRMS等波谱检测技术进行结构鉴定与表征。
1.2.2.3 荧光衍生化反应产物的荧光特性表征
以乙腈为溶剂，采用荧光分光光度计对DX1的荧光光谱性质进行扫描检测。荧光扫描的狭缝设置为10 nm/10 nm，以最大吸收波长进行激发，通过扫描获取发射波长；同时，根据所测定的发射波长与激发波长计算Stokes位移[19-20]。
1.2.3 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜的提取方法
根据GB 23200.115-2018 所述的方法，提取鸡蛋中残留的氟虫腈代谢物-氟虫腈亚砜和进行测前处理[21]。将样品鸡蛋去壳，以匀浆机充分混合均匀；准确称量5 g鸡蛋匀浆液（精确至 0.01 g），置于 50 mL 离心管，加入 20 mL 色谱纯乙腈溶液；手动振荡混合 1 min，再以恒温振荡器振荡 5 min；随后向离心管中依次添加2 g 氯化钠和 6 g 无水硫酸钠，再手动振荡混合 1 min；在 4000 r/min 下离心 10 min；取上清液，4 ℃ 冰箱保存、待测。
1.2.4 氟虫腈亚砜柱前荧光衍生化产物 HPLC-FLD检测方法
主要检测条件如下：Symmetry C18 色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm；柱温为 40 ℃；流速为 1.0 mL/min；进样量为 20 μL；流动相 A：100% 纯乙腈；流动相 B：超纯水；洗脱方式：等度洗脱，A 相为 80%，B 相为 20%；激发波长和发射波长：分别为 310 和 404 nm。色谱柱在检测前以流动相平衡 10 min，所有检测样品在进样前均以 0.22 μm 滤膜过滤。
1.2.5 方法学考察
1.2.5.1 加标回收率
准确称取5 g新鲜鸡蛋匀浆液，分别添加5、1、0.1 µg氟虫腈亚砜标准品，按照1.2.3中所述的方法提取鸡蛋样品中的氟虫腈亚砜，并以L2为荧光衍生试剂按1.2.1所述的方法分别进行柱前荧光衍生化反应，再按1.2.4中所述的HPLC-FLD检测方法进行测定，计算加标回收率。
1.2.5.2 检测限和定量限计算方法
参照贾离离等[22]的方法，以3倍信噪比计算检测限和10倍信噪比计算定量限，建立检测回归方程。
1.2.5.3 精密度、稳定性和重现性评价方法
分别参照Madrera等[23]、Xiong等[24]、于海英等[25]的方法，进行精密度、稳定性及重现性的评价。精密度：连续进样6次进行HPLC-FLD检测，分别记录衍生化产物DX1的保留时间和峰面积，计算其相对标准偏差（RSD）。稳定性：待测衍生化产物于室温下放置，分别在第1、2、4、8、24 h进行进样检测，计算衍生产物DX1保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）。重现性：按照1.2.2中所述的方法，重复进行6次柱前荧光衍生化反应试验，上样检测DX1的保留时间和峰面积，计算相对标准偏差（RSD）。
1.3 数据处理
本文所有试验数据均采用GraphPad Prism和SPSS软件进行统计分析，每组样品设置3个重复，分别进行3次平行测定，数据结果以平均值±标准偏差表示。
2. 结果与分析
2.1 氟虫腈亚砜柱前荧光衍生化反应条件的优化
2.1.1 催化剂的优选
本文所设计的氟虫腈亚砜柱前荧光衍生化反应是一种脱水缩合反应，荧光衍生试剂L2的羧基与氟虫腈亚砜的氨基之间进行酰胺化反应，脱水缩合形成荧光衍生化产物DX1。根据已有文献报道[26-29]，本文选择“DCC/DMAP”、“EDC/DMAP”和“PyBOP/TEA”三种碱性催化剂来进行试验，以优选出高效率的催化剂。试验结果（如图2a）表明，三种催化剂的效果差异非常显著，以PyBOP/TEA为催化剂，衍生化反应基本上不会发生；DCC/DMAP能促进衍生化反应，但效率显著低于EDC/DMAP；在本文所设定的条件下，EDC/DMAP的催化效率最高。因此，EDC/DMAP为该反应的优选催化剂。
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图 2 催化剂、反应时间、反应温度、衍生试剂与氟虫腈亚砜的用量比及反应溶剂对氟虫腈亚砜衍生化效率的影响注：a：催化剂的影响；b：反应时间的影响；c：反应温度的影响；d：衍生试剂的影响；e：反应溶剂的影响。图a、e中大写字母表示差异极显著（P<0.01）；小写字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 2. Influence of catalyzer, reaction time, reaction temperature, ratio of fipronil sulfoxide to fluorescence derivatization reagent, and reaction solvent on the derivatizing efficiency of fipronil2.1.2 反应时间的优化
