Isolation, Identification and Biological Characteristics of Endophytic Fungi from Wild Boletus
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摘要: 采用组织分离法从黄皮疣柄牛肝菌、小美牛肝菌、双色牛肝菌的子实体中，分离纯化获得4株内生真菌，经菌落、菌丝、孢子形态学观察及rDNA ITS分子生物学鉴定，结果显示：菌株LCTG-12为盖姆斯木霉(Trichoderma gamsii)、LCCK-6为克鲁伊假丝酵母(Candida kruisii)、BSHC-18为黄瘤孢菌(Hypomyces chrysospermus)、BBFO-10为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysprum)。对4株内生真菌生物学特性进行研究，其中盖姆斯木霉菌丝生长速度较快，在CPDA培养基上，25 ℃培养5 d菌丝长满平板；液态培养时，该菌株在25 ℃、摇床转速160 r/min、pH5.5、8 d，可获得菌丝干基生物量4.13 g/L。平板对峙实验结果：盖姆斯木霉LCTG-12对黄瘤孢菌BSHC-18和尖孢镰刀菌BBFO-10菌丝生长均有拮抗作用，并且，黄瘤孢菌BSHC-18和尖孢镰刀菌BBFO-10两者之间也具有拮抗作用，表明牛肝菌内生真菌中盖姆斯木霉对腐败菌具有拮抗作用，可为生物防腐提供优良的菌株。Abstract: Four strains of endophytic fungi were isolated and purified from wild bodies of Leccinum crocipodium, Boletus speciosus, and Boletus bicolor by tissue separation method. Microscopic observation of its colonies, hyphae, and conidia morphology, and molecular biological identification of rDNA ITS sequence results showed that: Strain LCTG-12 was Trichoderma gamsii, LCCK-6 was Candida kruisii, BSHC-18 was Hypomyces chrysospermus, BBFO-10 was Fusarium oxysprum. The biological characteristics of four endophytic fungi studied, among them, the mycelium of Trichoderma gamsii growed faster, cultured on CPDA medium at 25 ℃ for 5 days, mycelium could cover the entire medium. In liquid culture, the strain could obtain 4.13 g/L of dry biomass of mycelium at 25 °C, shaker speed 160 r/min, pH5.5, and 8 days. The results of the flat panel stand-off experiment: LCTG-12 Trichoderma gamsii had an antagonistic effect on the growth of BSHC-18 Hypomyces chrysospermus and BBFO-10 Fusarium oxysprum, at the same time, BSHC-18 Hypomyces chrysospermus and BBFO-10 Fusarium oxysporum had an antagonistic effect. Therefore, the endophytic fungi Trichoderma gamsii of boletus had an antagonistic effect on spoilage fungi and may be an excellent strain for biological control.
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Keywords:
- wild boletus /
