Determination of Seventeen Amino Acids in Morchella Esculenta by Quantitative Analysis of Multi-Components by Single-Marker Method
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摘要: 目的：建立以谷氨酸为内参物，同时测定羊肚菌中17种氨基酸含量的一测多评法。方法：采用高效液相色谱，以乙腈-乙酸铵水溶液为流动相，梯度洗脱，以谷氨酸为内参物，建立其与其他16种氨基酸的相对校正因子（RCF），并用相对校正因子计算16种氨基酸的含量；同时采用内标法对羊肚菌中17种氨基酸进行测定，比较一测多评法与内标法结果的差异，并对方法耐用性进行考察。结果：17种氨基酸在线性范围内线性关系良好，线性相关系数R2>0.9990，平均加标回收率在92.42%~101.16%之间，RSD在0.25%~1.94%，在不同实验条件下重现性良好（RSD<2.0%）；一测多评法和内标法测定结果的对比分析，无显著性差异（P>0.05）。在不同色谱柱、色谱体系中的相对校正因子、相对保留时间的RSD均小于2.0%，耐用性良好。结论：本文建立的一测多评法简单易操作，结果准确，节约了测定成本，为羊肚菌中氨基酸的测定提供了一种新的模式，为羊肚菌的质量评价提供有价值的参考。Abstract: Objective: To establish a quantitative analysis of multi-components by single-marker (QAMS) with using glutamic acid as the internal reference, the content of 17 amino acids in Morchella esculenta was determined simultaneously. Methods: High performance liquid chromatography (HPLC) was used with acetonitrile-ammonium acetate aqueous solution as mobile phase, gradient elution and glutamic as the internal reference substance was used to establish its relative correction factors (RCF) of other 16 amino acids. The content of 17 amino acids in Morchella esculenta was calculated by using the relative correction factor. Internal standard method was used to determine 17 amino acids in Morchella esculenta. The validity of the QAMS method was evaluated by comparison of the quantitative results of both methods and to validate the durability of this method. Results: The 17 amino acids had a great linear relationship in the linear range, and the correlation coefficients higher than 0.9990, the average recovery rate of 17 amino acids were in the range of 92.42%~101.16%, and the relative standard deviations (RSD) were in the range of 0.25%~1.94%, and reproducibility was good in different experimental conditions (RSD<2.0%); through the comparative analysis of determination results of QAMS and the internal standanrd method, the two methods had no significant difference (P>0.05). The RCF and the relative retention time RSD in different chromatographic columns and chromatographic systems all less than 2.0%, and the durability was good. Conclusion: This method is simple, easy to operate, accurate and can save the cost of content determination. It can be used as a new model for the determination of amino acid content in Morchella esculenta, and can also provide a valuable reference for the quality evaluation of Morchella esculenta.
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羊肚菌（Morchella esculenta） 是四大名贵食用菌之一，因其菌盖表面有许多不规则凹陷且多有褶皱，状似羊肚而得名，主要分布于云南、贵州、青海、西藏等地[1-7]。羊肚菌肉质鲜美，风味独特，营养丰富，富含蛋白质、矿物质、多糖等物质，具有提升免疫力、抗癌等功效[8-11]。氨基酸作为蛋白质的基本组成单元和人体的所需营养成分，具有多种不同的生理功能[12]，能判断食品的营养价值，同样也关联和影响食品的风味，是食品质量评价的重要指标，所以羊肚菌中氨基酸的含量是衡量羊肚菌品质优劣的重要指标[13-16]。
在国家标准GB/T 5009.124-2016中，测定氨基酸采用外标法[17]，吴素蕊[18]、张航[19]、黄世群[20]等对羊肚菌氨基酸的研究多数均采用外标法，但该方法不能消除实验中的误差以及标准品与待测样品之间的基体差异所导致的基质效应，对实验结果的准确度有一定影响[21-24]；内标法由于内标物质和待测组分来自同一基体，当实验条件发生非人为变化时，两者会受到相同影响，消除了系统误差，使分析更加准确[25-26]。为了更好地评价羊肚菌的品质，需对羊肚菌中氨基酸的含量进行全面、准确的控制，但检测物质较多，成本过高且耗时过长。QAMS法通过测定一个成分而实现多个成分的同步测定，大幅度降低成本和实验人员的工作量[27-38]，比传统质量控制方法更加经济、高效、简单。
本研究采用一测多评法测定羊肚菌中17种氨基酸的含量，并对云南、新疆、贵州等6个不同地区的羊肚菌测定研究，本文为衡量羊肚菌的食用价值和品质优劣提供了科学依据, 为羊肚菌的开发利用指明了方向。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
