Preparation and Antibacterial Properties of Peanut Protein Isolate-Polylactic Acid Nanofiber Membrane Loaded with Tea Polyphenols
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摘要: 利用静电纺丝技术制备负载茶多酚（TP）的花生分离蛋白（PPI）-聚乳酸（PLLA）复合纳米纤维薄膜，并研究其微观形貌、红外光谱结构、热稳定性、疏水性、晶体结构和抑菌性能等。傅里叶红外光谱和 X 射线衍射结果显示，复合纳米纤维成功包埋了TP，实验添加的TP对PPI/PLLA纳米纤维形态分布影响不大，其平均直径从（185±57）nm增加到（222±72）nm，而疏水性和热稳定性有所降低，但TP/PPI/PLLA复合纳米纤维膜提高了TP的热稳定性。抑菌结果表明：TP/PPI/PLLA三元复合纳米纤维膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈宽度分别从（0.75±0.03）cm和（1.49±0.08）cm增加到（1.10±0.02）cm和（1.82±0.10）cm，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果大于大肠杆菌的抑菌效果。由此研究表明，TP/PPI/PLLA三元复合纳米纤维膜具有良好的潜在应用价值。Abstract: Electrospinning technology was used to prepare peanut protein isolate (PPI)-polylactic acid (PLLA) composite nanofiber film loaded with tea polyphenols (TP), and to study its microscopic morphology, infrared spectrum structure, thermal stability, hydrophobicity, and crystals structure and antibacterial properties, etc. Fourier infrared spectroscopy and X-ray diffraction results showed that the composite nanofibers had successfully embedded TP. The experimentally added TP had little effect on the morphological distribution of PPI/PLLA nanofibers. The average diameter increased from (185±57) nm to (222±72) nm. The hydrophobicity and thermal stability were reduced, but the TP/PPI/PLLA composite nanofiber membrane improved the thermal stability of TP. The antibacterial results showed that the width of the inhibition zone of TP/PPI/PLLA ternary composite nanofiber membrane against Escherichia coli and Staphylococcus aureus increased from (0.75±0.03) and (1.49±0.08) cm to (1.10±0.02) and (1.82±0.10) cm, respectively. And the antibacterial effect of Staphylococcus aureus was greater than that of Escherichia coli. This study shows that the TP/PPI/PLLA ternary composite nanofiber membrane has good potential application value.
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Keywords:
- electrospinning /
- peanut protein isolate /
- tea polyphenol /