- tissue separation /
- endophytic fungi /
- ITS molecular identification
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内生真菌（Endophytic fungi）定殖于健康的生物组织内部[1]，是构成菌物生态系统的天然组分，目前，具有抑菌、抗癌等活性的大量次级代谢产物从内生真菌中分离出来[2-5]，且研究表明，在内生真菌与宿主保持着互惠共生关系的长久进化过程中，其具有与宿主相同或相近的代谢途径，从而产生与宿主相同或相近的次级代谢产物[6]，故内生真菌可成为潜在的替代药源，也将成为开发生物活性物质的资源宝库[7]，并且内生真菌之间通过相互作用共同促进宿主的生长发育，也可与大型真菌的协同作用促进宿主产生更多的代谢产物。
牛肝菌（Boletaceae）是真菌界（Fungi），担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricates）的大型真菌[8]，我国已知牛肝菌科有28属，397种及变种[9]，主要产地在云南。其子实体含有大量人体必需氨基酸、矿物质、以及多种生物活性成分[10-11]，具有降血脂、抗氧化、护肝、抗肿瘤、降血糖、清热解烦等功能[12-16]。牛肝菌是一个复杂的生命体，其整个生命周期都伴随着内生真菌，据报道，大部分牛肝菌是优良的外生菌根真菌，其生长对寄主要求严格，绝大多数种类仍不能通过人工栽培形成子实体[17-18]。目前，对于牛肝菌的研究主要集中在化学成分、生物活性等方面[19-20]，而对于牛肝菌内生真菌的报道较少。丁小维等[21]采用组织分离法从牛肝菌子实体中分离出2株内生真菌，通过ITS分子鉴定分别为毛霉属（Mucor sp.）和黄瘤孢菌（Hypomyces chrysospermus），2株内生真菌的发酵液均对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌表现出了较强的抑菌活性。岳万松等[22]采用组织分离法从4种牛肝菌子实体中分离出5株内生真菌，经ITS分子鉴定分别为毛栓菌（Trametes hitsuta）、假丝酵母属（Candida sp.）、被孢霉属（Mortierella sp.）、散囊菌属（Eurotium sp.）、金色毛壳菌（Chaetomium aureum），经过rDNA ITS二级结构辅助分析后，得出牛肝菌内生真菌具有多样性特征的结论。
在野生牛肝菌子实体获得母种菌丝的分离过程中，明确与其内生真菌的关系，是获得原种、栽培种的基础，也是获得新的真菌资源途径之一，故探究野生牛肝菌内生真菌的生长规律及内生真菌之间的拮抗关系，可为深入研究野生牛肝菌与内生真菌之间的关系进行初步探究。组织分离法是分离内生真菌的重要方法之一，本研究通过组织分离法从3种新鲜野生牛肝菌中分离获得4株内生真菌，结合菌株的形态特征和rDNA ITS序列分析，对菌株进行鉴定，构建出系统发育树，并对几种内生真菌生物学特性进行研究，可为牛肝菌生长过程及采摘后的生物防腐提供优良的生防菌株，同时为开发新资源化合物提供菌种资源[23-25]，对牛肝菌的开发利用及人工栽培等具有重要意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
鲜野生牛肝菌子实体：黄皮疣柄牛肝菌（Leccinum crocipodium（Letellier）watl.）、小美牛肝菌（Boletus speciosus Frost）、双色牛肝菌（Boletus bicolor Peck
） 分别采摘于云南省楚雄彝族自治区禄丰县和南华县，无菌袋、冰袋封装，空运24 h内分离；GK2043（胶回收试剂盒）、GK1071（DNA提取试剂盒）、引物ITS1和ITS4 上海捷瑞生物工程有限公司合成；固体培养基CPDA：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB1 1 mg，蛋白胨0.5 g，琼脂20 g，水1 L，pH自然（液态培养基去掉琼脂）；固体培养基Pachlewski：葡萄糖20 g，酒石酸铵0.5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，VB1 0.1 mg，琼脂20 g，1 mL/L微量元素混合液（H3BO3 8.45 mg，MnSO4 5 mg，FeSO4 6 mg，CuSO4 0.625 mg，ZnCl2 2.77 mg，（NH4）2MoO4 0.27 mg），去离子水1 L、固体培养基MMN：NaCl 0.025 g，葡萄糖10 g，KH2PO4 0.5 g，麦芽浸粉3.0 g，VB1 0.1 mg，CaCl2 0.05 g，（NH4）2HPO4 0.25 g，琼脂20 g，FeCl3 0.012 g，MgSO4·7H2O 0.15 g；75%乙醇 实验室自制； JY300C电泳仪、JY02G凝胶成像系统 北京君意电泳设备有限公司；Beckman-JT-25R高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；ABI3730测序仪 北京东迅天地医疗仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 野生牛肝菌内生真菌分离与纯化
