Rheological Properties and Microstructure of Zein Dough under the Control of Lactic Acid
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摘要: 改善无麸质谷物食品品质一直是科学家关注的热点。本研究以玉米醇溶蛋白、玉米淀粉、沙蒿胶为原料,制备玉米醇溶蛋白基无麸质面团。采用两种乳酸引入方式,通过调节面团中乳酸和玉米醇溶蛋白的比例(L/Z比),探究乳酸对玉米醇溶蛋白基无麸质面团的流变性质和面团中玉米醇溶蛋白微观结构的影响规律。结果表明:面团中L/Z比的增加,会导致乳酸添加组(T面团)和乳酸预处理玉米醇溶蛋白组面团(C面团)的储能模量(G′)下降,损耗系数(tanδ)逐渐上升。乳酸引入方式的不同,会导致面团的流变性能存在差异。当L/Z比一定时,T面团的G′低于C面团,tanδ高于C面团。随面团中L/Z比增加,T面团的拉伸性能呈先上升后下降趋势,当L/Z比从0:10增加到2:10时(T0~T2),T面团的拉伸性逐渐提高,面团中玉米醇溶蛋白团块状聚集减少,逐渐联结成网;T2拉伸性能最佳,面团中玉米醇溶蛋白网络质地均一,具备应用潜力;T3~T5时,面团的拉伸性逐渐下降,面团中玉米醇溶蛋白网络变弱,对淀粉颗粒包裹水平下降。C面团拉伸性较差,无法有效进行相关实验,可能与面团中未能构建起结实而连贯的蛋白质网络有关。Abstract: Improving the edible quality of gluten-free cereal foods has always been a hot topic for scientists. In this study, zein-based gluten-free dough was prepared with zein, corn starch, and Artemisia sphaerocephala Krasch gum as raw materials. Using two methods of introducing lactic acid, by adjusting the ratio of lactic acid to zein in dough (L/Z ratio), the rheological properties of zein-based gluten-free dough and the microstructure of zein were investigated. The study found that increasing of L/Z ratio in dough would lead to the decrease of storage modulus (G′) and the increase of loss coefficient (tanδ) of lactic acid added group (T dough) and lactic acid pretreated zein-based dough (C dough). Different ways of lactic acid introduction would lead to different rheological properties of dough. When the L/Z ratio was constant, the G' of T dough was lower than that of C dough, and the tanδ was higher than that of C dough. Compared with C dough, T dough had more practical value. As the L/Z ratio in the dough increasing, the tensile properties of T dough increased first and then decreased, when the L/Z ratio increased from 0:10 to 2:10 (T0~T2), the stretch of the T dough gradually increased, the mass aggregation of zein in dough decreased, and connected into a network gradually. T2 had the best tensile properties, the texture of zein network in dough was uniform, and had the application potential. As T3~T5, the stretchability of the dough gradually decreased, the network of zein in dough became weaker, and the level of starch granules encapsulation decreasesd. C dough had poor stretchability and could not effectively to carry out related experiments, which might be related to the failure to build a strong and coherent protein network in the dough.
