Fermentation Process Optimization and Component Analysis of Nectar Wine
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摘要: 为获得花蜜酒最佳酿造工艺，促进其产业化，本文通过单因素实验考察百花蜜酒初始糖度、酵母种类、酵母添加量和发酵温度等因素对花蜜酒感官评价的影响，确定最佳因素组合，并对优化后的花蜜酒进行营养成分、挥发性成分含量和氨基酸含量测定分析。结果表明：花蜜酒的最优发酵工艺参数为百花蜜初始糖度22 °Brix，酵母种类为高活性葡萄酒干酵母，酵母添加量为0.4 g/L，发酵温度15 ℃，发酵时间14 d。在最优发酵工艺条件下检测各指标分别为: 葡萄糖20.0 g/L、果糖76.6 g/L、蔗糖0 g/L、残糖含量15 °Brix、酒精度12.0% vol、苹果酸0.700 g/L、草酸0.049 g/L、16种氨基酸总量32 mg/100 mL，分别是苯丙氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、颉氨酸、异亮氨酸和组氨酸，其中异亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸和谷氨酸的含量较高，赋予了花蜜酒丰富的风味。16种挥发性化合物，分别是乙醇、乙酸乙酯、异丁醇、异戊醇、2-甲基丁醇、苯乙醇、1,2,4,5-四甲苯、萘、2,5-二甲基苯甲醛、乙酸苯乙酯、葵酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、棕榈酸乙酯，其中，乙醇和苯乙醇的浓度最高，分别为50.13%和38.41%，是花蜜酒风味的主要来源。Abstract: To obtain the best brewing technology of nectar wine and promote its industrialization. In this paper, the initial sugar content, the type of yeast, the addition amount of yeast and the fermentation temperature on sensory evaluation of nectar wine were measured by single factor experiment to determine the best factor combination. The nutritional composition, volatile composition contentand and aromatic composition of the optimized nectar wine were determined and analyzed. The results indicated that the optimal fermentation process parameters of nectar wine were as follows: the initial sugar degree was 22 °Brix, high active wine dry yeast was inoculated, the amount of yeast addition was 0.4 g/L, and the nectar wine got the best quality after 14 days of fermentation at 15 ℃. In the optimized fermentation process conditions, the indicators were as follows: glucose 20.0 g/L, fructose 76.6 g/L, sucrose 0 g/L, residual sugar content 15 °Brix, alcohol content 12.5% vol, malic acid 0.700 g/L, oxalic acid 0.049 g/L, total amount of 16 amino acids 32 mg/100 mL, which were phenylalanine, alanine, methionine, proline, glycine, glutamic acid, arginine, lysine, tyrosine, leucine, serine, threonine, aspartic acid, valerine, isoleucine and histidine, including the content of isoleucine, asparagine, phenylalanine and glutamic acid, giving the nectar wine a rich flavor. The 16 volatile compounds were including ethanol, ethyl acetate, isobutanol, isoamyl alcohol, 2-methyl butanol, phenylethyl alcohol, 1,2,4,5-tetramethylbenzene, naphthalene, 2,5-dimethylbenzaldehyde, phenyethyl acetate, ethyl caprate, 2,4-ditertbutylphenol, ethyl dodecanoate, ethyl tetradecanoate, ethyl 9-hexadecenoate, and ethyl palmitate. The highest concentrations of ethanol and phenylethanol were 50.13% and 38.41%, respectively, which were the main sources of nectar wine flavor.