- nanofiber /
- antibacterial
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近些年来，随着纳米材料在生活中的广泛应用，学者们对纳米纤维的研究也日益增多。静电纺丝技术已经逐渐成为一种简单、高效和连续制备纳米纤维的技术。与传统的纺丝工艺有所不同，静电纺丝技术在静电纺丝的过程中，聚合物溶液或熔融体在高压静电场中通过静电相互作用克服表面张力，产生带电射流，进一步拉伸、劈裂、固化或溶剂挥发，最终形成纤维[1-2]。该过程操作简便且成本低廉，制备的纳米纤维具有高孔隙率、比表面积大、均一性高以及纤维孔径之间连通性好等诸多优点[3-4]，还可以将多种生物活性物质加入到纺丝液中，使得纳米纤维具有多功能性[5-6]。静电纺丝纳米纤维已经被应用于诸多领域，例如空气过滤、组织工程支架、化妆品行业、医药领域中的药物缓释及食品工业[7]等。
之前的研究通常利用合成聚合物进行纺丝，随着环境与资源的压力日益严峻，越来越多的研究集中于对天然聚合物的纺丝。由于天然聚合物具有可再生和可持续的特性，从这些来源获得的纤维同时具有生物相容性和生物降解性，这使得诸如多糖和蛋白质之类的天然聚合物成为静电纺丝的理想候选材料[8]。以蛋白质[9]和多糖[10]等天然聚合物作为原料，通过电纺制备的纳米纤维不仅具有纳米纤维的各种性能优势，还有良好的安全性和降解性。花生分离蛋白是重要的天然蛋白，来源十分丰富，具有良好的吸水性、吸油性、乳化性、泡沫性和流变性等功能特点，且其可加工性、生物降解性以及生物相容性等性能都非常好[11]。PPI是一种球状蛋白质，蛋白分子之间的交联度小，使得单独 PPI 溶液由于黏度过低而无法进行电纺，加入高分子聚合物以增加分子间的交联度，提高溶液黏度，从而得到电纺纤维。聚乳酸（PLLA）已被证实是一种安全、可降解，同时具有良好的可防性与生物相容性的高分子聚合材料。茶多酚（TP）是茶叶中主要生理活性成分，占茶叶干重的20%~30%，包括花色苷类和黄酮类以及黄烷醇类等多种天然物质。相关研究表明，茶多酚具有良好的抗氧化和抗衰老、防辐射的作用，还能够有效的降低血脂和血糖、抑菌抑酶[12-13]，近年来到受到人们的广泛关注。
前期已有相关学者报道了电纺花生分离蛋白—聚乳酸制备纳米纤维并优化制备工艺条件的研究。然而关于用花生分离蛋白—聚乳酸作为生物活性物质载体或者抗菌膜材料方面的研究，鲜有报道。在本试验中，将茶多酚与花生分离蛋白、聚乳酸进行混合，采用静电纺丝研制具有抗菌效果的三元复合纳米纤维膜，不仅可以丰富花生分离蛋白—聚乳酸纳米纤维膜的功能，也可扩宽花生分离蛋白、茶多酚的应用领域，为负载生物活性物质及纳米抗菌膜材料的应用开辟新途径。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
花生 正阳县三农种业有限公司；聚乳酸（医疗级，Mw=100000） 济南岱罡生物科技有限公司；茶多酚 上海源叶生物科技有限公司；石油醚（AR） 天津市科密欧化学试剂有限公司；氯化钠（NaCl） 天津市天力化学试剂有限公司；六氟异丙醇（HFIP） 上海麦克林生化科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉 天津市科密欧化学试剂有限公司。
6YZ-180全自动液压榨油机 巩义市天元机械有限公司；FJS-6恒温数显磁力搅拌水浴锅 常州市顶新实验仪器公司；LGJ-25C冷冻干燥机 四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司；Quanta FEG 250扫描电子显微镜 美国 FEI 公司；Nicolet 6700红外光谱仪 美国Thermo Nicolet公司；Q50热重分析仪 美国TA公司；Rigaku MininFlex 600 X-射线衍射仪 日本岛津公司；DF02静电纺丝机 佛山轻子精密测控技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 花生分离蛋白提取
冷榨花生饼（DPF，蛋白质含量为50.12%, 蛋白质含量测定参照GB/T 5009.5-2010，转换系数为5.46）：利用液压榨油机将花生在室温、55 MPa的压力下压榨65 min，获得冷榨花生饼；花生饼粉碎后经石油醚脱除残余油脂，过80目筛得DPF。参考矫丽媛等[14]的方法并稍作调整。将DPF与蒸馏水以1:10的料液比均匀混合，再用1 mol/L的NaOH溶液将pH调节至9.0，在50 °C下搅拌100 min后，于4000×g转速下离心20 min，取上清液，再利用1 mol/L的HCl溶液调节上清液pH至花生蛋白等电点，搅拌30 min，于4000×g转速下离心20 min，下层沉淀水洗至中性，冷冻干燥后得PPI。