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无麸质食品主要面向约占世界总人口1%的乳糜泻易感人群[1],以应对因摄入麸质而引起的肠道不适。无麸质谷物食品市场广阔,售价偏高[2],但产品的加工性能一般,品质较差,品类受限。在谷物研究领域,备受关注。玉米醇溶蛋白作为玉米淀粉工业的副产物之一[3],来源广泛,储量巨大。玉米醇溶蛋白在适当的pH环境下,能够形成蛋白质网络[4],具备近似面筋蛋白的功能,是开发无麸质谷物食品的理想原料。有研究表明,添加有机酸可以增强玉米醇溶蛋白的相互作用,促进玉米醇溶蛋白纤维态化,利于蛋白质网络的构建[5],提高玉米醇溶蛋白的功能特性,使体系在宏观上表现出良好的黏弹性、拉伸性[4]。目前,相关研究大多停留于有机酸对玉米醇溶蛋白单质的理化性质调控,仅有Sly等[4]研究了40 ℃以上时,添加少量乳酸/乙酸对玉米醇溶蛋白基面团流变特性及蛋白质构象的影响。但常温条件下(约25 ℃),有机酸调控玉米醇溶蛋白基面团加工性能的相关研究有待补充。相比醒发酸面团来制备谷物食品,添加有机酸对面团进行直接酸化,无需严格控制醒发条件,经历长时间的恒温处理,使生产过程更加简便易于操作[6],提高生产效率,降低成本,具备研究意义。Mattice等[7]发现有机酸的预处理可提高玉米醇溶蛋白延展性,优化网络结构,但未做进行应用研究。以乳酸预处理玉米醇溶蛋白为蛋白质基制备面团,研究其流变特性和微观结构,具有探究意义。在谷物面团的醒发环节,微生物通过自身代谢,促使面团富集乳酸[8]。作为食物中常见天然成分,将乳酸应用于食品中,具有较高的相容性[6]。
本研究以玉米醇溶蛋白、玉米淀粉和沙蒿胶为原料,构建玉米醇溶蛋白基无麸质面团。选用乳酸作为玉米醇溶蛋白基无麸质面团调控用酸,采用两种乳酸引入方式,设置乳酸添加组(T面团)和乳酸预处理玉米醇溶蛋白组面团(C面团),探讨玉米醇溶蛋白基无麸质面团中乳酸和玉米醇溶蛋白比例(L/Z比)对面团流变性质及面团中玉米醇溶蛋白微观结构的影响规律。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
乳酸 分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;玉米醇溶蛋白 西格玛里奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司,货号Z3625;沙蒿胶 上海源叶生物科技有限公司;玉米淀粉 黑龙江鹏程生化有限公司,直链淀粉含量24.49%±1.41%,支链淀粉含量75.87%±1.90%;实验用水 均为蒸馏水。
DT2000电子天平 常熟市嘉衡天平仪器有限公司;AB-SF16A和面机 珠海市北美电器(珠海)有限公司;Phycica MCR 301流变仪 奥地利安东帕(Anton Paar)有限公司;Extensograph-E拉伸仪 德国布拉班德(Brabender)公司;FD-1C-80真空冷冻干燥机 海市比郎仪器制造有限公司;SIGMA HD扫描电子显微镜 德国蔡司(Carl Zeiss Microscopy GmbH)公司;LUMPOS独立式红外显微成像系统 德国布鲁克(Bruker)公司。
1.2 实验方法
1.2.1 乳酸预处理玉米醇溶蛋白制备
将玉米醇溶蛋白分别置于梯度浓度乳酸水溶液中,乳酸和玉米醇溶蛋白比例分别为0:10、1:10、2:10、3:10、4:10、5:10(v/w),混合均匀。于25 ℃下混合静置6 h,使其充分反应。于40 ℃的烘箱中使之干燥,打粉过筛,得到乳酸预处理玉米醇溶蛋白。取少量蛋白质,用水进行多次揉搓洗涤。根据徐伟等[9]检测方法,通过液相测取洗涤用水中乳酸含量,计算推导出乳酸预处理玉米醇溶蛋白中残留乳酸含量。
1.2.2 玉米醇溶蛋白基面团制备
1.2.2.1 乳酸添加组面团(T面团)