羊肚菌 采集于新疆伊犁州、云南丽江市、贵州剑河县、贵州铜仁市万山区、贵州贵阳市长坡岭森林公园、贵州贵阳市乌当区长坡六个地区，羊肚菌置于干燥箱70 ℃烘干后，粉碎处理，过60目筛，粉末密封待用；甲醇、乙腈、三乙胺、正己烷 均为色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；异硫氰酸酯（PITC） 纯度大于98%，上海麦克林生化科技有限公司；乙酸铵、冰醋酸 均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；超纯水 自制；18种氨基酸 [天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、丙氨酸（Ala）、甲硫氨酸（Met）、赖氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、丝氨酸（Ser）、茶氨酸（The）] 纯度均大于98%，北京世纪奥科生物技术有限公司。
Agilent 1100高效液相色谱仪（方法学考察所用）、Agilent 1260高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司；DZKW- 电热恒温水浴锅 天津天泰仪器有限公司；200T粉碎机 永康铂欧五金制品有限公司；AL-104电子天平 梅特勒-托利多公司；CH-250超声波清洗机 北京创新德超声电子研究所；Discovery DV215CD分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司；202-1型恒温干燥箱 上海实验仪器厂有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液的配制
1.2.1.1 内标溶液
精密称取茶氨酸，配制浓度为0.404 mg/mL的内标溶液。
1.2.1.2 标准品溶液
精确称取 Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys等17种氨基酸至10 mL容量瓶中，加水定容得到混标储备液。移取1 mL混标储备液和0.5 mL内标溶液于5 mL容量瓶，加水定容，得到0.0397、0.0496、0.0218、0.0208、0.0078、0.1017、0.0311、0.0447、0.0277、0.0182、0.0207、0.0061、0.0184、0.0263、0.0170、0.0181、0.0446 mg/mL的混合氨基酸标准溶液。
1.2.1.3 衍生化试剂
衍生试剂A：取1.4 mL 1 mol/L 的三乙胺溶液至10 mL容量瓶，用乙腈定容，摇匀；衍生试剂B：吸取125 μL PITC至10 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，摇匀。
1.2.2 样品溶液制备与衍生化
1.2.2.1 样品溶液与空白溶液制备
准确称取20 mg羊肚菌于安瓿瓶中，加6.0 mol/L的HCl 溶液2 mL，吹入氮气后密封，将其置于（105±5）℃ 恒温干燥箱中24 h，使氨基酸完全水解。取出冷却后置80 ℃水浴挥干，多次加水挥发盐酸。加1 mL蒸馏水溶解，超声后得到样品溶液。将0.5 mL的内标溶液和样品溶液移加至5 mL容量瓶，加水定容，得到样品供试溶液，等待衍生。吸取0.5 mL的内标溶液加至5 mL容量瓶，加水定容，得空白溶液。
1.2.2.2 氨基酸的衍生化
精密吸取 200 μL 的氨基酸标准溶液（或样品供试溶液、空白液）于离心管中，加入衍生试剂A、B各100 μL，置40 ℃水浴锅中反应 1 h，加入400 μL正己烷，振荡静置10 min。取澄清的下层液，过0.45 μm 滤膜，即得待测样品。
1.2.3 色谱条件
分离柱为依利特 Hypersil ODS2（5 μm, 250 mm×4.6 mm）；流动相A：0.05 mol/L 乙酸铵溶液（pH6.5）；流动相B：乙腈；梯度洗脱（0 min, 0.8% B; 14 min, 5% B; 16 min, 6% B; 16.1 min, 4% B; 21 min, 4% B; 21.1 min, 3.5% B; 30 min, 3.5% B; 32 min, 8% B; 40 min, 15% B; 40.1 min, 16.5% B; 44 min, 16.5% B; 44.1 min, 20.8% B; 50 min, 23% B; 60 min, 25% B）；流速为1 mL/min；检测波长为254 nm；柱温为35 ℃；进样量为5 μL；
1.2.4 一测多评方法学考察
1.2.4.1 线性考察
精确吸取0.25、0.5、1、2、4 mL的混标储备液，分别置于5 mL 容量瓶，再分别加入0.5 mL内标溶液，加水定容，摇匀，进行衍生化处理，按上述的色谱进样测定。以氨基酸对照品的浓度（mg/mL）为X轴，峰面积为Y轴进行线性回归。
1.2.4.2 相对校正因子的计算
平行取混合标准溶液6份，进行衍生化处理，按上述的色谱条件测定。以Glu为内参物，根据相对校正因子（RCF，fkm）公式fkm =（Ck×Am）/（Cm×Ak）, 计算相对校正因子，式中Ck、Cm为内参物和待测成分的浓度，Am、Ak为内参物和待测成分的峰面积[29]。
1.2.4.3 精密度试验
精密吸取混合标准品溶液，进行衍生化处理后按上述的色谱条件连续测定6次，记录17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面积，计算RSD值以评价仪器的精密度。
1.2.4.4 重复性试验
吸取6份平行羊肚菌样品供试溶液，进行衍生化处理，按上述的色谱条件进样测定，记录17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面积，计算RSD值以考察实验的重复性。
1.2.4.5 稳定性试验
取样品供试溶液，衍生化后，于 0、2、4、8、16、24 h 进样分析，记录17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面积，计算RSD值以评价样品的稳定性。
1.2.4.6 加样回收率试验
精密称量已知含量的羊肚菌样品9份，每份10 mg，置于安瓿瓶中，按150%、100%、50%的比例加入标准品，根据“1.2.2.1”操作后进行衍生化处理，在上述“1.2.3”的色谱条件下测定。根据测得的氨基酸的量，计算回收率和RSD值。
1.2.5 样品含量的测定
平行取3份云南羊肚菌样品溶液，进行衍生化处理，按上述的色谱条件测定。采用一测多评法和内标法对羊肚菌中17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的含量进行计算。
1.2.6 耐用性考察
1.2.6.1 不同色谱柱的考察
精确吸取混合标准品溶液，进行衍生化处理后，在Agilent 1100高效液相色谱仪，“1.2.3”的色谱条件下考察依利特 Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm, 5 μm）和 Agilent C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）对氨基酸相对校正因子的影响。
1.2.6.2 不同仪器的考察
精密吸取混合对照品溶液，进行衍生化处理后，采用依利特 Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm, 5 μm）在“1.2.3”色谱条件下，考察两台不同色谱仪Agilent 1100 HPLC、Agilent 1260 HPLC对氨基酸相对校正因子的影响。