将新鲜野生牛肝菌子实体用自来水冲洗数次，去除表面杂质，无菌水冲洗4遍，75%乙醇漂洗2 min，再用无菌水冲洗5次，无菌纱布擦干子实体表面。采用组织分离法进行以下操作，用无菌解剖刀将牛肝菌子实体纵切开后，将内部的组织切割成0.5 cm2左右的小块，接种于CPDA培养基中，25 ℃恒温避光培养5 d。待小块组织周围有内生真菌菌丝长出后，挑取少许菌丝，采用点植法纯化培养，转接4次。共获得23株纯菌株，并移接至斜面试管4 ℃保存。
1.2.2 野生牛肝菌内生真菌形态学鉴定
将23株真菌分别点植固体平板培养，挑选出形态、颜色有明显差异的菌落4株，分别接种到CPDA固体平板上，25 ℃避光培养5 d，观察菌落形态，显微镜观察菌丝及分生孢子颜色、形态，以十字交叉法记录菌落直径，且移接至斜面试管，待培养长出菌丝体后，4 ℃保存。
1.2.3 基于rDNA ITS序列分析的内生真菌分子鉴定
采用GK1071提取试剂盒，对4株纯化菌株进行DNA提取。使用真菌ITS鉴定通用引物：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对DNA的ITS片段进行PCR扩增。扩增体系为30 µL反应体系，包括：10×Taq Buffer 3 µL，dNTP 1 µL，Taq酶1 µL，上游引物（10 µmol/L）和下游引物（10 µmol/L）各1 µL，DNA模板2 µL，ddH2O补足至30 µL。反应条件：预变性95 ℃，5 min，95 ℃，15 s，95 ℃，15 s，95 ℃，45 s，35个循环，72 ℃，5 min保存。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳体系检测，采用凝胶成像系统观察结果。
PCR扩增产物用胶回收试剂盒GK2043回收，送到上海捷瑞生物工程有限公司进行测序。将4株内生真菌所测序列在GenBank中进行BLAST对比，选择同源性高于95%的序列，运用MEGA-X软件进行多重比较，通过NJ法构建系统发育树，并以bootstrap对发育树进行自举法检验1000次，从而确定菌株的亲缘关系及分类地位。
1.2.4 液态发酵及干基生物量的测定
接种1 cm2菌丝块于装液量为80 mL的250 mL三角瓶中，在25 ℃，摇床转速160 r/min培养，分别称量2、4、6、8、10 d的生物量干重，每组设置3个重复，将发酵液在5000 r/min离心10 min，收集菌丝体移至干燥皿中，置于70 ℃烘箱中，每隔1 h取出称量，直到重量不再改变，即为生物量干重。
1.2.5 野生牛肝菌内生真菌的拮抗实验
为探究牛肝菌自身内生真菌之间的拮抗作用，参照刘青等[26]方法利用平板对峙法进行拮抗实验，将纯种菌种接种到新的CPDA培养基上，接种后的平板置于25 ℃条件下避光培养，培养至5 d，期间观察菌落形态，十字交叉法测量菌落生长直径，以第5 d时菌落直径计算抑菌率。对照组设置为单独接种腐败菌（BBFO-10尖孢镰刀菌为腐败菌），每组对峙设置3组重复，抑菌率（%）=（对照组病原菌的菌落直径-对峙组病原菌的菌落直径）/对照组病原菌的菌落直径×100。
1.3 数据处理
实验中所有数据均进行3次平行实验，数据以平均值±标准表示。利用Excel 2007和 Origin 2018对生物学特性实验进行数据处理，差异显著水平为P<0.05。
2. 结果与分析
2.1 菌株的形态特征
从云南省2个地区采摘的3个种的野生牛肝菌子实体，共分离出可培养的内生真菌23株，通过菌落形态初步判断多数为木霉属，从中筛选出具有菌落形态、颜色、气味等差异大的4株菌种，接种于CPDA培养基上，在25 ℃下培养5 d，平板生长的菌落形态、光学显微镜观察的菌丝、孢子形态，利用Motic Images Plus 2.0软件进行显微形态（10×100）拍摄，如图1所示，特征描述见表1。