将玉米醇溶蛋白、沙蒿胶和玉米淀粉按10:1:39(w/w/w)的比例充分混合,作为面团原料。加入乳酸水溶液,经和面机揉混5 min后,用压面机对折碾压8次,制得面团中乳酸和玉米醇溶蛋白比例(L/Z比)为1:10、2:10、3:10、4:10、5:10(v/w),分别记为T0、T1、T2、T3、T4、T5。置于自封袋中,25 ℃下静置30 min消去面团中应力后,进行后续检测。
1.2.2.2 乳酸处理组面团(C面团)
将乳酸预处理玉米醇溶蛋白、沙蒿胶、玉米淀粉按10:1:39(w/w/w)的比例充分混合,作为面团原料。为保证制得面团中L/Z比为1:10、2:10、3:10、4:10、5:10(v/w),需补充少许乳酸,加蒸馏水,和面机揉混5 min后,用压面机对折碾压8次,分别记为C0、C1、C2、C3、C4、C5。
1.2.3 动态流变学检测
用流变仪,分别测定不同L/Z比的T和C面团动态流变特性。参考Girard等[10]的方法,取面团中心部分,置于流变检测台上,平板间距2.0 mm,设定实验温度25 ℃。待平板压下后,用塑料刮刀切去样品延展于平板外的多余部分,并在样品边缘滴加些许硅油,抑制测试过程中样品的水分散失。在动态测量模式下,确定频率为1 Hz时,面团处于线性黏弹区域内,检测中面团结构不被破坏。根据频率扫描程序测定面团的动态流变学性质,设定扫描频率为0.1~10 Hz,对面团储能模量(G′)、损耗模量(G′′)和损耗系数(tanδ)随扫描频率的变化进行测定。
1.2.4 拉伸实验
参考魏益民等[11]的方法,并略作调整。通过Brabender拉伸仪,系统地测定了T面团的拉伸性能。
1.2.5 扫描电镜观测
参考Wang等[12]的方法。将不同L/Z比的T面团和C面团,进行真空冷冻干燥,挑取截面平整的冻干面团固定于样品台上,用离子溅射仪对表面喷金,于2 kV加速电压下,放大1000倍进行观测。
1.2.6 红外显微成像分析
参考Wang等[13]的方法。在红外显微成像系统的衰减全反射(ATR)模式下,对冻干后的T面团和C面团,进行蛋白质分布分析。选取较为平滑的面团截面,实施随机面阵采样。设空气为参比背景光谱,光谱分辨率4 cm−1,波数范围为4000~600 cm−1,采集红外光谱图成像面积为375 μm×375 μm,空间分辨率25 μm×25 μm。对酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ区1715~1484 cm−1的峰进行积分,得到能够表示面团中蛋白质分布的2 D伪彩图[14-15]。
1.3 数据处理
所有实验至少重复2次,平行3次,结果以均值±标准方差表示。基于SPSS 21软件对数据进行方差分析(ANOVA),置信区间P<0.05。使用Origin2018软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 动态流变特性
G′反映面团弹性;G′′反映面团黏性;tanδ=G′′/G′,是综合表征面团粘弹性的指标[16]。由图1可知,两组面团的G′和G′′值均受制于振荡频率,具有典型的黏弹性流体特征[17];G′值远高于G′′值,tanδ<1,机械特征以弹性为主[18]。比较发现,T0和C0间的G′、G′′、tanδ无明显差异,但相等L/Z比的T和C面团的G′、G′′、tanδ数值差异明显。
乳酸的添加,影响到玉米醇溶蛋白的结构状态,使面团黏性增加,强化了T面团的流体特征。图1中,随L/Z比增加,T面团的G′和G′′逐渐下降,tanδ逐渐上升。T5的G′和G′′分别降至T0的22.59%和38.65%,而T5的tanδ上升至T0的1.71倍,是因为添加乳酸引起面团弹性和黏性的下降,但黏性下降程度远小于弹性,使tanδ上升,即面团流体特征增强,更适于加工操作。在酸化小麦面团的研究中,同样发现有机酸会导致面团硬度下降,测得G′、G′′值减小[19-20]。研究认为酸性环境会影响玉米醇溶蛋白构象,进而导致面团G′和G′′发生下降[21];增加黏性基团占比,使面团的tanδ上升[22]。