1.2.6.3 色谱峰定位
精密吸取混合对照品溶液，进行衍生化处理后，采用依利特 Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm, 5 μm）、Agilent C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm），在Agilent 1100 HPLC、Agilent 1260 HPLC中测定并计算以Glu为内参物，其他氨基酸的相对保留时间。
1.2.7 不同地区羊肚菌的测定
精密称量6个不同地区的羊肚菌，按“1.2.2.1”方法制备样品供试溶液，进行衍生化处理，按“1.2.3”色谱条件进样分析，采用一测多评法对氨基酸进行含量计算。
1.3 数据处理
应用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行t检验，实验谱图Origin Pro 9.1处理。
2. 结果与分析
2.1 标准品、样品及空白色谱图
在前期研究中，最初选择邻苯二甲醛为柱前衍生试剂，但衍生产物不稳定，实验的重现性较差。在文献调研后，选择了异硫氰酸苯酯为柱前衍生试剂，其反应条件温和、衍生产物性质稳定，重复性好。在前期的色谱条件研究中，考察了衍生时间对17种氨基酸出峰面积的影响。结果发现，衍生30 min的出峰面积与衍生60 min的出峰面积有一定差异，衍生30 min时间较短，可能导致衍生不完全，影响含量测定的准确度；衍生90 min与衍生60 min的出峰面积一致，考虑效率问题，选择衍生时间为60 min。
空白、标准品及样品的HPLC色谱图如图1所示。由图1可知，在“1.2.3”色谱条件下，17种氨基酸的峰型良好，干扰较少，分离清晰。
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图 1 羊肚菌氨基酸高效液相色谱图注：A：空白;B：氨基酸对照品;C：羊肚菌样品。Figure 1. HPLC analysis of amino acids in Morchella esculenta2.2 一测多评方法学考察
2.2.1 线性考察
精密吸取不同浓度对照品溶液，衍生化处理后注入色谱仪，结果见表1。由表1可知，17 种氨基酸在线性范围内与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数R2>0.9990。详见表1。
表 1 17 种氨基酸的线性回归方程Table 1. Linearity relationships of 17 kinds of amino acids氨基酸 线性回归方程 线性范围（mg/mL） R2 Asp y=4743.8x+39.433 0.0099~0.1588 0.9993 Glu y=4437.8x+46.821 0.0124~0.1984 0.9990 Ser y=9075.8x+18.288 0.0054~0.0872 0.9996 Gly y=13024x+22.521 0.0052~0.0832 0.9991 His y=7350.8x+15.929 0.0020~0.0312 0.9992 Thr y=8382.9x+50.338 0.0254~0.4068 0.9991 Ala y=13661x+12.329 0.0078~0.1244 0.9992 Arg y=4690.2x+5.8 0.0112~0.1788 0.9998 Pro y=7841.1x+39.221 0.0069~0.1108 0.9990 Tyr y=6876.9x−2.5583 0.0046~0.0728 0.9993 Val y=8890.4x+22.413 0.0052~0.0828 0.9990 Met y=8774.4x+19.958 0.0015~0.0240 0.9993 Ile y=9859.5x−1.6917 0.0046~0.0736 0.9992 Leu y=9427.4x+9.775 0.0066~0.1048 0.9994 Phe y=7605.4x+8.0167 0.0042~0.0680 0.9995 Trp y=7493.9x+16.479 0.0045~0.0724 0.9992 Lys y=8462.9x−4.5417 0.0112~0.1784 0.9992 2.2.2 相对校正因子的计算
通过研究发现，苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬氨酸在羊肚菌中的含量均较高且较稳定[18-19]。但从质控成本角度来看，谷氨酸较其他三种成分价格更加低廉且附近干扰峰较少。根据QAMS法内参物易得、价廉、有效、稳定的选择原则，本研究最终选择谷氨酸作为内参物进行相对校正因子的计算。
以Glu为内参物，计算其与其他16种氨基酸的相对校正因子，结果表明，16种氨基酸的相对校正因子RSD≤1.73%，详见表2。
表 2 16种氨基酸的相对校正因子Table 2. Relative correction factor of 17 amino acids序号 Asp Ser Gly His Thr Ala Arg Pro Tyr Val Met Ile Leu Phe Trp Lys 1 1.0540 1.6964 2.4030 1.1089 1.6728 2.3843 0.9907 1.5040 0.9562 1.7152 2.0534 1.6550 1.6295 1.2742 1.3764 1.3599 2 1.0432 1.7103 2.3989 1.1259 1.6581 2.3542 0.9756 1.5244 0.9749 1.6917 2.0500 1.6369 1.6350 1.2422 1.3686 1.3626 3 1.0530 1.6989 2.4054 1.1095 1.6658 2.3744 0.9853 1.5115 0.9498 1.7000 2.0472 1.6140 1.6343 1.2716 1.3630 1.3553 4 1.0373 1.7399 2.4482 1.1051 1.6842 2.3673 0.9986 1.5398 0.9682 1.7097 2.0431 1.6371 1.6337 1.2716 1.3797 1.3564 5 1.0533 1.7209 2.4159 1.1011 1.6682 2.3918 0.9965 1.5384 0.9324 1.7149 2.0424 1.6435 1.6431 1.2626 1.3635 1.3534 6 1.0439 1.6931 2.4533 1.1297 1.6830 2.3834 1.0115 1.5379 0.9384 1.7281 2.0625 1.6553 1.6317 1.2592 1.3825 1.3688 平均 1.0475 1.7099 2.4208 1.1133 1.6720 2.3759 0.9930 1.5260 0.9533 1.7099 2.0498 1.6403 1.6346 1.2636 1.3723 1.3594 RSD% 0.66 1.05 0.99 1.05 0.61 0.57 1.24 1.01 1.73 0.75 0.37 0.93 0.28 0.95 0.61 0.42 2.2.3 精密度试验
按“1.2.4.3”项下进行试验，结果显示，17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面积RSD（n=6）为0.89%、0.46%、1.08%、0.61%、1.17%、0.31%、0.50%、0.80%、0.80%、1.89%、0.45%、0.52%、0.90%、0.53%、0.88%、0.54%、0.57%，RSD 均小于2.0%，表示仪器的精密度良好。