1.2.2 纺丝共混溶液的制备
用天平称取适量的花生分离蛋白（PPI）和聚乳酸（PLLA），按照其两者质量比1:1的比例，以六氟异丙醇（HFIP）为溶剂，配制浓度（w/v）为10%的纺丝溶液，将质量分数为 6%、8%、10% （相比于花生分离蛋白粉末和聚乳酸总质量）的茶多酚（TP）加入溶液中，水浴40 ℃下磁力搅拌12 h，得到共混溶液。
1.2.3 静电纺丝
将上述配制好的溶液倒入10 mL注射器中，之后在注射泵上安装好注射器，进行高压电源和针头的连接，调整接收滚筒与针头间距。相关的测试参数包括: 0.6 mL/h纺丝速度，电压16 kV，针尖-接收滚筒间距为12 cm，环境的湿度为45%~50%，纺丝温度为25 °C。最后将收集到的纤维膜至于常温干燥箱中干燥备用。
1.2.4 纳米纤维膜的形貌表征
将纳米纤维样品置于导电硅胶上，喷金后进行扫描，观察纳米纤维膜的表面结构形态。选用Image Plus Pro 6作为SEM图像的分析软件。
1.2.5 傅里叶红外光谱
将纳米纤维膜样品与KBr（质量比为1:100）混合并压入透明薄片中进行FTIR测试。设置光谱分辨率为4 cm−1，扫描32次获取样品在400~4000 cm−1范围内的傅里叶红外光谱。
1.2.6 TGA分析
称取10 mg样品，利用热重分析仪(TGA)测定TP和电纺纤维的热性能。测试参数：氮气流量为60 mL/min，测试温度范围为35~600 °C，升温速率为10 °C/min。
1.2.7 接触角测定
用接触角测试仪测定不同含量的TP/PPI/PLLA复合纳米纤维膜，将测试样品裁剪为（2 cm×5 cm）于试样夹持器上，调节合适的对比度和亮度，在标准环境条件下进行测试。
1.2.8 X衍射分析
通过X-射线衍射图谱研究TP粉末、静电纺PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA复合纳米纤维的结构。测试条件：Cu-Kα射线（λ=1.54056 Å），管电流：15 mA，管电压：40 kV，扫描速度：10 °min−1，扫描角度(2θ)范围：为10~60 °。
1.2.9 抑菌性能测试
参考费燕娜等[13]方法并稍作调整进行抑菌实验。菌种活化：将1 g蛋白胨，0.3 g 牛肉浸膏，0.5 g NaCl 加入到100 mL 蒸馏水中，调节溶液的 pH 为7.2，高压蒸汽灭菌（121 ℃，120 min）。在无菌操作环境下将金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）分别移植到培养基中活化，37 ℃恒温恒湿箱中培养12 h备用。在无菌培养皿中分别加入（S.aureus）和（E.coli）菌悬液，然后倒入冷却至 40 ℃的营养琼脂培养基，立即旋转使其充分均匀分散，放置5 min待培养基凝结后，将直径8 mm的试样在紫外灯光照 20 min 杀菌后置于琼脂培养基的中央，并轻微按压，确保试样和培养基充分接触，放入37 ℃ 恒温培养箱中培养24 h后，观察试样周围的细菌生长情况，测量抑菌圈尺寸。根据抑菌圈宽度来判定抑菌效果的好坏。每个试样至少测量3处，取平均值。抑菌圈大小可按式（1）计算:
(1) 式中: H 为抑菌圈宽度，cm；D 为抑菌圈外径的平均值，cm；d为试样直径，cm。
1.3 数据处理
数据结果采用3次平行实验的平均值±标准差表示。使用SPSS 20数据处理软件进行统计分析，P≤0.05表示样品间存在差异性显著，分别使用Origin 8.5和Image Plus Pro 6进行作图分析和测量纤维的直径。
2. 结果与分析
2.1 不同质量分数的茶多酚对花生分离蛋白—聚乳酸纤维形貌和直径的影响
图1为添加不同含量茶多酚的花生分离蛋白-聚乳酸复合纳米纤维的SEM图和直径分布图。通过Image Plus Pro 6测量花生分离蛋白-聚乳酸复合纳米纤维膜纤维的平均直径为（181±62） nm(见图1（A）)。TP的加入对PPI/PLLA复合纳米纤维的形态并未产生明显的影响，但随着TP含量的增加，PPI/PLLA复合纳米纤维的平均直径稍有增加，分别为（185±57）nm、（199±63）nm和（222±72）nm (见图1B、C、D)，这可能是由于TP的加入增大了PPI/PLLA溶液的粘度。在电纺条件一定的情况下，纺丝溶液粘度的增加导致PPI/PLLA溶液的表面张力增加，进一步使得电场力克服溶液表面张力的难度增大，射流不能在电场中被充分拉伸，因此，PPI/PLLA复合纳米纤维的直径增加。此外，TP也可能在PPI/PLLA纳米纤维中发生团聚，使纳米纤维不能取向排列，从而使得纳米纤维直径变粗。