不同的乳酸引入方式,造成了T和C面团之间流变性质的差异。相比C面团,T面团更具黏性特征。L/Z比一定时,T面团有更小的G′和G′′,更高的tanδ,但这种差距随L/Z比增加而减小。如T1的G′和G′′,分别仅是C1的19.98%和31.64%,而T5的G′和G′′,分别为C5的34.51%和56.19%。
C面团的G′、G′′,同样会随L/Z比的增加而逐渐上升,且变化幅度较大。少量的乳酸,强化了面团粘弹性特征,使面团在宏观上更趋向于固体[23],C1的G′和G′′,分别为C0的2.70和2.16倍。但随L/Z比持续提高,面团G′和G′′逐渐下降,C5的G′和G′′分别降至C0的71.40%和68.79%。C面团的tanδ随L/Z比的增加而逐渐上升,但均低于C0。C1的tanδ仅为C0的80.23%,而C5的tanδ与C0基本相等。乳酸含量对C面团动态流变性能的影响规律可能与预处理过程中玉米醇溶蛋白的脱酰胺反应及蛋白质水解有关[7]。
2.2 拉伸特性
C0与T0拉伸性无显著差异(P>0.05),C1~C5则可能因tanδ较小,黏性占比低,面团拉伸性能不足,而无法有效实验。本实验仅对T面团进行了系统的拉伸性检测,探讨L/Z比对玉米醇溶蛋白基面团拉伸性的影响。
拉伸能量反映了面团筋力,与谷物的烘焙品质正相关[24]。拉伸阻力代表了面团的韧性和筋力;延展性代表了面团的延展能力和可塑性[23]。拉伸比值是对面团拉伸阻力和延展性的质量综合评价[25],拉伸比大的面团,具备较好的醒发持气性[26]。
Sly等[4]手动进行了拉伸实验,提出随乳酸含量增加,玉米醇溶蛋白基面团延展性提高,拉伸距离增加。本实验采用更专业的拉伸性检测设备,全面地分析了拉伸性相关参数。发现调价乳酸比例可以实现对T面团拉伸性的双向调控。在一定范围内,增加L/Z比(T1~T3),强化了面团拉伸性能,但过量的乳酸(T4、T5)会弱化面团的拉伸性,导致筋力和延展性明显下降(P<0.05)。由表1可知,面团的拉伸能量、拉伸阻力、拉伸距离、拉伸比值,随L/Z比增加,均呈先上升后下降趋势,且反映面团拉伸指标的峰值,多数集中于T2。在有机酸对小麦面团拉伸性的研究中认为适量的有机酸在一定程度上能够弱化面团,有利于增加面团的拉伸性能[19-20]。对于玉米醇溶蛋白基面团来说,适量的乳酸同样增加了面团的拉伸性能,但过量的酸会对蛋白质结构造成破坏,使反映面团拉伸性能的各指标下降。随L/Z比增加(T0~T2),T面团拉伸性变化规律与动态流变结果有所出入,这是因为体系中的H+会抑制玉米醇溶蛋白的聚集[27],添加乳酸,使面团中H+浓度增加,蛋白质分子间、分子内静电斥力增大,玉米醇溶蛋白结构柔性增强,在外力作用下,易于舒展,使面团强度减小,G′和G′′下降。与此同时,玉米醇溶蛋白将原本被卷覆与结构内部的疏水性基团暴露在外,分子间通过疏水性相互作用联接成网,增强了面团延展性。但随着L/Z比(T3~T5)的进一步提高,面团H+浓度增大逐渐抵消了疏水性相互作用对面团拉伸性的积极作用,造成T面团拉伸性的下降。
表 1 T0~T5的拉伸性Table 1. Stretchability of T0~T5样品编号 拉伸能量(cm2) 拉伸阻力(BU) 拉伸距离(mm) 拉伸比值(B·mm−1) T0 24.96±2.61de 51.20±2.49b 31.72±1.39d 1.52±0.01c T1 37.82±4.00c 52.00±0.69b 38.80±2.36d 1.54±0.05c T2 73.08±6.01a 400.80±52.61a 77.58±14.34b 5.19±0.28a T3 62.59±7.91b 349.20±55.11a 102.16±8.78a 3.41±0.30b T4 30.48±2.30cd 86.00±27.53b 68.28±3.55bc 1.25±0.33c T5 20.16±1.50e 35.60±1.83b 59.60±3.33c 0.60±0.02d 注:同列不同字母表示显著性差异(P<0.05)。 2.3 扫描电镜观测