2.2.4 重复性试验
按“1.2.4.4”项方法进行测定，结果显示，17种氨基酸峰（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）面积的RSD为0.56%、1.72%、1.87%、0.42%、1.53%、1.85%、1.49%、0.80%、0.93%、1.68%、0.60%、1.17%、0.92%、1.48%、0.77%、0.96%、1.65%，RSD 均小于2.0%，表明该方法具有较好的重复性。
2.2.5 稳定性试验
按“1.2.4.5”项方法进行测定，结果显示，17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）峰面积的 RSD为0.63%、1.48%、0.99%、1.37%、1.03%、1.49%、1.02%、1.41%、0.78%、0.67%、1.32%、1.24%、1.38%、0.75%、1.54%、1.24%、0.75%，RSD 均小于2.0%，说明样品供试溶液在24 h 内稳定。
2.2.6 加样回收率试验
按“1.2.4.6”项下进行试验，结果表明，羊肚菌中17种氨基酸的平均回收率在 92.42%~101.16%之间，RSD<2.0%，说明氨基酸的回收率较好。详见表3。
表 3 加样回收率试验结果Table 3. Result of recovery tests氨基酸 样品含量（mg） 加标量（mg） 测得量（mg） 平均回收率（%） RSD（%） Asp 0.1987 0.1987 0.3943 98.42 1.09 0.1987 0.1987 0.3969 0.1987 0.1987 0.3986 Glu 0.2481 0.2481 0.4970 96.25 1.94 0.2481 0.2481 0.5007 0.2481 0.2481 0.4914 Ser 0.1092 0.1092 0.2143 99.73 1.46 0.1092 0.1092 0.2154 0.1092 0.1092 0.2174 Gly 0.1039 0.1039 0.2075 95.65 1.15 0.1039 0.1039 0.2094 0.1039 0.1039 0.2072 His 0.0390 0.0390 0.0763 100.08 1.65 0.0390 0.0390 0.0776 0.0390 0.0390 0.0770 Thr 0.5084 0.5084 1.0173 92.42 0.25 0.5084 0.5084 1.0157 0.5084 0.5084 1.0182 Ala 0.1557 0.1557 0.2996 95.79 1.88 0.1557 0.1557 0.3050 0.1557 0.1557 0.3016 Arg 0.2235 0.2235 0.4376 100.95 1.16 0.2235 0.2235 0.4425 0.2235 0.2235 0.4411 Pro 0.1386 0.1386 0.2785 100.38 1.49 0.1386 0.1386 0.2745 0.1386 0.1386 0.2774 Tyr 0.0908 0.0908 0.1820 98.14 1.25 0.0908 0.0908 0.1828 0.0908 0.0908 0.1843 Val 0.1036 0.1036 0.2053 96.91 0.41 0.1036 0.1036 0.2055 0.1036 0.1036 0.2061 Met 0.0303 0.0303 0.0596 94.62 0.67 0.0303 0.0303 0.0596 0.0303 0.0303 0.0599 Ile 0.0919 0.0919 0.1789 101.16 1.17 0.0919 0.0919 0.1788 0.0919 0.0919 0.1769 Leu 0.1313 0.1313 0.2641 98.36 1.86 0.1313 0.1313 0.2635 0.1313 0.1313 0.2597 Phe 0.0848 0.0848 0.1682 92.99 0.68 0.0848 0.0848 0.1674 0.0848 0.0848 0.1685 Trp 0.0903 0.0903 0.1743 92.77 1.70 0.0903 0.0903 0.1734 0.0903 0.0903 0.1762 Lys 0.2228 0.2228 0.4295 100.32 1.62 0.2228 0.2228 0.4347 0.2228 0.2228 0.4285 2.2.7 样品含量测定
按“1.2.5”项下采用QAMS和内标法计算羊肚菌中17种氨基酸的含量，结果见表4。由表4可知，QAMS和内标法测定结果基本一致。对2种方法测得结果进行t检验分析，结果显示，2种方法测定的17种有效成分的含量均无显著差异（P>0.05）。说明一测多评法在测定羊肚菌氨基酸中的适用性和可行性得到了验证，在对照品缺乏的情况下，所建立的一测多评法可以作为一种经济、准确、快捷的方法应用羊肚菌质量的评价。
表 4 羊肚菌氨基酸含量测定（mg/mL）Table 4. Amino acid content of Morchella esculenta（mg/mL）批次 Glu Asp Ser Gly His Thr 内标法 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 1 0.0496 0.0396 0.0397 0.0214 0.0218 0.0204 0.0208 0.0070 0.0078 0.1012 0.1017 2 0.0498 0.0401 0.0399 0.0217 0.0219 0.0208 0.0210 0.0078 0.0079 0.1015 0.1018 3 0.0495 0.0391 0.0394 0.0212 0.0215 0.0207 0.0207 0.0078 0.0076 0.1008 0.1013 批次 Ala Arg Pro Tyr Val 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 1 0.0309 0.0311 0.0439 0.0447 0.0274 0.0277 0.0176 0.0182 0.0203 0.0207 2 0.0311 0.0314 0.0444 0.0449 0.0276 0.0279 0.0178 0.0183 0.0206 0.0209 3 0.0309 0.0310 0.0442 0.0444 0.0268 0.0272 0.0180 0.0180 0.0205 0.0205 批次 Met Ile Leu Phe Trp Lys 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 1 0.0057 0.0061 0.0180 0.0184 0.0258 0.0263 0.0166 0.0170 0.0177 0.0181 0.0444 0.0446 2 0.0063 0.0064 0.0184 0.0185 0.0260 0.0263 0.0167 0.0170 0.0182 0.0183 0.0448 0.0447 3 0.0059 0.0059 0.0180 0.0182 0.0256 0.0257 0.0166 0.0167 0.0179 0.0182 0.0443 0.0443 2.2.8 耐用性考察
2.2.8.1 不同色谱柱的考察