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图 1 不同含量茶多酚的花生分离蛋白—聚乳酸纳米纤维SEM图注：图A为未添加TP的复合纳米纤维，图B为添加6%TP的复合纳米纤维，图C为添加8%TP的复合纳米纤维，图D为添加10%TP的复合纳米纤维。Figure 1. SEM images of peanut protein isolate-polylactic acid nanofibers with different contents of tea polyphenols2.2 FTIR分析
傅里叶变换红外光谱测试技术是一种快速的检测技术，常被应用于对物质的化学结构和组成的分析，也是分析静电纺纤维组成和结构的常用的有效方法之一。图2为TP、PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA（TP含量为8%）纳米纤维复合膜的红外光谱图。从TP、PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA的红外光谱可以看出3000~3500 cm−1处的较宽的吸收峰归属于N-H和O-H基团的伸缩振动[15-16]。红外光谱图中位于2924 cm−1和2875 cm−1处的吸收峰分别归属于对称和不对称的-CH2[17]。这可能是PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA纳米纤维膜中存在PPI。相关文献报道[18]，在TP/PPI/PLLA红外光谱1522~1446 cm−1范围内出现苯环上的骨架（C-C）振动吸收峰，此外，在红外光谱图中的809 cm−1位置处出现了苯环上C-H 弯曲振动吸收峰，这说明了TP成功的负载到PPI/PLLA纳米纤维膜中，且TP与PPI、PLLA共混之后，PPI/PLLA纳米纤维膜的峰没有消失，峰强度增强。这可能是由于加入TP的含量过多导致其红外特征吸收峰的信号太高，或者可能由于TP的红外特征吸收峰与基体材料的红外特征吸收峰发生重叠。三种物质在红外光谱图中指纹区并未产生新的吸收峰这说明TP与基体材料的原料未发生化学反应，仅仅是物理性复合。
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图 2 TP粉末、静电纺PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA纳米纤维膜的FTIR图Figure 2. FTIR diagram of TP powder, electrospun PPI/PLLA and TP/PPI/PLLA nanofiber membranes2.3 热重分析
热重分析，是指在加热的过程中，通过对被测样品进行质量分析，可得到样品质量随温度变化的曲线，进而对被测样品发生变化（汽化、升华和分解等）时的温度和质量损失进行研究。图3为随着温度的升高TP粉末、PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA纳米纤维膜质量变化情况，从图中可知，在150 ℃之前造成的质量损失是由于水分蒸发引起。当温度升至150 ℃后，TP的质量开始明显下降。当温度升至200 ℃左右时，PPI/PLLA纳米纤维膜和TP/PPI/PLLA纳米纤维膜质量开始出现下降的趋势。此外，TP/PPI/PLLA纳米纤维膜开始分解温度略低于PPI/PLLA纳米纤维膜。加入TP/PPI/PLLA三元复合纳米纤维膜先于PPI/PLLA二元复合纳米纤维膜分解，说明了PPI/PLLA包埋了一定的TP，就是因为这一部分的TP的存在，PPI/PLLA纳米纤维膜的热稳定性有所下降。经PPI/PLLA纳米纤维膜包埋后，TP的分解温度明显提高，该结果表明PPI/PLLA能够有效提高了TP的热稳定性，因此PPI/PLLA作为包埋多酚等活性物质的载体方面具有一定的应用前景。
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图 3 TP粉末、静电纺PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA复合纳米纤维膜的TG图Figure 3. TG diagram of TP powder, electrospun PPI/PLLA and TP/PPI/PLLA composite nanofiber membranes2.4 接触角分析
接触角（contact angle）是指位于固、液、气三相交界处，自固-液界面经过液体内部到气- 液界面之间的夹角（θ），当θ<90 °时表明固体表面是亲水性的，即液体较易润湿固体，因此接触角值越小则表示样品的亲水性越好；反之，表示样品的亲水性较差，它也是衡量材料表面润湿性能的一项重要参数。如图4所示，随着TP的增加，接触角呈下降趋势，这是因为TP中含有大量的亲水基团所致，使得静电纺复合纳米纤维的亲水性得到改善，但总体还是呈现出疏水性，这是可能是因为加入的TP没有和载体材料发生反应，结构没有被破坏。
