Study on Processing Technology of Velvet Antler based on Principal Component and Cluster Analysis
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摘要: 研究煮炸干燥和真空冷冻干燥鹿茸产品中理化指标的差异，为鹿茸的高值加工利用提供理论支持。三对新鲜梅花鹿鹿茸，每对鹿茸中一支用于真空冷冻干燥，另一支用于传统煮炸法干燥，接着测定了两种产品水分、粗蛋白质、粗脂肪等基础营养成分及脂肪酸、氨基酸、胆固醇和矿物质元素中49项指标，并进行主成分分析和聚类分析。结果表明，冷冻干燥鹿茸中脂肪酸及氨基酸含量极显著（P<0.01）高于煮炸鹿茸，分别为（146.48±10.53）mg/100 g、（34.11±0.98）mg/100 g。而冷冻干燥鹿茸和煮炸干燥鹿茸水分含量分别为（5.37±0.12）mg/100 g、（11.20±1.11）mg/100 g，差异极显著（P<0.01）。主成分分析中前3个主成分累计贡献率达80.87%，煮炸鹿茸和冻干鹿茸样本分开明显，表明两组间的成分差异显著。聚类分析将16种显著差异成分聚为2簇，发现两种加工技术干燥后的鹿茸指标有较大差异，8种脂肪酸和7种氨基酸在冻干鹿茸中含量丰富。多元统计的分析方法能够更直观地表示不同加工技术中鹿茸成分的差异及各自优缺点，冷冻干燥技术能更好保留营养物质及活性成分，为鹿茸的加工提供了方向。Abstract: In order to provide theoretical support for high value processing and utilization of velvet antler, the differences of physicochemical indexes in velvet antler products by vacuum freeze-drying and boiled water-drying were studied. Three pairs of fresh velvet antlers, one was processed by vacuum freeze-drying method, the other by boiled water-drying method, and the determination of the two products of moisture, crude protein, crude fat and other nutrients and fatty acids, amino acids, cholesterol and mineral elements in 49 indicators, and principal component analysis and cluster analysis were carried out. The results showed that the contents of fatty acid and amino acid in vacuum freeze-dried antler velvet were significantly higher (P<0.01) than boiled-water dried antler velvet, which were (146.48±10.53) mg/100 g and (34.11±0.98) mg/100 g. While the moisture contents of vacuum freeze-dried antler velvet and boiled-water dried antler velvet were (5.37±0.12) mg/100 g and (11.20±1.11) mg/100 g, with significant difference (P<0.01). In the principal component analysis, the cumulative contribution rate of the first three principal components was 80.87%. The samples of boiled-water dried antler velvet and vacuum freeze-dried antler velvet were obviously separated, which indicated that there were significant differences between the two groups. Cluster analysis clustered 16 components with significant differences into 2 groups, it was found that the indexes of velvet antler after drying were significantly different between the two processing techniques. 8 kinds of fatty acids and 7 kinds of amino acids were abundant in vacuum freeze-dried antler velvet. Multivariate statistical analysis method can more intuitively represent the differences of antler components and their advantages and disadvantages in different processing techniques, and vacuum freeze-drying technology can better retain the active ingredients, and provide a direction for velvet antler processing.