本文设置了15~105 min六个反应时间进行单因素实验，结果如图2b所示。在15~75 min内，衍生化产物的产量呈现线性、快速上升的趋势；75 min时产量达到最大；而后再延长反应时间，会导致产量上的小幅下降。因此，确定75 min为优选反应时间。
2.1.3 反应温度的优化
如图2c所示，在反应时间设定为75 min时，温度对衍生化产物的产量有较大的影响。当温度从5 ℃上升到45 ℃时，产量呈上升的趋势，特别是从35 ℃升到45 ℃时，产量出现了激增；继续升温，产量有下降的趋势。由此可知，45 ℃为比较合适的衍生化反应温度。
2.1.4 衍生试剂用量的优化
衍生试剂的用量对衍生反应有重要影响[30]，本文选择了11个用量进行优化试验。由图2d可知，随着荧光衍生试剂L2用量的增加，衍生产物DX1的产量持续增大，在n（荧光衍生试剂）/n（氟虫腈亚砜）为8:1时，产量达到峰值；如果继续增加用量，产量反应会出现明显的下降。上述结果表明，衍生化反应在n（荧光衍生试剂）/n（氟虫腈亚砜）等于8:1时效果最佳。
2.1.5 反应溶剂的优选
本文选取二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）、二甲基亚砜（DMSO）以及乙腈五种常用的衍生化反应溶剂进行单因素实验，以选择出合适的反应溶剂，结果如图2e所示。通过试验发现，荧光衍生试剂L2和氟虫腈亚砜在DCM中反应较为完全，目标物产量显著高于其它四种溶剂，其次是乙腈。从结果来看，THF、DMF和DMSO不适合作为衍生反应的溶剂。在DCM中衍生化反应效果较好，可能是因为DCM对各反应物都具有良好的溶解性，具体的机制有待于进一步研究。据此，确定DCM为优选衍生化反应溶剂。
综上所述，氟虫腈亚砜柱前衍生化反应的优选条件如下：EDC/DMAP为催化剂，反应时间和衍生温度分别为75 min、45 ℃，荧光生试剂用量为n（荧光衍衍生试剂）/n（氟虫腈亚砜）=8:1，二氯甲烷为反应溶剂。
2.2 柱前荧光衍生化产物DX1的结构和荧光特性表征
2.2.1 DX1结构检测与表征
衍生产物DX1：本文采用荧光衍生试剂L2对氟虫腈亚砜进行柱前衍生化，所设计的目标衍生化产物为N-（3-氰基-1-（2,6-二氯-4-（三氟甲基）苯基）-4-（（三氟甲基）硫代）-1H-吡唑-5-基）-4-（2-（9-乙基-9H-咔唑-3-基）-1H-菲并[9,10-d]咪唑-1-基）丁酰胺（N-（3-cyano-1-（2,6-dichloro-4-（trifluoromethyl）phenyl）-4-（（trifluoromethyl）thio）-1H-pyrazol-5-yl）-4-（2-（9-ethyl-9H-carbazol-3-yl）-1H-phenanthro[9,10-d]imidazol-1-yl）butanamide），命名为DX1。经分离、纯化和1H NMR、13C NMR和HRMS等检测分析，确认所得的衍生化产物是所设计的目标物。DX1主要结构表征数据如下：
DX1：白色固体，产率76.4%。1H NMR（400 MHz, DMSO）δ13.39（s, 1H）, 9.07（d, J=1.2 Hz, 1H）, 8.87（dd, J=13.2, 8.3 Hz, 2H）, 8.62（dd, J=22.1, 7.7 Hz, 2H）, 8.45（dd, J=8.6, 1.5 Hz, 1H）, 8.29（d, J=7.7 Hz, 1H）, 7.84（d, J=8.6 Hz, 1H）, 7.76（dt, J=11.0, 7.5 Hz, 2H）, 7.71–7.60（m, 3H）, 7.53（t, J=7.3 Hz, 1H）, 7.31（t, J=7.4 Hz, 1H）, 5.56（d, J=7.9 Hz, 2H）, 4.54（q, J=7.1 Hz, 2H）, 1.70（dd, J=16.1, 13.0 Hz, 2H）, 1.61（dd, J=9.0, 3.8 Hz, 2H）, 1.24（s, 3H）. 13C NMR（101 MHz, DMSO）δ156.58, 150.49, 140.07, 127.40, 127.01, 126.22, 123.70, 122.47, 121.89, 120.41, 119.34, 118.27, 109.49, 47.47, 37.17, 33.31, 25.29, 24.42, 13.77. Calcd for C45H29Cl2F6N7OS: 899.1436, HRMS（ESI）m/z [M+H]+: found 900.1508.