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图 1 4种主要内生真菌的菌落、菌丝、孢子形态结果注：图a、b、c、d分别为LCTG-12、LCCK-6、BSHC-18、BBFO-10内生真菌，-1为菌落形态；-2为菌丝形态；-3为厚垣孢子或孢子形态。Figure 1. Morphological diagram of colony, hyphae and spores of wild bolete endophytic fungi表 1 野生牛肝菌4种内生真菌形态观察结果的描述Table 1. Description of morphological observation results of 4 species of endophytic fungi in wild boletus牛肝菌种类 采摘地点 内生真菌菌落形态 内生真菌菌体形态 内生真菌编号 黄皮疣柄牛肝菌（Leccinum crocipodium） 云南省楚雄彝族自治区禄丰县 菌落生长较快，呈放射同心螺纹状，培养基背面为淡黄色，有较明显的椰子芳香味 菌丝无色有隔，有侧生分支；分生孢子呈椭圆形，2~3.2 μm LCTG-12 菌落浅棕色，呈絮状扭结，菌丝为较短毡状，后期产浅棕色浸出物，菌落反面呈棕色 有大量菌丝，壁厚；椭圆形透明孢子附着于菌丝壁外，厚垣孢子直径8~12 μm LCCK-6 双色牛肝菌（Boletus bicolor） 菌丝呈凸起生长，为白色，蓬松，边缘较为整齐圆滑，底部培养基为紫色，有色素 菌丝透明、有隔，有侧生分支；分生孢子主要是小型分生孢子，无色透明，呈椭圆形，为单细胞，大型分生孢子为纺锤形，顶端微弯曲，7~10 μm BBFO-10 小美牛肝菌（Boletus speciosus） 云南省楚雄彝族自治区南华县 初期为白色菌丝，菌丝有分支，菌落边缘整齐，4~5 d后产生金黄色孢子，后期变为铁锈色粉末状孢子，覆盖于培养基表面 3 d时观察可见大量菌丝及少量无色孢子；5 d时未见菌丝，均为金黄色孢子，孢子表面疣状突起不明显 BSHC-18 2.2 4种内生真菌菌株ITS序列PCR扩增结果
进一步进行分子生物学鉴定，以引物ITS1和ITS4对内生真菌的DNA模板进行PCR扩增，获得4条长度均在410~610 bp之间的特异性片段，4株内生真菌的ITS扩增产物电泳结果，如图2所示。
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图 2 4株野生牛肝菌内生真菌的ITS-PCR扩增电泳图Figure 2. Electrophoresis pattern of ITS-PCR amplification of 4 strains of endophytic fungi of wild bolete2.3 4种内生真菌菌株的系统发育树构建及分析
利用ITS通用引物（ITS1、ITS4）对4株内生真菌进行序列扩增得到4条基因序列，序列长度分别是LCTG-12为580 bp；LCCK-6为410 bp；BSHC-18为610 bp；BBFO-10为600 bp。将以上4条序列分别在NCBI库中进行在线BLAST比对，每种菌下载4~5条同源性高于95%的序列，以测序得到的基因序列为基础，同公共数据库下载的相似序列合并，采用MEGA-X软件，按照neighbor-joining method（N-J法），经过自举法1000次进行检验构建系统发育树，以此对菌株进行种水平的分类鉴别。4株菌在NCBI中BLAST比对结果显示：在100条序列比对结果中，LCTG-12与76株木霉属序列（Trichoderma sp.）的序列同源性为99%以上，说明该菌为木霉属；LCCK-6与55株念珠菌属（Candida）的序列同源性为90%以上说明该菌为念珠菌属；BSHC-18与50株菌寄生属（Hypomyces sp.）的序列同源性为90%以上说明该菌为菌寄生属；BBFO-10与94株（Fusarium oxysprum）的序列同源性为99%以上。
系统发育树树枝的长短表示各菌株之间的遗传距离，同一支说明亲缘关系很近，以系统发育方法可以对关系较为密切的菌株序列进行较好的判别。结合形态学鉴定及BLAST对比及系统发育树结果：LCTG-12与NCBI数据库中的Trichoderma gamsii聚类在同一支上，自检支持率100%，鉴定该菌为盖姆斯木霉；LCCK-6与Candida kruisii聚类在同一支上，自检支持率为100%，鉴定该菌为克鲁伊假丝酵母；BSHC-18与Hypomyces chrysospermus聚类在同一支上，自检支持率为100%，鉴定该菌为黄瘤孢菌；BBFO-10与Fusarium oxysprum聚类于同一株上，自检支持率达100%，鉴定该菌为尖孢镰刀菌（图3）。