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Keywords:
- velvet antler /
- processing technic /
- components /
- principal component analysis /
- cluster analysis
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鹿茸是我国传统的名贵中药药材，其药理作用宽泛、化学成分复杂，被称作天然的生长因子库。研究表明，鹿茸中含有无机元素、氨基酸、脂质类、芳香族化合物、酶类、多胺、糖类、维生素、激素、核酸、碱基、生长因子等多种有效成分[1-4]，其中氨基酸占总成分一半以上，具有抗炎、抗氧化、壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任等功效[5]。鹿茸是迄今为止发现的唯一能够完全再生的哺乳动物器官[6-9]，因此也成为广大科研工作者研究的对象。
鹿茸丰富的营养成分决定其品质特性，但不同加工技术又影响其成分变化，品质也随之改变。因其价格昂贵，鹿茸干燥处理的效果将直接影响鹿茸的品质和经济效益。干燥方式的选择也成为鹿茸加工产地的重要环节，目前鹿茸的加工方式应用较为广泛的是传统的煮炸干燥技术和先进的冷冻干燥技术。煮炸鹿茸需经过沸水煮炸、烘烤等高温工序，有效成分可能会流失；冻干鹿茸是在低温干燥条件下，通过冻干机使新鲜的鹿茸冷冻干燥从而得到干制品。冷冻干燥法最大程度的保留了鹿茸中有效成分的活性，在市场拥有较为广阔的前景[10-12]。
鹿茸加工品质是选择鹿茸加工方法的重要依据，包括基础营养成分、胆固醇、氨基酸、脂肪酸、矿物质等多项评价指标。如何科学、客观的评价鹿茸加工品质是目前需要解决的问题。近年来许多学者采用主成分分析[13]和聚类分析[14]对肉鸡[15]、鬼灯檠属[16]、苹果[17]等动植物及中药材进行了综合评价。在鹿茸品质分析和综合评价方面，已有学者就梅花鹿鹿茸[18]、鹿茸饮片[19]、不同等级鹿茸[20]进行了基于主成分分析或聚类分析的综合评价，但未见对不同加工方式的鹿茸品质的综合评价方面的详细报道。因此，本文以煮炸干燥鹿茸和冷冻干燥鹿茸为材料，通过测定上述鹿茸成分指标，结合主成分分析和聚类分析法综合评价鹿茸品质，为今后鹿茸开发加工利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
鹿茸 中国农业科学院特产研究所左家试验站提供；甲酯化脂肪酸（37种脂肪酸，FAMEs）混标 美国Nu-Chek Prep公司；胆固醇 Sigma公司；乙腈、甲醇 色谱级，Fisher公司；氯仿、甲醇、盐酸、氯化钾、氢氧化钾、正己烷、无水硫酸钠 均为分析纯，天津广成化学试剂有限公司。
GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司；EYELA FDU-1100真空冷冻干燥器 日本东京理化公司；BFM-6B1贝利粉碎机 济南倍力粉技术工程有限公司；FW-200高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；ME204E万分之一天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；Spe-ed SPE-prime型二氧化碳（CO2）超临界萃取仪 美国应用分离公司；ACQUITY UPLCTM超高压液相色谱仪 沃特世科技上海有限公司；7000B气相色谱-串联质谱仪 安捷伦科技中国有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品处理
参照侯召华等[21]的实验方法，随机选取一对新鲜鹿茸，一支采用真空冷冻干燥法干燥，另一支采用传统煮炸法干燥，实验重复三次。
冻干鹿茸：将新鲜鹿茸茸体枝干的弯曲部分、嘴头等处用排针扎孔，以避免冻干时茸头表皮膨胀现象；鹿茸放于−80 ℃冰箱中预冷8 h后，将冷冻的鹿茸表面用干净毛巾擦拭干净；然后把样品放到真空冷冻干燥箱中真空冷冻干燥36 h；干燥室内真空度控制在（10±5）Pa，温度为（−45±5）℃。
煮炸干燥鹿茸：将新鲜带血茸封锯口，收茸后锯口向上以免茸血流失；洗刷茸皮时锯口不得沾水，洗刷鹿茸后将其锯口撒上一层面粉，待面粉浸湿后用烙铁烧烙锯口将血眼堵住；封口鹿茸沸水煮炸30~40 s后用纱布擦干，于75 ℃烘箱中干燥3 h，然后悬挂风干。前5 d重复此工艺，第6 d开始每2 d一次，重复6~8次，干燥为止。
冷冻干燥鹿茸和煮炸干燥鹿茸切小块，贝利粉碎机粉碎，过60目筛，得粉末备用。
1.2.2 鹿茸水分、灰分、脂肪、蛋白含量测定
水分和灰分：参照《中国药典》2015年版对不同加工方式干燥的三对鹿茸的水分、总灰分含量进行测定；粗脂肪、粗蛋白均按照国标规定标准进行检测,其中脂肪含量测定参照GB/T5009.6-2016《食品中脂肪的测定》，蛋白质含量测定参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。
1.2.3 鹿茸胆固醇分析
胆固醇含量参照侯召华等[21]的方法测定。鹿茸脂溶性提取物溶解在20 mL正己烷中，吸取1 mL样品液放到50 mL水解管中，添加10 mL 1 mol/L KOH水溶液和10 mL乙醇。90~95 °C水浴下皂化90 min。皂化结束后流动水降温，利用10 mL正己烷萃取胆固醇，重复三次，合并萃取液。利用（3×10）mL蒸馏水萃取液冲洗三次。氮气吹干，重新溶解在10 mL无水乙醇中，准备进行UPLC分析。