采用依利特 Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm, 5 μm）、Agilent C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）色谱柱在Agilent 1100 HPLC测定16种氨基酸的相对校正因子影响见表5。由表5可知，16种氨基酸的相对校正因子在不同色谱柱下的RSD均小于1.85%，说明相对校正因子在不同品牌色谱柱下具有良好的重复性。
表 5 不同色谱柱、色谱仪对相对校正因子的影响Table 5. Effect of different chromatographic columns and instruments on RCF氨基酸 Agilent 1100 HPLC Hypersil ODS2 依利特ODS2 Agilent C18 RSD（%） Agilent 1100 HPLC Agilent 1260 HPLC RSD（%） Asp 1.0415 1.0486 0.48 1.0488 1.0500 0.08 Ser 1.7041 1.7027 0.06 1.7065 1.6939 0.53 Gly 2.4270 2.4149 0.35 2.4174 2.4240 0.19 His 1.1180 1.1004 1.12 1.1192 1.1116 0.48 Thr 1.6695 1.6311 1.65 1.6526 1.6660 0.57 Ala 2.3843 2.3313 1.59 2.3905 2.3791 0.34 Arg 0.9907 0.9867 0.28 0.9835 0.9817 0.12 Pro 1.5160 1.5064 0.45 1.5296 1.5640 1.57 Tyr 0.9535 0.9475 0.44 0.9590 0.9774 1.34 Val 1.6951 1.7238 1.19 1.6920 1.6692 0.96 Met 2.0534 2.0226 1.07 2.0004 1.9877 0.45 Ile 1.6550 1.6369 0.77 1.6140 1.6006 0.59 Leu 1.6295 1.6034 1.14 1.6343 1.6082 1.14 Phe 1.2742 1.2618 0.69 1.2588 1.2321 1.51 Trp 1.3709 1.3355 1.85 1.3520 1.3333 0.98 Lys 1.3524 1.3372 0.80 1.3441 1.3188 1.34 2.2.8.2 不同仪器的考察
采用依利特 Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm, 5 μm）色谱柱，考察Agilent 1100 HPLC、Agilent 1260 HPLC 对16种氨基酸相对校正因子的影响见表5。由表5可知，不同仪器下的氨基酸相对校正因子的RSD均不大于1.57%，重复性良好，说明此方法适用于不同的色谱体系。
2.2.8.3 色谱峰定位
色谱峰的准确定位是保证QAMS法应用的前提。以谷氨酸为内参物，采用不同色谱柱及高效液相色谱仪，验证相对保留时间定位色谱峰的准确性，详见表6。由表6可知，在不同色谱柱和色谱系统下，相对保留时间变化幅度较小，RSD均≤1.14%，可准确定位。
表 6 不同色谱柱、色谱仪的相对保留时间Table 6. Relative retention times of different chromatographic columns and instruments氨基酸 Agilent 1100 HPLC Hypersil ODS2 依利特ODS2 Agilent C18 RSD（%） Agilent 1100 HPLC Agilent 1260 HPLC RSD（%） Asp 1.254 1.255 0.05 1.252 1.254 0.10 Ser 0.527 0.524 0.42 0.527 0.524 0.36 Gly 0.489 0.486 0.41 0.489 0.487 0.36 His 0.408 0.404 0.80 0.410 0.412 0.37 Thr 0.332 0.334 0.28 0.332 0.334 0.55 Ala 0.306 0.306 0.16 0.304 0.306 0.34 Arg 0.277 0.275 0.49 0.276 0.275 0.27 Pro 0.236 0.237 0.06 0.236 0.235 0.27 Tyr 0.185 0.182 1.14 0.186 0.184 0.61 Val 0.180 0.177 1.04 0.181 0.179 0.46 Met 0.173 0.170 1.10 0.174 0.172 0.57 Ile 0.165 0.162 1.12 0.166 0.165 0.57 Leu 0.164 0.161 1.12 0.165 0.163 0.56 Phe 0.157 0.154 1.14 0.158 0.156 0.59 Trp 0.154 0.152 0.93 0.155 0.154 0.38 Lys 0.150 0.147 1.14 0.150 0.149 0.57 2.3 不同地区羊肚菌的测定
采用一测多评法测定6个地区羊肚菌中17种氨基酸的含量见表7。由表7可知，羊肚菌富含8种必需氨基酸，其占氨基酸总量的47.22%~55.34%，其中Thr含量是最高的，占总量的16.55%~21.77%。甜味氨基酸占总量的36.60%~45.77%，鲜味氨基酸占总量的21.63%~27.34%。Leu和Val具有焙烤风味和特殊甜味，这些氨基酸在羊肚菌香味的形成过程中有重要作用，这是羊肚菌具有独特风味的重要原因。
表 7 不同地区羊肚菌氨基酸含量测定（g/100 g）Table 7. Amino acid content of Morchella esculenta（g/100 g）氨基酸 长坡森林 乌当 铜仁 剑河 云南 新疆 Asp 2.110±0.045 2.150±0.077 2.031±0.027 1.794±0.049 1.983±0.025 1.322±0.025 Glu 2.825±0.069 2.435±0.097 2.658±0.042 2.094±0.018 2.477±0.034 1.421±0.023 Ser 1.265±0.025 0.997±0.012 0.960±0.017 0.969±0.018 1.090±0.018 0.769±0.008 Gly 1.113±0.021 1.036±0.017 1.023±0.011 0.980±0.019 1.020±0.021 0.825±0.007 His 1.046±0.011 0.870±0.015 1.170±0.018 1.203±0.017 0.385±0.002 0.515±0.004 Thr* 4.877±0.083 5.164±0.083 5.147±0.069 4.429±0.096 5.085±0.097 3.607±0.076 Ala 1.256±0.010 1.447±0.017 1.400±0.026 1.190±0.026 1.558±0.017 0.944±0.016 Arg 2.855±0.092 2.057±0.065 1.989±0.060 2.195±0.045 2.229±0.056 0.622±0.007 Pro 1.185±0.025 1.160±0.020 1.035±0.014 1.042±0.020 1.384±0.020 0.889±0.014 Tyr 1.165±0.018 