2.2.2 DX1荧光特性检测与表征
荧光扫描检测结果（如图3所示）表明，衍生化产物DX1与荧光衍生试剂L2的荧光光谱特征基本相同，L2的最大激发波长和发射波长分别为310和398 nm，斯托克斯位移为88 nm；DX1的最大激发波长和发射波长分别为310和404 nm, 斯托克斯位移为94 nm，两者的最大激发波长相同，但DX1的最大发射波长比L2增加6 nm，即Stokes位移增大了6 nm，较大的Stokes位移大大减少了检测时激发光对发射光的干扰，保证了检测的准确性。DX1的高荧光强度和较大的Stokes位移，为建立灵敏、准确、可靠的柱前衍生化HPLC-FLD方法检测痕量氟虫腈亚砜残留提供了保证。
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图 3 荧光衍生试剂L2和氟虫腈亚砜衍生化产物DX1的荧光光谱扫描图注：a：L2荧光光谱扫描图；b：DX1荧光光谱扫描图。Figure 3. Spectrograms of fluorescence scanning of fluorescent derivatization reagent L2 and its derivative DX12.3 氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的建立和评价
2.3.1 氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的线性回归方程及检测限和定量限
基于前述柱前衍生化反应优化条件和氟虫腈亚砜柱前衍生化产物DX1的HPLC-FLD检测条件，所建立的氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的线性回归方程为Y=194.95X−0.0609（如表1），该回归方程的相关系数r达到了0.9999，展现出了良好的线性相关性。此外，该方法的检测限和定量限分别达到了0.033和0.092 µg/L，具有很高的灵敏度。
表 1 氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的线性回归方程、相关系数、检测限和定量限Table 1. Linear regression equation, determination coefficient, LOD and LOQ of fipronil sulfide determination by HPLC-FLD待测物名称 线性回归方程 线性相关系数
（r）检测限
（µg/L）定量限
（µg/L）DX1 Y=194.95X−0.0609 0.9999 0.033 0.092 2.3.2 氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的的重现性、稳定性和精密度
氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的的重现性、稳定性和精密度如表2所示。从表2的数据可知，这三个评价指标的保留时间的RSD均低于0.07%，峰面积的RSD均低于2.1%。这些方法学评价数据表明，所建立的检测方法稳定、可靠，可应用于实际样品的检测。
表 2 氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的精密度、稳定性和重现性Table 2. Precision, stability and reproducibility of fipronil sulfide determination by HPLC-FLD评价指标 平均值±标准偏差（Mean±SD） 相对标准偏差（RSD,%） 精密度 保留时间（min） 8.568±0.0034 0.040 峰面积 106.93±2.238 2.093 稳定性 保留时间（min） 8.454±0.0019 0.023 峰面积 107.57±0.951 0.884 重现性 保留时间（min） 8.474±0.0055 0.065 峰面积 78.003±1.399 1.793 2.4 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的建立和评价
2.4.1 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的加标回收率
由表3可知，本文所建立的鸡蛋中残留氟虫腈及其代谢物HPLC-FLD检测方法的加标回收率在84.68%~94.50%范围之内，重复性RSD低于1%，相对标准偏差（RSD）为1.05%~3.65%，表明该方法具有很好的回收率，提取、衍生化和检测的结果是比较可靠的。
表 3 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜柱前衍生化HPLC-FLD检测的加标回收率Table 3. Recovery rate of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization待测物名称 添加量（mg/kg） 平均加标回收率（%） 相对标准偏差RSD（%） 重复性RSD（%） 氟虫腈亚砜 0.01 84.68 3.65 0.82 0.1 87.85 1.05 0.75 0.5 94.50 2.98 0.91 2.4.2 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的检测限、定量限和灵敏度
方法学评价结果表明，本文建立的鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的检测限和定量限分别达0.052和0.132 µg/kg（如表4），具有较好的灵敏度。戴尽波等[15]建立了禽源性食品中残留氟虫腈亚砜的UPLC-MS/MS检测方法，检测限为0.1~0.2 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg。根据高霞等[17]的报道，GC-NCI/MS测定蔬菜中残留氟虫腈亚砜的检出限在0.2~0.3 μg/kg之间，定量限为1.0 μg/kg。从检测限和定量限这两个重要的方法学评价指标来看，本文建立的鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法已优于HPLC-MS和GC-MS。