色谱条件：超高压液相色谱ACQUITY UPLCTM，色谱柱：Acquity BEH-C18TM（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters），吸光值为203 nm，上样量2 μL；柱温箱45 °C；流动相A为90%甲醇，B为水；流动相为恒流A:B=90:10，流速0.5 mL/min。
M(mg/100g)=c×Vm×100 式中：M表示胆固醇含量，mg/100 g；c表示样品浓度，mg/mL；V表示供试品溶液体积，mL；m表示鹿茸取样量，g；100表示换算关系。
1.2.4 鹿茸脂肪酸组成分析
脂肪酸甲酯化方法参考文献[22]，并进行适当修改。称取鹿茸粉（约1.0 g）放到玻璃容器中，添加40 mL提取液（氯仿:甲醇= 2:1）；组织匀浆，超声提取30 min后，滤纸过滤，滤液放到分液漏斗中；然后添加30 mL 1 mol/L KCl水溶液，4 ℃下静置分层过夜。过夜分层后，得到下层有机相，氮气吹干得到脂质提取物；脂质提取物溶解在5 mL正己烷中，放到具塞试管中；在试管中添加5 mL 1 mol/L KOH甲醇溶液，50 ℃下，反应2 h；反应结束后，添加5 mL 正己烷和15 mL 5% HCl溶液，进行分层；上层为有机相（正己烷层），得到上层相，用正己烷定容至10 mL；然后加入无水Na2SO4除去多余水分。取进样量1 μL，进行GC-MS分析。
气相色谱条件：色谱柱：SPTM-2560 弹性石英毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.25 μm; supelco, PA）；升温程序：140 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至200 ℃，接着3 ℃/min升至220 ℃，保持26 min；载气（He）流速1.0 mL/min；进样量1 μL；分流比为60:1。进样口温度和传输线温度为250 ℃。质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度280 ℃；全扫描方式，质量扫描范围m/z 50~500。鹿茸中脂肪酸含量表示为mg/100 g。
W(mg/100g)=c×Vm×100 式中：W表示脂肪酸含量，mg/100 g；c表示样品浓度，mg/mL；V表示供试品溶液体积，mL；m表示鹿茸取样量，g；100表示换算关系。
1.2.5 鹿茸氨基酸成分分析
参考唐晓雷等[23]测定方法，并进行适当修改。取一定量样品于20 mL水解管中，加入6 mol /L盐酸溶液16 mL，真空脱气30 min，充氮封管，110 ℃下水解22 h，冷却后打开水解管，用去离子水无损转移到50 mL容量瓶中，定容。准确取1 mL水解液于小瓶中，于真空中脱酸抽干，加1 mL水再抽干，再加1 mL水再抽干备用。添加0.02 mol /L盐酸溶液1 mL，充分溶解。精密量取上述溶液 500 μL，置于5 mL塑料离心管中，添加1 mol /L三乙胺乙腈溶液 250 μL，混匀，添加0.1 mol /L异硫氰酸苯酯乙腈溶液250 μL，混匀，室温放置1 h，加2 mL正己烷，剧烈振摇，放置10 min，取下层溶液用0.22 μm的水相膜滤膜过滤后上机分析。色谱柱：Aglient Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；柱温：40 ℃；检测波长254 nm; 流动相A：0.1 mol /L醋酸钠缓冲液（pH6.5）-乙腈（93:7）；流动相B：乙腈-水（8:2）；梯度为恒流，流动相B 为50%；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。
1.2.6 矿物质元素测定
参考王燕华等[24]的测定方法。K、Ca、Na、Fe用原子吸收光谱法测定；Mg、Cu、Zn、Mn用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定。称取样品0.5 g放置于聚四氟乙烯内罐中，加入5 mL 硝酸，浸泡20 min，再加入2~3 mL过氧化氢，放置10 min，盖上内盖，安装好保护套，将消解罐放入微波消解仪器内，设置微波消解程序，进行消解。消解结束后，取出内罐，将内罐中的消解液用水少量洗涤并转移到50 mL容量瓶中，定容，混匀，进样分析。
1.3 数据处理
采用 Excel 2010软件对所测定成分进行数据统计。采用SPSS 26.0软件进行均值、标准差计算以及主成分分析，其中主成分分析应用最大方差法。采用Perseus1.6.5.0软件进行聚类分析。
2. 结果与分析
2.1 基础营养成分与胆固醇分析
由表1可知，煮炸鹿茸与冻干鹿茸的含水量分别为（11.20±1.11）、（5.37±0.12）mg/100 g，煮炸鹿茸中含水量极显著高于冻干鹿茸（P<0.01）。含水量将直接影响成品鹿茸外观、质量等品质，含水量过高导致鹿茸在自身酶和外界腐败菌的作用下降低药用价值。真空冷冻干燥技术使新鲜鹿茸在干燥的过程中不受表面张力的作用，成品不变形，脱水彻底，便于长期贮存、运输和利用。不同加工方式的鹿茸样品中，常规营养成分含量存在差异，冻干鹿茸中粗灰分、粗脂肪、粗蛋白以及胆固醇含量均高于煮炸鹿茸，但并不显著（P>0.05）。说明冻干鹿茸能较好的保留其营养成分和活性物质。
表 1 不同加工方式鹿茸中的营养成分和胆固醇Table 1. Nutrient composition and cholesterol in antler velvet of different processing methods2.2 脂肪酸分析