1.112±0.019 1.300±0.025 0.943±0.014 0.920±0.014 1.528±0.034 Val* 1.291±0.022 1.341±0.032 1.347±0.033 2.050±0.055 1.042±0.008 0.936±0.013 Met* 0.453±0.004 0.253±0.001 0.365±0.003 0.332±0.002 0.308±0.002 0.313±0.002 Ile* 1.125±0.015 1.050±0.021 1.053±0.021 1.001±0.017 0.929±0.013 0.824±0.009 Leu * 1.651±0.042 1.471±0.025 1.512±0.027 1.374±0.028 1.335±0.026 1.113±0.011 Phe* 1.007±0.019 0.959±0.018 0.953±0.017 0.966±0.012 0.840±0.014 0.706±0.010 Trp* 1.060±0.021 0.912±0.012 0.778±0.008 1.621±0.039 0.912±0.013 0.179±0.001 Lys* 2.544±0.085 2.785±0.087 2.539±0.061 2.126±0.065 2.245±0.050 1.443±0.023 TAA 28.827±1.099 27.197±1.364 27.259±1.379 26.311±1.037 25.743±1.619 17.952±1.733 EAA 14.007±0.116 13.934±1.329 13.694±0.503 13.900±0.208 12.697±0.723 9.119 ±0.299 NEAA 14.820±0.512 13.263±0.703 13.566±0.386 12.411±0.464 13.046±0.606 8.833±0.703 注：*为人体必需氨基酸；鲜味氨基酸（Asp、Glu、Lys）；甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro）；药用氨基酸（Met、Asp、Glu、Phe、Lys、Leu、Arg、Tyr、Gly）。 药用氨基酸种类齐全，占氨基酸总量的47.74%~56.42%，其中Glu、Lys平均占药用氨基酸总量的17.29%、17.05%。羊肚菌中含有的丰富赖氨酸可以补充谷物中赖氨酸的不足，Glu对脑神经损伤、癫痫有效，还具有护肝功效。综上所述，羊肚菌富含各类药用氨基酸为其开发各种保健食品、药品以及日常食用的药膳提供了一定的基础。
不同产地羊肚菌之间氨基酸总量有明显差异，长坡岭森林公园下野生的羊肚菌样品氨基酸总量最高，新疆羊肚菌氨基酸总量最少，且不同地区的各氨基酸含量有一定差异，由此可知，其品质差异与其环境、气候、种植方式等因素有关。
对六个不同地区的羊肚菌氨基酸测定结果显示，羊肚菌中氨基酸含量丰富，且富含人体所需的必需氨基酸和药用氨基酸，有较高的食用价值，可作为人体必需氨基酸营养的天然来源之一，且极具开发作为补充氨基酸的功能性食品；其鲜味、甜味氨基酸含量较高，是开发食品调味剂的天然宝库。综上所述，羊肚菌在食品、医疗领域具有很大的开发潜力和广阔的应用前景。
3. 结论
采用QAMS法测定羊肚菌中17种氨基酸的含量，建立并应用内标法验证该方法同时测定羊肚菌中17种氨基酸含量的可行性，结果表明，两种方法测得的结果无显著性差异（P>0.05），不同色谱柱和仪器之间的相对校正因子重复性良好，且QAMS法操作简单，极大程度提高了工作效率，可为建立羊肚菌的质量评价提供参考。同时，为羊肚菌的应用提供一定的理论支持，为羊肚菌的开发利用指明了方向，对推动羊肚菌行业的发展有重要意义。
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图 1 羊肚菌氨基酸高效液相色谱图
注：A：空白;B：氨基酸对照品;C：羊肚菌样品。
Figure 1. HPLC analysis of amino acids in Morchella esculenta
表 1 17 种氨基酸的线性回归方程
Table 1 Linearity relationships of 17 kinds of amino acids
氨基酸 线性回归方程 线性范围（mg/mL） R2 Asp y=4743.8x+39.433 0.0099~0.1588 0.9993 Glu y=4437.8x+46.821 0.0124~0.1984 0.9990 Ser y=9075.8x+18.288 0.0054~0.0872 0.9996 Gly y=13024x+22.521 0.0052~0.0832 0.9991 His y=7350.8x+15.929 0.0020~0.0312 0.9992 Thr y=8382.9x+50.338 0.0254~0.4068 0.9991 Ala y=13661x+12.329 0.0078~0.1244 0.9992 Arg y=4690.2x+5.8 0.0112~0.1788 0.9998 Pro y=7841.1x+39.221 0.0069~0.1108 0.9990 Tyr y=6876.9x−2.5583 0.0046~0.0728 0.9993 Val y=8890.4x+22.413 0.0052~0.0828 0.9990 Met y=8774.4x+19.958 0.0015~0.0240 0.9993 Ile y=9859.5x−1.6917 0.0046~0.0736 0.9992 Leu y=9427.4x+9.775 0.0066~0.1048 0.9994 Phe y=7605.4x+8.0167 0.0042~0.0680 0.9995 Trp y=7493.9x+16.479 0.0045~0.0724 0.9992 Lys y=8462.9x−4.5417 0.0112~0.1784 0.9992 
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表 2 16种氨基酸的相对校正因子
Table 2 Relative correction factor of 17 amino acids
序号 Asp Ser Gly His Thr Ala Arg Pro Tyr Val Met Ile Leu Phe Trp Lys 1 1.0540 1.6964 2.4030 1.1089 1.6728 2.3843 0.9907 1.5040 0.9562 1.7152 2.0534 1.6550 1.6295 1.2742 1.3764 1.3599 2 1.0432 1.7103 2.3989 1.1259 1.6581 2.3542 0.9756 1.5244 0.9749 1.6917 2.0500 1.6369 1.6350 1.2422 1.3686 1.3626 3 1.0530 1.6989 2.4054 1.1095 1.6658 2.3744 0.9853 1.5115 0.9498 1.7000 2.0472 1.6140 1.6343 1.2716 1.3630 1.3553 4 1.0373 1.7399 2.4482 1.1051 1.6842 2.3673 0.9986 1.5398 0.9682 1.7097 2.0431 1.6371 1.6337 1.2716 1.3797 1.3564 5 1.0533 1.7209 2.4159 1.1011 1.6682 2.3918 0.9965 1.5384 0.9324 1.7149 2.0424 1.6435 1.6431 1.2626 1.3635 1.3534 6 1.0439 1.6931 2.4533 1.1297 1.6830 2.3834 1.0115 1.5379 0.9384 1.7281 2.0625 1.6553 1.6317 1.2592 1.3825 1.3688 平均 1.0475 1.7099 2.4208 1.1133 1.6720 2.3759 0.9930 1.5260 0.9533 1.7099 2.0498 1.6403 1.6346 1.2636 1.3723 1.3594 RSD% 0.66 1.05 0.99 1.05 0.61 0.57 1.24 1.01 1.73 0.75 0.37 0.93 0.28 0.95 0.61 0.42