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图 4 不同含量TP的PPI/PLLA纳米纤维膜静态接触角Figure 4. Static contact angle of PPI/PLLA nanofiber membrane with different content of TP2.5 X衍射分析
X射线衍射技术在纤维材料领域的应用主要应用体现三个方面[19]，分别为鉴别纤维的种类，测定纤维的取向度及结晶度。静电纺纤维一种新型纳米材料同样可以利用X射线衍射进行结晶及取向等问题研究。图5为TP粉末、静电纺PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA复合纳米纤维膜X-射线衍射谱图。由图5可以看出，TP、静电纺PPI/PLLA纳米纤维膜以及TP/PPI/PLLA复合纳米纤维膜的X射线衍射谱图中仅出现一个较宽的弥散衍射峰，分别位于衍射角21 °、20 °和19 °附近。随着TP的加入，PPI/PLLA纳米纤维膜的衍射峰的逐渐变窄，且强度增强，并向左产生轻微的移动，偏移2 °，表明了小分子TP的加入改变了两者相互作用的方式，在一定程度上改变了PPI/PLLA纳米纤维膜的晶体结构，此外也说明了TP成功地负载在PPI/PLLA纳米纤维膜里。这可能是因为含有PPI、PLLA、TP的三元纺丝溶液中，TP加入改变了原溶液性质，且产生了静电相互作用，导致衍射峰的峰型发生变化。
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图 5 TP粉末、静电纺PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA复合纳米纤维膜的X-射线衍射谱图Figure 5. X-ray diffraction spectrum of TP powder, electrospun PPI/PLLA and TP/PPI/PLLA composite nanofiber membranes2.6 抑菌性能分析
图6为不同TP含量的PPI/PLLA纳米纤维薄膜对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌（E.coli）的抑菌圈实验效果图。由图6可以看出，没有TP加入的PPI/PLLA 纳米纤维膜没有抑菌圈，加入TP的PPI/PLLA纳米纤维膜，使得S.aureus和E.coli的生长受到抑制，其原因是：茶多酚抑制S.aureus和E.coli生长的作用位点是细胞膜，基于TP分子中的多酚羟基与蛋白质分子中的羧基或者氨基发生反应，形成氢键络合，从而破坏细胞膜的通透性。另外，茶多酚的加入充当了竞争者的角色，使得S.aureus和E.coli的转录、复制过程受到影响，进而对其生长产生一定长度的抑制。如表1所示，随着TP含量的增多，抑菌圈的宽度也是不断变大，抗菌作用增强，这可能是由于TP含量的增加加快了其扩散速度。当TP含量大于8%时，抗菌效果不再明显增加，这是由于TP不仅作为抗菌剂，还能在PLLA的辅助下电纺成丝，分布在纤维表面及内部。从图中还可以看出TP对S.aureus的抗菌能力高于E.coli，与较多文献结果一致[20]，这是由于E.coli表面具有保护层，外膜中的多糖与多酚羟基发生反应，从而减少对细胞膜的破坏程度，因此，TP/PPI/PLLA复合纳米纤维薄膜对S.aureus抗菌效果优于E.coli。
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图 6 不同含量TP的PPI/PLLA纳米纤维膜的抑菌效果Figure 6. Antibacterial effects of PPI/PLLA nanofiber membranes with different contents of TP表 1 不同含量TP的PPI/PLLA纳米纤维膜的抑菌圈直径（cm）Table 1. Antibacterial width of PPI/PLLA nanofiber membrane with different content of TP (cm)茶多酚含量（%） 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 0 0a 0a 6 1.49±0.08b 0.75±0.03b 8 1.63±0.09bc 0.91±0.05bc 10 1.82±0.10c 1.10±0.02c 注:每列不同字母表示差异显著，P<0.05。 3. 结论