由表2可知，煮炸鹿茸和冻干鹿茸测定有19种脂肪酸，总脂肪酸含量分别为（105.70±9.25）、（146.48±10.53）mg/100 g，差异极显著（P<0.01）。其中以硬脂酸（32.35%和34.30%），油酸（13.66%和8.51%），棕榈酸（16.87%和18.75%）为主，单不饱和酸（MUFA）以油酸突出，多不饱和脂肪酸（PUFA）以亚油酸、花生四烯酸较为突出。研究表明，以油酸为代表的单不饱和脂肪酸，具有降血糖、调节血脂等功效，同时降低低密度脂蛋白水平，有利于血管的软化，具有防治心血管疾病的疗效[25]，且与二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）发挥协同作用增强其功效[26-27]。
表 2 不同加工方式鹿茸的脂肪酸组成Table 2. Fatty acid composition of antler velvet processed in different processing methods脂肪酸 煮炸干燥鹿茸 真空冷冻干燥鹿茸 含量（mg/100 g） 比率（%） 含量（mg/100 g） 比率（%） 月桂酸（Lauric acid） 0.09±0.01 0.08±0.01 0.13±0.02** 0.09±0.01 豆蔻酸（Myristic acid） 2.64±0.21 2.51±0.26 4.06±0.46** 2.77±0.21 十五烷酸（Pentadecanoic acid） 1.22±0.04 1.16±0.06 1.51±0.31 1.02±0.16 棕榈酸（Palmitic acid） 17.78±0.83 16.87±1.43 27.39±0.33* 18.75±0.86 棕榈油酸（Palmitoleic acid） 1.03±0.07 0.98±0.01 1.00±0.14 0.68±0.07 十七烷酸（Heptadecanoic acid） 2.97±0.23 2.81±0.13 4.43±0.66* 3.00±0.30 硬脂酸（Stearic acid） 34.22±2.73 32.35±0.62 50.19±1.86* 34.30±0.66 油酸（Oleic acid） 14.40±0.42 13.66±1.09 12.51±1.57 8.51±0.68 亚油酸（Linoleic acid） 7.05±0.58 6.66±0.14 8.38±0.65 5.75±0.66 花生酸（Arachidic acid） 9.83±1.97 9.25±1.28 16.15±0.89* 11.02±0.06 顺-11-二十碳烯酸（Cis-11-Eicosenoic acid） 1.03±0.11 0.97±0.15 1.12±0.18 0.77±0.15 二十一烷酸（Heneicosanic acid） 0.85±0.16 0.80±0.10 1.28±0.21 0.87±0.10 二十二烷酸（Behenic acid） 2.73±0.46 2.57±0.28 4.43±0.50* 3.02±0.20 顺-8,11,14-二十烷三烯酸（Cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid） 0.38±0.04 0.36±0.02 0.27±0.08 0.18±0.05 芥酸（Erucic acid） 0.85±0.03 0.80±0.07 1.01±0.37 0.69±0.24 二十三碳酸（Tricosanoic acid） 0.75±0.09 0.71±0.05 1.07±0.20 0.73±0.10 花生四烯酸（Arachidonic acid） 2.99±0.39 2.83±0.29 3.17±0.78 2.15±0.46 二十四烷酸（Lignoceric acid） 4.21±0.83 3.97±0.67 7.55±0.95* 5.13±0.43 神经酸（Nervonic acid） 0.68±0.05 0.65±0.07 0.83±0.37 0.56±0.23 总脂肪酸 105.70±9.25 100 146.48±10.53** 100 2.3 氨基酸组成
由表3可知，煮炸干燥鹿茸、真空冷冻干燥鹿茸中氨基酸总量分别为（32.59±0.44）、（34.11±0.98）mg/100 g，差异极显著（P<0.01）。两种加工方式的鹿茸中均含有17种氨基酸，冻干鹿茸和煮炸鹿茸中含量最多的氨基酸依次是甘氨酸（占氨基酸总量的14%~16%）、谷氨酸（占氨基酸总量的11%~13%）和脯氨酸（占氨基酸总量的9%~10%）。蛋氨酸、半胱氨酸含量较低。冻干鹿茸中苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等人体必需氨基酸，谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等呈味氨基酸含量显著高于煮炸鹿茸（P<0.05），说明在真空冷冻干燥加工过程中，鹿茸中氨基酸及香味物质得到最大程度地保留。
表 3 不同加工方式鹿茸的氨基酸组成Table 3. Amino acid composition of antler velvet processed in different processing methods氨基酸 煮炸干燥鹿茸含量
（mg/100 g）真空冷冻干燥鹿茸含量
（mg/100 g）天冬氨酸（Asp） 2.63±0.04 2.75±0.01** 苏氨酸（Thr） 1.25±0.02 1.33±0.01** 丝氨酸（Ser） 1.40±0.02 1.47±0.05 谷氨酸（Glu） 4.01±0.02 4.19±0.09* 脯氨酸（Pro） 3.08±0.06 3.18±0.13 甘氨酸（Gly） 5.06±0.07 5.21±0.21 丙氨酸（Ala） 2.83±0.03 2.98±0.06* 半胱氨酸（Cys） 0.34±0.01 0.35±0.02 缬氨酸（Val） 1.50±0.00 1.58±0.06 蛋氨酸（Met） 0.46±0.02 0.49±0.01 异亮氨酸（Ile） 0.72±0.02 0.75±0.02 亮氨酸（Leu） 2.14±0.03 2.33±0.08* 酪氨酸（Tyr） 0.67±0.03 0.70±0.03 苯丙氨酸（phe） 1.22±0.02 1.33±0.04* 赖氨酸（Lys） 1.99±0.01 2.08±0.03* 组氨酸（His） 0.68±0.02 0.72±0.06 精氨酸（Arg） 2.61±0.02 2.68±0.07 总氨基酸 32.59±0.44 34.11±0.98** 2.4 矿物质组成