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图 3 NJ法构建4株内生真菌的ITS序列系统发育树图（Bookstrap≥50%）Figure 3. Construction of ITS sequence phylogenetic tree diagrams of 4 endophytic fungi by NJ method（Bookstrap≥50%）2.4 野生牛肝菌内生真菌的生物学特性
2.4.1 3种培养基对内生真菌生长速度的影响
为掌握4株内生真菌（LCTG-12、LCCK-6、BSHC-18、BBFO-10）的生物学特性，选择CPDA、Pachlewski、MMN为供试培养基，研究3种培养基对菌丝生长速度的影响，25 ℃培养，在9 cm的平板上采用十字交叉法测量菌落直径，结果如图4所示。由图4可知，在培养第4 d时进行菌落直径测量，CPDA上的生长速度明显优于其他2种培养基，内生真菌LCTG-12培养5 d，LCCK-6培养6 d，BSHC-18培养7 d，BBFO-10培养8 d可长满平板，故选择CPDA培养基为4种内生真菌的最适培养基。
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图 4 培养基对内生真菌生长的影响Figure 4. The influence of culture medium on the growth of endophytic fungi2.4.2 液态发酵对内生真菌生物量的影响
在上述实验的基础上，选择CPDA培养基进行4种内生真菌的液态摇瓶实验，在25 ℃，160 r/min条件下培养0~10 d，收集0、2、4、6、8、10 d的菌丝，3次平行实验统计结果如图5所示。由图5可知，0~8 d LCTG-12、LCCK-6、BBFO-10生物量均呈增长趋势，第8 d时LCTG-12的生物量为4.13 g/L，LCCK-6为1.65 g/L，BBFO-10为3.44 g/L，此时生物量最大，之后不再增长，这可能与培养基中营养物质消耗殆尽有关。但是BSHC-18的液态发酵菌丝量增长缓慢，最高为1.14 g/L，这与黄瘤孢菌（BSHC-18）的孢子繁殖的生物学特性有关，可见它不适于液态发酵生长菌丝。
2.4.3 野生牛肝菌内生真菌的拮抗性
为探究牛肝菌内生真菌之间是否存在拮抗关系，本实验设计从牛肝菌中分出的3株内生真菌，进行对峙实验，在25 ℃条件下培养5 d，盖姆斯木霉LCTG-12、黄瘤孢菌BSHC-18和尖孢镰刀菌BBFO-10的对照组菌落形态如图1-a-1、1-c-1和1-d-1所示，拮抗对峙图如图6所示。
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图 6 牛肝菌内生真菌之间的拮抗对峙图注：a为盖姆斯木霉对峙尖孢镰刀菌；b为黄瘤孢菌对峙尖孢镰刀菌；c为盖姆斯木霉对峙黄瘤孢菌。Figure 6. Picture of antagonism between wild bolete endophytic fungi由图6a可知，盖姆斯木霉对尖孢镰刀菌的生长具有拮抗作用，其菌落与镰刀菌接触的边界处，镰刀菌有明显向外退缩生长，由于每组对峙设置3组重复，故其对尖孢镰刀菌的平均抑制率为53.7%；由图6b可知，黄瘤孢菌与尖孢镰刀菌之间可互相抑制生长，且黄瘤孢菌产黄色孢子的时间明显延后，彼此的平均抑制率分别为：41.8%、33.6%；由图6c可知，盖姆斯木霉对黄瘤孢菌的生长有明显的抑制作用，黄瘤孢菌未有产孢现象，其对黄瘤孢菌的平均抑制率为74.7%。
3. 结论
食药用菌内生真菌是一类尚未充分开发与利用，并且应用前景广泛的微生物，为探究野生牛肝菌中内生真菌资源，及分析其内生真菌间是否存在拮抗关系，本文从3种新鲜野生牛肝菌子实体中分离纯化共得到23株纯菌，筛选出4株具有典型特征的纯菌进行形态观察和ITS rDNA现代分子生物学鉴定，鉴定出4株内生真菌分别为盖姆斯木霉（Trichoderma gamsii）、克鲁伊假丝酵母（Candida kruisii）、黄瘤孢菌（Hypomyces chrysospermus）及尖孢镰刀菌（Fusarium oxysprum），并对几株内生真菌生物学特性进行研究，得出结论：CPDA培养基较适合这4株菌的生长，其中盖姆斯木霉的生长速度较快，5 d即可长满9 cm的平板，其余3种菌株长满板的时间分别为6、7、8 d，并且盖姆斯木霉对黄瘤孢菌和尖孢镰刀菌菌丝生长均有拮抗作用，黄瘤孢菌和尖孢镰刀菌两者之间也具有拮抗作用。由于实验采用人工合成培养基的局限性，故本研究所分离的菌株不能完全诠释野生牛肝菌内生真菌的群系，其中盖姆斯木霉菌株表现出的拮抗作用，表明其具有一定的生防应用潜力，可为牛肝菌等大型真菌生长过程中会出现的菇体腐烂和根腐病[27-29]，提供一定的生防利用价值。内生真菌的次级代谢产物丰富[30-31]，进一步研究其内生真菌能够产生结构新颖、活性广泛的次级代谢产物，对新型药用资源开发具有重要的意义，而牛肝菌内生真菌代谢产物与其是否相同或相近还有待研究。本文也为之后野生牛肝菌人工驯化过程中，研究其内部环境与内生真菌的关系提供参考。