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表 3 加样回收率试验结果
Table 3 Result of recovery tests
氨基酸 样品含量（mg） 加标量（mg） 测得量（mg） 平均回收率（%） RSD（%） Asp 0.1987 0.1987 0.3943 98.42 1.09 0.1987 0.1987 0.3969 0.1987 0.1987 0.3986 Glu 0.2481 0.2481 0.4970 96.25 1.94 0.2481 0.2481 0.5007 0.2481 0.2481 0.4914 Ser 0.1092 0.1092 0.2143 99.73 1.46 0.1092 0.1092 0.2154 0.1092 0.1092 0.2174 Gly 0.1039 0.1039 0.2075 95.65 1.15 0.1039 0.1039 0.2094 0.1039 0.1039 0.2072 His 0.0390 0.0390 0.0763 100.08 1.65 0.0390 0.0390 0.0776 0.0390 0.0390 0.0770 Thr 0.5084 0.5084 1.0173 92.42 0.25 0.5084 0.5084 1.0157 0.5084 0.5084 1.0182 Ala 0.1557 0.1557 0.2996 95.79 1.88 0.1557 0.1557 0.3050 0.1557 0.1557 0.3016 Arg 0.2235 0.2235 0.4376 100.95 1.16 0.2235 0.2235 0.4425 0.2235 0.2235 0.4411 Pro 0.1386 0.1386 0.2785 100.38 1.49 0.1386 0.1386 0.2745 0.1386 0.1386 0.2774 Tyr 0.0908 0.0908 0.1820 98.14 1.25 0.0908 0.0908 0.1828 0.0908 0.0908 0.1843 Val 0.1036 0.1036 0.2053 96.91 0.41 0.1036 0.1036 0.2055 0.1036 0.1036 0.2061 Met 0.0303 0.0303 0.0596 94.62 0.67 0.0303 0.0303 0.0596 0.0303 0.0303 0.0599 Ile 0.0919 0.0919 0.1789 101.16 1.17 0.0919 0.0919 0.1788 0.0919 0.0919 0.1769 Leu 0.1313 0.1313 0.2641 98.36 1.86 0.1313 0.1313 0.2635 0.1313 0.1313 0.2597 Phe 0.0848 0.0848 0.1682 92.99 0.68 0.0848 0.0848 0.1674 0.0848 0.0848 0.1685 Trp 0.0903 0.0903 0.1743 92.77 1.70 0.0903 0.0903 0.1734 0.0903 0.0903 0.1762 Lys 0.2228 0.2228 0.4295 100.32 1.62 0.2228 0.2228 0.4347 0.2228 0.2228 0.4285
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表 4 羊肚菌氨基酸含量测定（mg/mL）
Table 4 Amino acid content of Morchella esculenta（mg/mL）
批次 Glu Asp Ser Gly His Thr 内标法 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 1 0.0496 0.0396 0.0397 0.0214 0.0218 0.0204 0.0208 0.0070 0.0078 0.1012 0.1017 2 0.0498 0.0401 0.0399 0.0217 0.0219 0.0208 0.0210 0.0078 0.0079 0.1015 0.1018 3 0.0495 0.0391 0.0394 0.0212 0.0215 0.0207 0.0207 0.0078 0.0076 0.1008 0.1013 批次 Ala Arg Pro Tyr Val 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 1 0.0309 0.0311 0.0439 0.0447 0.0274 0.0277 0.0176 0.0182 0.0203 0.0207 2 0.0311 0.0314 0.0444 0.0449 0.0276 0.0279 0.0178 0.0183 0.0206 0.0209 3 0.0309 0.0310 0.0442 0.0444 0.0268 0.0272 0.0180 0.0180 0.0205 0.0205 批次 Met Ile Leu Phe Trp Lys 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 内标法 QAMS 1 0.0057 0.0061 0.0180 0.0184 0.0258 0.0263 0.0166 0.0170 0.0177 0.0181 0.0444 0.0446 2 0.0063 0.0064 0.0184 0.0185 0.0260 0.0263 0.0167 0.0170 0.0182 0.0183 0.0448 0.0447 3 0.0059 0.0059 0.0180 0.0182 0.0256 0.0257 0.0166 0.0167 0.0179 0.0182 0.0443 0.0443
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表 5 不同色谱柱、色谱仪对相对校正因子的影响
Table 5 Effect of different chromatographic columns and instruments on RCF