由表4可知，煮炸鹿茸与冻干鹿茸中8种矿物质总量分别为（163403.97±9765.35）、（157948.14±6803.63）mg/kg，煮炸鹿茸中矿物质含量高于冻干鹿茸，但不显著(P>0.05)。在两种鹿茸4种常量元素中，Ca含量均为最高，Mg含量均为最低；4种微量元素中，Fe含量均为最高，Cu含量均为最低。煮炸鹿茸中的矿物质含量高于冻干鹿茸，这与王燕华[28]的研究结论一致。
表 4 不同加工方式鹿茸的矿物质组成Table 4. Mineral composition of antler velvet processed in different processing methods矿物质 煮炸干燥鹿茸含量
（mg/kg）真空冷冻干燥鹿茸含量
（mg/kg）Ca 144086.47±6028.66 150231.48±9061.30 Mg 2298.07±35.33 2274.26±187.49 Na 7732.42±445.90 7025.17±358.27 K 3558.14±244.45 3385.01±126.29 Fe 203.42±41.75 238.95±27.70 Zn 62.46±4.43 59.94±1.98 Cu 2.29±0.13 2.05±0.34 Mn 6.31±2.98 7.11±1.98 2.5 主成分分析
主成分分析（principal component analysis）是一种通过数据降维，将多个变量通过线性变换为少数综合变量，用简化的数据反映原始数据的多元统计分析方法[29]。主成分分析方法保留了原指标的大部分信息，比单一评价更方便准确，同时避免性状间的相关性对评价结果的影响[30]。在对不同加工方式的鹿茸品质进行评价时，不能只从一项指标和几项指标的优劣性考虑，而应该考虑到所有指标，对鹿茸进行科学、系统的综合评价。本文以2种加工方式鹿茸的49项指标构成矩阵，采用SPSS 26.0软件进行PCA。
图1是主成分分析特征值碎石图，横轴表示主成分数量，纵轴表示特征值。本试验综合考虑了碎石图和方差贡献率确定最优主成分数。由图1可知，主成分分析特征值碎石图有三个拐点，即表明有三个主成分。由表5可得出，主成分1的贡献率为45.80%，主成分2的贡献率为20.80%，主成分3的贡献率为14.27%，前3个主成分累计方差贡献率达到80.87%，综合了鹿茸品质指标的大部分信息。
表 5 鹿茸品质评价因子的特征值和贡献率Table 5. The characteristic value and contribution rate of deer antlers quality evaluation factor成分 特征值 方差百分比 累积（%） 1 22.90 45.80 45.80 2 8.86 20.80 66.60 3 7.86 14.27 80.87 由表6可知，第一主成分PC1主要包含了Behenic acid（二十二烷酸）、Lignoceric acid（二十四烷酸）、Arachidic acid（花生酸）等的信息，且均为正相关，即在以PC1为横坐标的正向，PC1越大，Behenic acid、Lignoceric acid、Arachidic acid均越大，PC1可命名为脂肪酸因子。第二主成分PC2主要包含Mn、Zn、Fe的信息，且Mn和Fe呈正相关，Zn呈负相关，即PC2越大，Mn和Fe越大，Zn越小。PC2可命名为必需微量元素因子。第三主成分PC3主要包含了Pro（脯氨酸）、Arg（精氨酸）、Gly（甘氨酸）的信息，其中Pro、Arg、Gly均为正相关，即PC3越大，Pro、Arg、Gly越大。PC3可命名为氨基酸因子。
表 6 旋转后的成分矩阵Table 6. A rotated composition matrix指标 PC1 PC2 PC3 二十二烷酸（Behenic acid） 0.975 0.118 −0.131 二十四烷酸（Lignoceric acid） 0.972 0.148 −0.173 花生酸（Arachidic acid） 0.964 −0.154 硬脂酸（Stearic acid） 0.935 −0.302 二十一烷酸（Heneicosanic acid） 0.934 0.266 十七烷酸（Heptadecanoic acid） 0.933 0.232 −0.192 月桂酸（Lauric acid） 0.931 0.161 −0.268 二十三烷酸（Tricosanoic acid） 0.912 0.337 缬氨酸（Val） −0.907 0.316 −0.132 粗脂肪（Crude fat） 0.905 −0.392 −0.122 豆蔻酸（Myristic acid） 0.904 0.267 −0.322 钠（Na） −0.898 −0.228 −0.148 亮氨酸（Leu） −0.893 0.397 0.136 苯丙氨酸（Phe） −0.878 0.329 0.193 赖氨酸（Lys） −0.863 0.26 0.262 棕榈酸（Palmitic acid） 0.82 −0.517 含水量（Moisture） −0.82 0.527 苏氨酸（Thr） −0.808 0.317 0.46 组氨酸（His） −0.722 0.551 −0.331 十五烷酸（Pentadecanoic acid） 0.717 0.476 −0.115 丙氨酸（Ala） −0.711 0.517 天冬氨酸（Asp） −0.687 0.448 0.568 铜（Cu） −0.673 −0.354 锰（Mn） −0.209 0.958 −0.143 锌（Zn） 0.263 −0.932 −0.101 神经酸（Nervonic acid） 0.455 0.863 铁（Fe） −0.501 0.833 粗灰分（crude ash） 0.209 0.824 芥酸（Erucic acid） 0.34 0.759 钙（Ca） 0.427 0.717 −0.17 亚油酸（Linoleic acid） 0.67 −0.674 −0.199 脯氨酸（Pro） 0.116 0.984 精氨酸（Arg） −0.102 0.963 甘氨酸（Gly） 0.939 丝氨酸（Ser） −0.338 0.103 0.895 谷氨酸（Glu） −0.493 0.864 蛋氨酸（Met） −0.435 −0.188 0.687 异亮氨酸（Ile） −0.381 −0.605 0.676 棕榈油酸（Palmitoleic acid） 0.142 花生四烯酸（Arachidonic acid） 0.277 −0.227 顺-11-二十碳烯酸（Cis-11-Eicosenoic acid） 0.165 0.285 −0.202 油酸（Oleic acid） −0.412 0.269 0.276 顺-8,11,14-二十烷三烯酸（Cis-8-11-14-Eicosatrienoic acid） −0.36 0.528 粗蛋白（Crude protein） 0.407 0.541 0.269 半胱氨酸（Cys） 0.202 镁（Mg） 0.152 胆固醇（Cholesterol） −0.137 0.332 钾（K） −0.585 −0.271 0.104 酪氨酸（Tyr） −0.263 0.559 0.424 注：旋转在8次迭代后已收敛；PC1~PC3分别表示主成分一、二、三。 应用PCA对煮炸鹿茸和冻干鹿茸样本进行检验，可看出两组可以完全分开，两组之间具有明显差异，需分析两组之间的差异代谢物。如图2所示，圆点表示真空干燥组，菱形点表示煮炸干燥组。
2.6 聚类分析
火山图（volcano plot）是一种可以表示组间差异数据的图像，有两个重要参数，即显著性和差异表达。显著性（p-value）是差异性检验两组的P值，差异表达一般按照fold change（倍数变化）表示，利用P值<0.05和log2大于1或者小于−1来筛选指标，即可筛选出显著差异表达的鹿茸成分，从而进一步分析[31]。图中每一个点代表一个指标，实心圆形和空心三角形为显著上调表达的指标，实心正方形为显著下调表达的指标，空心正方形为无显著性差异的指标。
图3为两种加工技术差异表达指标的火山图，其中横轴代表log2（fold change）值，纵轴代表-log10（p-value）值。寻找其中明显上调或下调的16个差异成分，主要为水、氨基酸和脂肪酸成分。统计得到煮炸鹿茸中1种成分含量高于冻干鹿茸；冻干鹿茸中15种成分含量高于煮炸鹿茸，由于煮炸鹿茸和冻干鹿茸自身的差异较大，筛选的差异成分可用来区分煮炸鹿茸和冻干鹿茸。
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图 3 煮炸和冷冻干燥鹿茸成分差异火山图注：图中右侧实心圆点从上到下依次为月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、二十四烷酸；空心三角形从上到下依次为天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸。Figure 3. Volcanic map of composition difference of boiled and freeze-dried velvet antler聚类分析（cluster analysis）是研究样品或指标分类问题的一种统计方法，目的是在相似的基础上收集数据来分类，已经被广泛地应用于各个领域[32]。为进一步确定不同方式加工的鹿茸中成分差异，对16种差异成分进行层次聚类分析，并绘制样品中差异成分含量的热图，图中每一行代表一个成分指标，每一列为一个样本，不同颜色表示不同的表达量，结果如图4。通过欧式距离法进行聚类分析，把16种成分分成2簇，脂肪酸和氨基酸为一类，且在冻干鹿茸中含量极显著高于煮炸鹿茸（P<0.01）；水分含量为一类，且在煮炸鹿茸中含量极显著高于冻干鹿茸（P<0.01）。结果表明，不同加工方式鹿茸的成分组成差异明显。
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图 4 煮炸和冷冻干燥鹿茸中差异成分聚类分析Figure 4. Cluster analysis of different components in boiled and freeze-dried velvet antler3. 结论
对两种加工技术研究表明，真空冷冻干燥和传统煮炸法干燥对鹿茸营养成分组成和含量影响显著；真空冷冻干燥加工技术能有效保留鹿茸中脂溶性成分和氨基酸含量，脂肪酸和氨基酸含量极显著高于煮炸干燥鹿茸（P<0.01）；而水分含量冻干鹿茸极显著低于煮炸干燥鹿茸（P<0.01），这表明真空冷冻干燥技术能有效脱去鹿茸中水分。利用主成分分析研究两种加工技术鹿茸产品中理化指标的差异和潜在相关性，3个主成分（脂肪酸因子、无机元素因子、氨基酸因子）包括了鹿茸产品品质的多个指标，能客观地反映加工方式对主成分的影响，表明真空冷冻技术对脂溶性成分具有显著影响。对两种鹿茸产品中16个显著差异成分进行聚类分析，最终聚2簇，一类是氨基酸与脂肪酸，一类是水分含量。本研究主要集中对不同方式加工的鹿茸中氨基酸、脂肪酸等营养成分进行系统研究，阐明真空冷冻干燥法和煮炸干燥法的鹿茸加工品质的差异，为鹿茸的开发加工利用提供数据支撑。在后续研究过程中，应加强对鹿茸中性激素、游离氨基酸、游离脂肪酸等功效成分的研究。
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图 3 煮炸和冷冻干燥鹿茸成分差异火山图