制作无麸质黏弹性面团的关键,是构建面团的功能性骨架,形成连贯结实的蛋白质网络[28]。在图2和图3中可观察到,T0和C0中的玉米醇溶蛋白均形成了连续的蛋白质相,但聚集严重,分布不均,主要以聚集团块的形式存在。但添加乳酸后,T和C面团中玉米醇溶蛋白均构建起网状结构,如图2、图3,红色箭头所标注的面团中玉米醇溶蛋白网络。可见乳酸能够减小面团中的玉米醇溶蛋白聚集程度,抑制玉米醇溶蛋白聚集成块,促进玉米醇溶蛋白的联结成网。同时,由于乳酸引入方式不同,随L/Z比增加,T和C面团中玉米醇溶蛋白网络的变化趋势存在差异。
乳酸能够调控T面团中玉米醇溶蛋白的网络状态,随L/Z比增加,玉米醇溶蛋白网络连贯均一性呈先提高后下降趋势,与拉伸性能的变化规律近似。由图2的T0到T5 SEM画面可知,玉米醇溶蛋白的聚集程度逐渐下降。是因为H+会抑制玉米醇溶蛋白的聚集[27],随面团中H+含量增加,蛋白质分子内/间排斥力增强,玉米醇溶蛋白组分整体变软,在揉混作用下易于在面团中分布均匀。T面团G′和G′′值随L/Z比增加而逐渐下降也可能与玉米醇溶蛋白组分变弱有关。对比发现,T0、T1中玉米醇溶蛋白发生明显聚集,呈团块状。T2中未观测到团块状的玉米醇溶蛋白,而是以连续且均一的蛋白质网络的形式存在。随L/Z比进一步增加,T3、T4、T5中玉米醇溶蛋白网络结构特征下降,逐渐变得稀薄。虽然从图2的T4、T5画面中可以辨析出玉米醇溶蛋白网络,但网状质量较差,对玉米淀粉的包裹程度明显下降。结合拉伸实验的结果,认为适量的乳酸可促使玉米醇溶蛋白在面团中构建起结实均一的网络,提高面团拉伸性,如T2中玉米醇溶蛋白网络状态最佳,拉伸性能突出,但随面团中L/Z比的继续增加,玉米醇溶蛋白网络被显著弱化,拉伸性也随之下降。
由图3中C1~C5的SEM画面可知,在引入乳酸后,面团中玉米醇溶蛋白以两种特征状态存在,一种是形成丝网状的蛋白质相,附着于玉米淀粉表面,另一种是聚集为蛋白质团块,未与体系中的玉米淀粉发生明显的物理结合。随L/Z比的增加,由玉米醇溶蛋白形成的丝网愈发松散、薄弱,面团中的玉米醇溶蛋白团块的个体粒径减小,C5中不再出现蛋白质团块。谷氨酰胺占玉米醇溶蛋白总氨基酸含量的20%以上[29]。有研究表明,有机酸会引发蛋白质的脱酰胺反应,将部分疏水性的谷氨酰胺,转为亲水性的谷氨酸[30],使玉米醇溶蛋白的疏水性下降,弱化了蛋白质分子间基于疏水相互作用的结合强度[29]。在小麦面筋蛋白与柠檬酸的脱酰胺反应研究中发现,处理过程中的柠檬酸水溶液浓度越高,蛋白质脱酰度越大[31]。同T面团一样,C面团中的玉米醇溶蛋白也可以通过分子间疏水相互作用彼此联结,但由于乳酸预处理过程中,玉米醇溶蛋白与乳酸的充分反应,且脱酰胺度会因乳酸浓度增加而提高,导致玉米醇溶蛋白间疏水作用力减弱,因而在面团揉混过程中,无法在机械作用下构建起连贯的蛋白质网络,仅能够形成松散的团块及薄弱的丝状网带。同时,脱酰胺反应还会造成蛋白质的肽键断裂[32-33],蛋白质的相对分子质量减小,同样不利于网络的构建。
对比图2、图3认为,两种乳酸引入的方式,使存在于T和C面团中的玉米醇溶蛋白形态差异明显。T面团中的玉米醇溶蛋白网络较为连贯,结构特征明显,与淀粉结合更为紧密。而C面团中,玉米醇溶蛋白网络质量较差,呈丝线状,部分以团块状聚集体形式存在,蛋白质分布不均,对淀粉的裹覆程度低,这可能是C面团拉伸性差,无法有效进行拉伸实验的重要原因。
2.4 红外显微成像分析
红外显微成像(FTIR-M)的检测结果是2D伪彩图,直观地反映了面团中蛋白质的分布情况[34]。有助于在SEM观测基础上,进一步分析面团中玉米醇溶蛋白的存在状态。结合软件提供的色度条辅助比较,伪彩图中各颜色所标注区域的蛋白质信号强度依次为白色>紫色>红色>黄色>绿色>蓝色,信号越强表示该区域内蛋白质的含量越高[13]。若红色区域在画面中分布广泛,且蓝色等暗色区域较少,认为面团中蛋白网络形成充分,分布均匀[15]。