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图 1 4种主要内生真菌的菌落、菌丝、孢子形态结果
注：图a、b、c、d分别为LCTG-12、LCCK-6、BSHC-18、BBFO-10内生真菌，-1为菌落形态；-2为菌丝形态；-3为厚垣孢子或孢子形态。
Figure 1. Morphological diagram of colony, hyphae and spores of wild bolete endophytic fungi
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图 2 4株野生牛肝菌内生真菌的ITS-PCR扩增电泳图
Figure 2. Electrophoresis pattern of ITS-PCR amplification of 4 strains of endophytic fungi of wild bolete
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图 3 NJ法构建4株内生真菌的ITS序列系统发育树图（Bookstrap≥50%）
Figure 3. Construction of ITS sequence phylogenetic tree diagrams of 4 endophytic fungi by NJ method（Bookstrap≥50%）
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图 4 培养基对内生真菌生长的影响
Figure 4. The influence of culture medium on the growth of endophytic fungi
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图 6 牛肝菌内生真菌之间的拮抗对峙图
注：a为盖姆斯木霉对峙尖孢镰刀菌；b为黄瘤孢菌对峙尖孢镰刀菌；c为盖姆斯木霉对峙黄瘤孢菌。
Figure 6. Picture of antagonism between wild bolete endophytic fungi
表 1 野生牛肝菌4种内生真菌形态观察结果的描述
Table 1 Description of morphological observation results of 4 species of endophytic fungi in wild boletus
牛肝菌种类 采摘地点 内生真菌菌落形态 内生真菌菌体形态 内生真菌编号 黄皮疣柄牛肝菌（Leccinum crocipodium） 云南省楚雄彝族自治区禄丰县 菌落生长较快，呈放射同心螺纹状，培养基背面为淡黄色，有较明显的椰子芳香味 菌丝无色有隔，有侧生分支；分生孢子呈椭圆形，2~3.2 μm LCTG-12 菌落浅棕色，呈絮状扭结，菌丝为较短毡状，后期产浅棕色浸出物，菌落反面呈棕色 有大量菌丝，壁厚；椭圆形透明孢子附着于菌丝壁外，厚垣孢子直径8~12 μm LCCK-6 双色牛肝菌（Boletus bicolor） 菌丝呈凸起生长，为白色，蓬松，边缘较为整齐圆滑，底部培养基为紫色，有色素 菌丝透明、有隔，有侧生分支；分生孢子主要是小型分生孢子，无色透明，呈椭圆形，为单细胞，大型分生孢子为纺锤形，顶端微弯曲，7~10 μm BBFO-10 小美牛肝菌（Boletus speciosus） 云南省楚雄彝族自治区南华县 初期为白色菌丝，菌丝有分支，菌落边缘整齐，4~5 d后产生金黄色孢子，后期变为铁锈色粉末状孢子，覆盖于培养基表面 3 d时观察可见大量菌丝及少量无色孢子；5 d时未见菌丝，均为金黄色孢子，孢子表面疣状突起不明显 BSHC-18 
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1. 陈士国，张唯希，朱凯，侯志强，叶兴乾. 食源性碳水化合物结构解析新技术前沿与展望. 中国食品学报. 2024(09): 1-17 . 
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