表 4 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的检测限、定量限和灵敏度Table 4. LOD and LOQ of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization待测物名称 检测限LOD
（µg/kg）定量限LOQ
（µg/kg）灵敏度 氟虫腈亚砜 0.052 0.132 65.5 2.4.3 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的精密度、稳定性和重现性
由表5数据可知，本文建立的鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的精密度、稳定性和重现性三个指标的保留时间RSD均低于0.04%，峰面积的RSD值均低于2.7%，表明方法稳定、可靠。
表 5 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的精密度、稳定性和重现性Table 5. Precision, stability and reproducibility of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization评价指标 平均值±标准偏差（Mean±SD） 相对标准偏差（RSD,%） 精密度 保留时间（min） 8.340±0.0028 0.034 峰面积 89.403±1.641 1.836 稳定性 保留时间（min） 8.46±0.0018 0.021 峰面积 109.693±1.878 1.712 重现性 保留时间（min） 8.42±0.0033 0.039 峰面积 116.718±3.116 2.670 2.4.4 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜的检测结果与分析
采用本文所建立的HPLC-FLD检测方法，对所采集的源自于5个省的25份鸡蛋样品中的残留氟虫腈亚砜进行了检测与分析，结果表明（如表6和图4），所有的25份样品中均未检测出氟虫腈亚砜，说明本文采样点产地的鸡蛋在氟虫腈亚砜残留这个指标上是安全的。
表 6 五省二十五份鸡蛋样品残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测结果Table 6. Determination results of residual fipronil sulfide in 25 sample eggs collected from 5 provinces by HPLC-FLD样品地区 取样数 氟虫腈亚砜平均检测值（µg/kg） 检测结果 江西 5 0 未检出 湖北 5 0 未检出 山东 5 0 未检出 河南 5 0 未检出 安徽 5 0 未检出 ![]()
图 4 鸡蛋样品中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测色谱图注：峰P1：氟虫腈亚砜和荧光试剂L2的荧光衍生产物DX1。Figure 4. Chromatograms of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in sample eggs3. 结论
本文建立并优化了氟虫腈亚砜的柱前荧光衍生化方法，优化后的主要反应条件如下：催化缩合剂为EDC/DMAP；反应溶剂为二氯甲烷；氟虫腈亚砜与荧光衍生试剂的用量比为1:8；45 ℃水浴中反应75 min。衍生化所生成的目标产物DX1具有很高的荧光强度。基于荧光衍生化反应优化条件和产物荧光特征，建立了氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法，其检测限为0.033 μg/L，定量限为0.092 μg/L。在此基础上，建立鸡蛋残留氟虫腈亚砜提取和检测的HPLC-FLD方法，检测限和定量限分别达0.052和0.132 µg/kg，精密度、稳定性和重现性在保留时间和峰面积上的RSD分别小于0.04%和2.7%。上述结果表明，本文建立的氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法较为灵敏可靠，在鸡蛋氟虫腈亚砜残留检测中具有较好的应用前景。但氟虫腈在体内的代谢比较复杂，还有氟甲腈和氟虫腈砜等代谢物，本文仅对氟虫腈亚砜建立了检测方法，后续还需建立和完善氟虫腈其它代谢物的检测方法，为氟虫腈及其代谢物的检测与控制提供支撑。
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图 1 氟虫腈亚砜与荧光衍生试剂L2柱前衍生化反应方程式
Figure 1. Reaction equation of precolumn fluorescence derivatization reaction between L2 and fipronil sulfide
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图 2 催化剂、反应时间、反应温度、衍生试剂与氟虫腈亚砜的用量比及反应溶剂对氟虫腈亚砜衍生化效率的影响
注：a：催化剂的影响；b：反应时间的影响；c：反应温度的影响；d：衍生试剂的影响；e：反应溶剂的影响。图a、e中大写字母表示差异极显著（P<0.01）；小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 2. Influence of catalyzer, reaction time, reaction temperature, ratio of fipronil sulfoxide to fluorescence derivatization reagent, and reaction solvent on the derivatizing efficiency of fipronil