采用静电纺丝技术，以茶多酚为模型生物活性物质，以PPI/PLLA为载体，制备出含有TP的PPI/PLLA复合纳米纤维薄膜，并对TP/PPI/PLLA纳米纤维膜进行表征和抑菌研究。结果表明：TP的加入对PPI/PLLA复合纳米纤维的形态并未产生明显的影响，但随着TP含量的增加，PPI/PLLA复合纳米纤维的平均直径呈现增加的趋势，分别为（185±57） nm、（199±63） nm和（222±72） nm。TP、PPI和PLLA三者相互作用的方式可能是通过静电相互作用和氢键作用。TP/PPI/PLLA不仅具有良好的疏水性和热稳定性，还具有良好的抑菌效果，尤其是金黄色葡萄球菌。
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图 1 不同含量茶多酚的花生分离蛋白—聚乳酸纳米纤维SEM图
注：图A为未添加TP的复合纳米纤维，图B为添加6%TP的复合纳米纤维，图C为添加8%TP的复合纳米纤维，图D为添加10%TP的复合纳米纤维。
Figure 1. SEM images of peanut protein isolate-polylactic acid nanofibers with different contents of tea polyphenols
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图 2 TP粉末、静电纺PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA纳米纤维膜的FTIR图
Figure 2. FTIR diagram of TP powder, electrospun PPI/PLLA and TP/PPI/PLLA nanofiber membranes
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图 3 TP粉末、静电纺PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA复合纳米纤维膜的TG图
Figure 3. TG diagram of TP powder, electrospun PPI/PLLA and TP/PPI/PLLA composite nanofiber membranes
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图 4 不同含量TP的PPI/PLLA纳米纤维膜静态接触角
Figure 4. Static contact angle of PPI/PLLA nanofiber membrane with different content of TP
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图 5 TP粉末、静电纺PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA复合纳米纤维膜的X-射线衍射谱图
Figure 5. X-ray diffraction spectrum of TP powder, electrospun PPI/PLLA and TP/PPI/PLLA composite nanofiber membranes
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图 6 不同含量TP的PPI/PLLA纳米纤维膜的抑菌效果
Figure 6. Antibacterial effects of PPI/PLLA nanofiber membranes with different contents of TP
表 1 不同含量TP的PPI/PLLA纳米纤维膜的抑菌圈直径（cm）
Table 1 Antibacterial width of PPI/PLLA nanofiber membrane with different content of TP (cm)
茶多酚含量（%） 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 0 0a 0a 6 1.49±0.08b 0.75±0.03b 8 1.63±0.09bc 0.91±0.05bc 10 1.82±0.10c 1.10±0.02c 注:每列不同字母表示差异显著，P<0.05。 
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