注：图中右侧实心圆点从上到下依次为月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、二十四烷酸；空心三角形从上到下依次为天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸。
Figure 3. Volcanic map of composition difference of boiled and freeze-dried velvet antler
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图 4 煮炸和冷冻干燥鹿茸中差异成分聚类分析
Figure 4. Cluster analysis of different components in boiled and freeze-dried velvet antler
表 1 不同加工方式鹿茸中的营养成分和胆固醇
Table 1 Nutrient composition and cholesterol in antler velvet of different processing methods
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表 2 不同加工方式鹿茸的脂肪酸组成
Table 2 Fatty acid composition of antler velvet processed in different processing methods
脂肪酸 煮炸干燥鹿茸 真空冷冻干燥鹿茸 含量（mg/100 g） 比率（%） 含量（mg/100 g） 比率（%） 月桂酸（Lauric acid） 0.09±0.01 0.08±0.01 0.13±0.02** 0.09±0.01 豆蔻酸（Myristic acid） 2.64±0.21 2.51±0.26 4.06±0.46** 2.77±0.21 十五烷酸（Pentadecanoic acid） 1.22±0.04 1.16±0.06 1.51±0.31 1.02±0.16 棕榈酸（Palmitic acid） 17.78±0.83 16.87±1.43 27.39±0.33* 18.75±0.86 棕榈油酸（Palmitoleic acid） 1.03±0.07 0.98±0.01 1.00±0.14 0.68±0.07 十七烷酸（Heptadecanoic acid） 2.97±0.23 2.81±0.13 4.43±0.66* 3.00±0.30 硬脂酸（Stearic acid） 34.22±2.73 32.35±0.62 50.19±1.86* 34.30±0.66 油酸（Oleic acid） 14.40±0.42 13.66±1.09 12.51±1.57 8.51±0.68 亚油酸（Linoleic acid） 7.05±0.58 6.66±0.14 8.38±0.65 5.75±0.66 花生酸（Arachidic acid） 9.83±1.97 9.25±1.28 16.15±0.89* 11.02±0.06 顺-11-二十碳烯酸（Cis-11-Eicosenoic acid） 1.03±0.11 0.97±0.15 1.12±0.18 0.77±0.15 二十一烷酸（Heneicosanic acid） 0.85±0.16 0.80±0.10 1.28±0.21 0.87±0.10 二十二烷酸（Behenic acid） 2.73±0.46 2.57±0.28 4.43±0.50* 3.02±0.20 顺-8,11,14-二十烷三烯酸（Cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid） 0.38±0.04 0.36±0.02 0.27±0.08 0.18±0.05 芥酸（Erucic acid） 0.85±0.03 0.80±0.07 1.01±0.37 0.69±0.24 二十三碳酸（Tricosanoic acid） 0.75±0.09 0.71±0.05 1.07±0.20 0.73±0.10 花生四烯酸（Arachidonic acid） 2.99±0.39 2.83±0.29 3.17±0.78 2.15±0.46 二十四烷酸（Lignoceric acid） 4.21±0.83 3.97±0.67 7.55±0.95* 5.13±0.43 神经酸（Nervonic acid） 0.68±0.05 0.65±0.07 0.83±0.37 0.56±0.23 总脂肪酸 105.70±9.25 100 146.48±10.53** 100
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表 3 不同加工方式鹿茸的氨基酸组成
Table 3 Amino acid composition of antler velvet processed in different processing methods
氨基酸 煮炸干燥鹿茸含量
（mg/100 g）真空冷冻干燥鹿茸含量
（mg/100 g）天冬氨酸（Asp） 2.63±0.04 2.75±0.01** 苏氨酸（Thr） 1.25±0.02 1.33±0.01** 丝氨酸（Ser） 1.40±0.02 1.47±0.05 谷氨酸（Glu） 4.01±0.02 4.19±0.09* 脯氨酸（Pro） 3.08±0.06 3.18±0.13 甘氨酸（Gly） 5.06±0.07 5.21±0.21 丙氨酸（Ala） 2.83±0.03 2.98±0.06* 半胱氨酸（Cys） 0.34±0.01 0.35±0.02 缬氨酸（Val） 1.50±0.00 1.58±0.06 蛋氨酸（Met） 0.46±0.02 0.49±0.01 异亮氨酸（Ile） 0.72±0.02 0.75±0.02 亮氨酸（Leu） 2.14±0.03 2.33±0.08* 酪氨酸（Tyr） 0.67±0.03 0.70±0.03 苯丙氨酸（phe） 1.22±0.02 1.33±0.04* 赖氨酸（Lys） 1.99±0.01 2.08±0.03* 组氨酸（His） 0.68±0.02 0.72±0.06 精氨酸（Arg） 2.61±0.02 2.68±0.07 总氨基酸 32.59±0.44 34.11±0.98**