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图 3 荧光衍生试剂L2和氟虫腈亚砜衍生化产物DX1的荧光光谱扫描图
注：a：L2荧光光谱扫描图；b：DX1荧光光谱扫描图。
Figure 3. Spectrograms of fluorescence scanning of fluorescent derivatization reagent L2 and its derivative DX1
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图 4 鸡蛋样品中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测色谱图
注：峰P1：氟虫腈亚砜和荧光试剂L2的荧光衍生产物DX1。
Figure 4. Chromatograms of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in sample eggs
表 1 氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的线性回归方程、相关系数、检测限和定量限
Table 1 Linear regression equation, determination coefficient, LOD and LOQ of fipronil sulfide determination by HPLC-FLD
待测物名称 线性回归方程 线性相关系数
（r）检测限
（µg/L）定量限
（µg/L）DX1 Y=194.95X−0.0609 0.9999 0.033 0.092 
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表 2 氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的精密度、稳定性和重现性
Table 2 Precision, stability and reproducibility of fipronil sulfide determination by HPLC-FLD
评价指标 平均值±标准偏差（Mean±SD） 相对标准偏差（RSD,%） 精密度 保留时间（min） 8.568±0.0034 0.040 峰面积 106.93±2.238 2.093 稳定性 保留时间（min） 8.454±0.0019 0.023 峰面积 107.57±0.951 0.884 重现性 保留时间（min） 8.474±0.0055 0.065 峰面积 78.003±1.399 1.793
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表 3 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜柱前衍生化HPLC-FLD检测的加标回收率
Table 3 Recovery rate of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization
待测物名称 添加量（mg/kg） 平均加标回收率（%） 相对标准偏差RSD（%） 重复性RSD（%） 氟虫腈亚砜 0.01 84.68 3.65 0.82 0.1 87.85 1.05 0.75 0.5 94.50 2.98 0.91
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表 4 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的检测限、定量限和灵敏度
Table 4 LOD and LOQ of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization
待测物名称 检测限LOD
（µg/kg）定量限LOQ
（µg/kg）灵敏度 氟虫腈亚砜 0.052 0.132 65.5
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表 5 鸡蛋中残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测方法的精密度、稳定性和重现性
Table 5 Precision, stability and reproducibility of HPLC-FLD determination of fipronil sulfide in eggs by pre-column derivatization
评价指标 平均值±标准偏差（Mean±SD） 相对标准偏差（RSD,%） 精密度 保留时间（min） 8.340±0.0028 0.034 峰面积 89.403±1.641 1.836 稳定性 保留时间（min） 8.46±0.0018 0.021 峰面积 109.693±1.878 1.712 重现性 保留时间（min） 8.42±0.0033 0.039 峰面积 116.718±3.116 2.670
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表 6 五省二十五份鸡蛋样品残留氟虫腈亚砜HPLC-FLD检测结果
Table 6 Determination results of residual fipronil sulfide in 25 sample eggs collected from 5 provinces by HPLC-FLD
样品地区 取样数 氟虫腈亚砜平均检测值（µg/kg） 检测结果 江西 5 0 未检出 湖北 5 0 未检出 山东 5 0 未检出 河南 5 0 未检出 安徽 5 0 未检出
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