在小麦面团的研究中认为,连贯的蛋白质网络结构可赋予面团良好的质构性能[35]。与小麦面团相似,较强的玉米醇溶蛋白网络结构能赋予面团良好的质构性能,网络的弱化则会造成面团质构性能的下降。通过探究乳酸引入方式,改变L/Z比,影响面团中玉米醇溶蛋白网络状态,进而实现对面团质构性能的调控。与图2的T面团SEM观测结果相应。在图4 T0的伪彩图中,表示玉米醇溶蛋白信号的亮色区域,高度集中,认为面团中的玉米醇溶蛋白聚集团块严重,未能很好地融入到体系中。随乳酸的添加,T1~T3伪彩图中高亮色区域的黄色、绿色面积增大,更为均一地分布于画面中,而代表蛋白质信号微弱的蓝色区域占比逐渐减少。随L/Z比继续提高,T4、T5伪彩图中,表示玉米醇溶蛋白红外信号较强的紫色、红色等高亮色区域占比减小;黄色、绿色区域内出现蓝色斑块;蓝色部分的占比逐渐增加。
分析认为,少量的乳酸,会促使玉米醇溶蛋白结构舒展,蛋白质彼此联接成网,有利于玉米醇溶蛋白以网络形态,均匀地分布于面团中。结合拉伸实验结果,推测正是这种结实而连贯的玉米醇溶蛋白网络结构,使T2具备更大的拉伸能量和拉伸阻力。如果乳酸比例太高,在促使玉米醇溶蛋白自身结构舒展的同时,也抑制了蛋白质的相互联接,蛋白质间相互作用减弱,玉米醇溶蛋白网络变得稀薄,强度下降。
结合图3观测结果,C0的伪彩图(图5)进一步证明,在不含乳酸的C面团中玉米醇溶蛋白聚集为块。在C1、C2、C3伪彩图中,存在一定的高亮色区域,但相比T1~T3面团,范围较小,趋于离散,蓝色区域面积较大。说明面团中的玉米醇溶蛋白,随乳酸增加,聚集程度降低,但未形成结实的网络。随着L/Z比增加,C4、C5中的高亮色区域面积逐渐减小,变为小斑块;蓝色部分占比较大。结合SEM观测结果,认为此时玉米醇溶蛋白,发生严重水解,使红外信号减弱。C面团的乳酸引入方式,使玉米醇溶蛋白疏水相互作用较弱,难以形成网络,趋于分散。面团表现出较小的黏性,玉米醇溶蛋白网络呈丝线状,且无法进行有效拉伸。
3. 结论
乳酸可通过调节玉米醇溶蛋白网络状态,影响玉米醇溶蛋白基无麸质面团质构特性。乳酸和玉米醇溶蛋白比例(L/Z)增加,导致乳酸添加组和乳酸预处理玉米醇溶蛋白组面团黏度提高,流体特征增强。但在L/Z比一定时,两种面团流变性差异显著(P<0.05),添加组面团更具黏性,G′、G′′小于预处理组面团,tanδ大于预处理组面团。改变L/Z比可以调控添加组面团的拉伸性能与玉米醇溶蛋白网络状态。随L/Z比增加,添加组面团的拉伸性能呈先上升后下降趋势,与玉米醇溶蛋白网络结构特性变化规律一致。L/Z比为2:10的添加组面团中,玉米醇溶蛋白网络结构连贯,分布广泛,对淀粉颗粒裹覆充分,面团拉伸性能良好。预处理组面团的乳酸引入方式,不利于玉米醇溶蛋白网络的构建,蛋白质趋于离散,玉米醇溶蛋白网络结构特征随L/Z比增加而降低,面团无法进行有效拉伸,而添加组面团具备实际应用潜力,有待进一步优化。
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表 1 T0~T5的拉伸性
Table 1 Stretchability of T0~T5
样品编号 拉伸能量(cm2) 拉伸阻力(BU) 拉伸距离(mm) 拉伸比值(B·mm−1) T0 24.96±2.61de 51.20±2.49b 31.72±1.39d 1.52±0.01c T1 37.82±4.00c 52.00±0.69b 38.80±2.36d 1.54±0.05c T2 73.08±6.01a 400.80±52.61a 77.58±14.34b 5.19±0.28a T3 62.59±7.91b 349.20±55.11a 102.16±8.78a 3.41±0.30b T4 30.48±2.30cd 86.00±27.53b 68.28±3.55bc 1.25±0.33c T5 20.16±1.50e 35.60±1.83b 59.60±3.33c 0.60±0.02d 注:同列不同字母表示显著性差异(P<0.05)。 -
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