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表 4 不同加工方式鹿茸的矿物质组成
Table 4 Mineral composition of antler velvet processed in different processing methods
矿物质 煮炸干燥鹿茸含量
（mg/kg）真空冷冻干燥鹿茸含量
（mg/kg）Ca 144086.47±6028.66 150231.48±9061.30 Mg 2298.07±35.33 2274.26±187.49 Na 7732.42±445.90 7025.17±358.27 K 3558.14±244.45 3385.01±126.29 Fe 203.42±41.75 238.95±27.70 Zn 62.46±4.43 59.94±1.98 Cu 2.29±0.13 2.05±0.34 Mn 6.31±2.98 7.11±1.98
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表 5 鹿茸品质评价因子的特征值和贡献率
Table 5 The characteristic value and contribution rate of deer antlers quality evaluation factor
成分 特征值 方差百分比 累积（%） 1 22.90 45.80 45.80 2 8.86 20.80 66.60 3 7.86 14.27 80.87
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表 6 旋转后的成分矩阵
Table 6 A rotated composition matrix
指标 PC1 PC2 PC3 二十二烷酸（Behenic acid） 0.975 0.118 −0.131 二十四烷酸（Lignoceric acid） 0.972 0.148 −0.173 花生酸（Arachidic acid） 0.964 −0.154 硬脂酸（Stearic acid） 0.935 −0.302 二十一烷酸（Heneicosanic acid） 0.934 0.266 十七烷酸（Heptadecanoic acid） 0.933 0.232 −0.192 月桂酸（Lauric acid） 0.931 0.161 −0.268 二十三烷酸（Tricosanoic acid） 0.912 0.337 缬氨酸（Val） −0.907 0.316 −0.132 粗脂肪（Crude fat） 0.905 −0.392 −0.122 豆蔻酸（Myristic acid） 0.904 0.267 −0.322 钠（Na） −0.898 −0.228 −0.148 亮氨酸（Leu） −0.893 0.397 0.136 苯丙氨酸（Phe） −0.878 0.329 0.193 赖氨酸（Lys） −0.863 0.26 0.262 棕榈酸（Palmitic acid） 0.82 −0.517 含水量（Moisture） −0.82 0.527 苏氨酸（Thr） −0.808 0.317 0.46 组氨酸（His） −0.722 0.551 −0.331 十五烷酸（Pentadecanoic acid） 0.717 0.476 −0.115 丙氨酸（Ala） −0.711 0.517 天冬氨酸（Asp） −0.687 0.448 0.568 铜（Cu） −0.673 −0.354 锰（Mn） −0.209 0.958 −0.143 锌（Zn） 0.263 −0.932 −0.101 神经酸（Nervonic acid） 0.455 0.863 铁（Fe） −0.501 0.833 粗灰分（crude ash） 0.209 0.824 芥酸（Erucic acid） 0.34 0.759 钙（Ca） 0.427 0.717 −0.17 亚油酸（Linoleic acid） 0.67 −0.674 −0.199 脯氨酸（Pro） 0.116 0.984 精氨酸（Arg） −0.102 0.963 甘氨酸（Gly） 0.939 丝氨酸（Ser） −0.338 0.103 0.895 谷氨酸（Glu） −0.493 0.864 蛋氨酸（Met） −0.435 −0.188 0.687 异亮氨酸（Ile） −0.381 −0.605 0.676 棕榈油酸（Palmitoleic acid） 0.142 花生四烯酸（Arachidonic acid） 0.277 −0.227 顺-11-二十碳烯酸（Cis-11-Eicosenoic acid） 0.165 0.285 −0.202 油酸（Oleic acid） −0.412 0.269 0.276 顺-8,11,14-二十烷三烯酸（Cis-8-11-14-Eicosatrienoic acid） −0.36 0.528 粗蛋白（Crude protein） 0.407 0.541 0.269 半胱氨酸（Cys） 0.202 镁（Mg） 0.152 胆固醇（Cholesterol） −0.137 0.332 钾（K） −0.585 −0.271 0.104 酪氨酸（Tyr） −0.263 0.559 0.424 注：旋转在8次迭代后已收敛；PC1~PC3分别表示主成分一、二、三。
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