氨基酸 Agilent 1100 HPLC Hypersil ODS2 依利特ODS2 Agilent C18 RSD（%） Agilent 1100 HPLC Agilent 1260 HPLC RSD（%） Asp 1.0415 1.0486 0.48 1.0488 1.0500 0.08 Ser 1.7041 1.7027 0.06 1.7065 1.6939 0.53 Gly 2.4270 2.4149 0.35 2.4174 2.4240 0.19 His 1.1180 1.1004 1.12 1.1192 1.1116 0.48 Thr 1.6695 1.6311 1.65 1.6526 1.6660 0.57 Ala 2.3843 2.3313 1.59 2.3905 2.3791 0.34 Arg 0.9907 0.9867 0.28 0.9835 0.9817 0.12 Pro 1.5160 1.5064 0.45 1.5296 1.5640 1.57 Tyr 0.9535 0.9475 0.44 0.9590 0.9774 1.34 Val 1.6951 1.7238 1.19 1.6920 1.6692 0.96 Met 2.0534 2.0226 1.07 2.0004 1.9877 0.45 Ile 1.6550 1.6369 0.77 1.6140 1.6006 0.59 Leu 1.6295 1.6034 1.14 1.6343 1.6082 1.14 Phe 1.2742 1.2618 0.69 1.2588 1.2321 1.51 Trp 1.3709 1.3355 1.85 1.3520 1.3333 0.98 Lys 1.3524 1.3372 0.80 1.3441 1.3188 1.34
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表 6 不同色谱柱、色谱仪的相对保留时间
Table 6 Relative retention times of different chromatographic columns and instruments
氨基酸 Agilent 1100 HPLC Hypersil ODS2 依利特ODS2 Agilent C18 RSD（%） Agilent 1100 HPLC Agilent 1260 HPLC RSD（%） Asp 1.254 1.255 0.05 1.252 1.254 0.10 Ser 0.527 0.524 0.42 0.527 0.524 0.36 Gly 0.489 0.486 0.41 0.489 0.487 0.36 His 0.408 0.404 0.80 0.410 0.412 0.37 Thr 0.332 0.334 0.28 0.332 0.334 0.55 Ala 0.306 0.306 0.16 0.304 0.306 0.34 Arg 0.277 0.275 0.49 0.276 0.275 0.27 Pro 0.236 0.237 0.06 0.236 0.235 0.27 Tyr 0.185 0.182 1.14 0.186 0.184 0.61 Val 0.180 0.177 1.04 0.181 0.179 0.46 Met 0.173 0.170 1.10 0.174 0.172 0.57 Ile 0.165 0.162 1.12 0.166 0.165 0.57 Leu 0.164 0.161 1.12 0.165 0.163 0.56 Phe 0.157 0.154 1.14 0.158 0.156 0.59 Trp 0.154 0.152 0.93 0.155 0.154 0.38 Lys 0.150 0.147 1.14 0.150 0.149 0.57
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表 7 不同地区羊肚菌氨基酸含量测定（g/100 g）
Table 7 Amino acid content of Morchella esculenta（g/100 g）
氨基酸 长坡森林 乌当 铜仁 剑河 云南 新疆 Asp 2.110±0.045 2.150±0.077 2.031±0.027 1.794±0.049 1.983±0.025 1.322±0.025 Glu 2.825±0.069 2.435±0.097 2.658±0.042 2.094±0.018 2.477±0.034 1.421±0.023 Ser 1.265±0.025 0.997±0.012 0.960±0.017 0.969±0.018 1.090±0.018 0.769±0.008 Gly 1.113±0.021 1.036±0.017 1.023±0.011 0.980±0.019 1.020±0.021 0.825±0.007 His 1.046±0.011 0.870±0.015 1.170±0.018 1.203±0.017 0.385±0.002 0.515±0.004 Thr* 4.877±0.083 5.164±0.083 5.147±0.069 4.429±0.096 5.085±0.097 3.607±0.076 Ala 1.256±0.010 1.447±0.017 1.400±0.026 1.190±0.026 1.558±0.017 0.944±0.016 Arg 2.855±0.092 2.057±0.065 1.989±0.060 2.195±0.045 2.229±0.056 0.622±0.007 Pro 1.185±0.025 1.160±0.020 1.035±0.014 1.042±0.020 1.384±0.020 0.889±0.014 Tyr 1.165±0.018 1.112±0.019 1.300±0.025 0.943±0.014 0.920±0.014 1.528±0.034 Val* 1.291±0.022 1.341±0.032 1.347±0.033 2.050±0.055 1.042±0.008 0.936±0.013 Met* 0.453±0.004 0.253±0.001 0.365±0.003 0.332±0.002 0.308±0.002 0.313±0.002 Ile* 1.125±0.015 1.050±0.021 1.053±0.021 1.001±0.017 0.929±0.013 0.824±0.009 Leu * 1.651±0.042 1.471±0.025 1.512±0.027 1.374±0.028 1.335±0.026 1.113±0.011 Phe* 1.007±0.019 0.959±0.018 0.953±0.017 0.966±0.012 0.840±0.014 0.706±0.010 Trp* 1.060±0.021 0.912±0.012 0.778±0.008 1.621±0.039 0.912±0.013 0.179±0.001 Lys* 2.544±0.085 2.785±0.087 2.539±0.061 2.126±0.065 2.245±0.050 1.443±0.023 TAA 28.827±1.099 27.197±1.364 27.259±1.379 26.311±1.037 25.743±1.619 17.952±1.733 EAA 14.007±0.116 13.934±1.329 13.694±0.503 13.900±0.208 12.697±0.723 9.119 ±0.299 NEAA 14.820±0.512 13.263±0.703 13.566±0.386 12.411±0.464 13.046±0.606 8.833±0.703 注：*为人体必需氨基酸；鲜味氨基酸（Asp、Glu、Lys）；甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro）；药用氨基酸（Met、Asp、Glu、Phe、Lys、Leu、Arg、Tyr、Gly）。
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