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Keywords:
- nectar /
- mead /
- amino acid /
- volatile components /
- optimization of fermentation process
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蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花粉后并经过自身酿造而产生的一种甜味物质[1]。人类食用蜂蜜距今已有5000多年的历史[2]。蜂蜜中含有丰富的酶类、有机酸、维生素、蛋白质等高级营养成分，是具有一定保健功能的食药同源中的药材。因此，蜂产品的相关研发也在近几年得到突飞猛进的发展。蜂蜜作为天然的营养佳品和独特的甜味物质，被广泛应用于功能饮料的加工中。王虹玲等[3]以西瓜皮、蜂蜜为主要原料，利用微生物发酵，研发出口感清新的蜂蜜西瓜皮乳酸发酵饮料。黄琳等[4]以蜂蜜、澳洲淡色艾尔大麦芽、澳洲水晶焦香麦芽和酒花为原料，酿制成蜂蜜艾尔精酿啤酒。添加蜂蜜后的啤酒具有蜂蜜特殊的香气，整体香气协调，口感丰富。蜂蜜因其特殊的营养和风味，也被广泛应用于番茄蜂蜜果酒[5]、芒果蜂蜜果酒[6]、蜂蜜南瓜酒[7]等果酒酿造。
世界上蜂蜜酒的饮用历史悠久，我国是世界上最先酿造蜂蜜酒的国家之一。蜂蜜酒是将蜂蜜作为原料进行发酵的酒，其发展历史比葡萄酒和啤酒还要早上几千年。蜂蜜中原有的氨基酸、维生素、矿物质等营养成分在酿酒过程中被保留，蜂蜜酒具有健脾通肠、美容养颜、开胃等保健功效[8]。根据蜜蜂采集蜜源植物种类和比例不同，可将蜂蜜分为单花蜜和百花蜜[9]。单花蜜产量较高，价格相对较低。百花蜜产量低，价格相对较高。由于蜜蜂品种和蜜源植物的种类、性质不同，蜂蜜的活性成分和品质也不尽相同[10]，例如桉树蜜因黄酮含量高，可以有效抑制幽门螺杆菌的生长[11]，石楠蜜含有酚酸类物质，具有良好的抗氧化功效[12]。百花蜜的黄酮、总酚酸相比单花蜜更高，且含糖量更高[13]。有研究表明，中华蜂所产百花蜜具有较高的药用价值。中华蜂善于采集山区的蜜源植物，酿制的百花蜂蜜具有清热解毒之功效和补气养血之作用。在人们崇尚自然的今天，中华蜂百花蜜具有广阔的应用前景[14]。
蜂蜜因含糖量较高而产生较高的渗透压，含氮物质较少[15]，因此酵母菌发酵缓慢，制约了蜂蜜酒的酿造。此外，蜂蜜酒在加工过程中也存在酸度过高、二次发酵、异味等问题，导致产品感官品质低[16]。不同品种的蜂蜜所含风味物质和营养成分有较大差别，发酵型蜂蜜酒的品质也存在很大的差异。因此，需要考虑百花蜜酿造花蜜酒的关键技术，包含酵母种类、酵母添加量和发酵过程中的工艺优化等。
本文研究内容如图1所示，旨在采用野生蜜源植物极为丰富的北京市密云县冯家峪镇百花蜜为原料，对花蜜初始糖度含量、酵母种类、酵母添加量和发酵温度进行优化，研发出一种香气协调、口感细腻、酒体饱满的蜂蜜酒，并对最优工艺酿造的花蜜酒品质进行营养成分和香气评价，为花蜜酒的酿造提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
百花蜜 冯家峪镇中华蜂农村合作社；BV818安琪葡萄酒高活性干酵母、帝伯仕葡萄酒·果酒专用酵母、M05蜂蜜酒酵母、娃哈哈饮用纯净水 北京永旺超市；苹果酸、琥珀酸、草酸、柠檬酸等 均为分析纯（≥98%），上海源叶公司。
LH-F90蜂蜜数显折射仪 LH陆恒生物；Agilent 7890B-5977B MSD气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；DIONX ICS-3000戴安离子色谱 美国戴安公司；0044酒精计 创纪仪器仪表有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 花蜜酒发酵工艺
用1 L娃哈哈饮用纯净水稀释花蜜至不同糖度，将配好的花蜜溶液加热至80 ℃，保持30 min[17]，经杀菌后冷却至室温。冷却后的花蜜溶液接种一定量的酵母，在18 ℃培养箱中发酵14 d，发酵液用200目的尼龙布过滤。发酵后的花蜜酒加入焦亚硫酸钾溶液终止发酵，并倒罐澄清，陈酿至清亮透明。
1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 初始糖度对花蜜酒的影响
葡萄糖、果糖和蔗糖是花蜜的主要成分，可被酵母直接利用[18]，因此花蜜酒无需添加其他发酵底物。本试验用1 L娃哈哈饮用纯净水稀释花蜜至不同的糖度，设定糖度分别为10、14、18、22、26 °Brix。将上述调配好的花蜜溶液加热至80 ℃，保持30 min，经巴氏杀菌后冷却至室温，加入0.4 g/L安琪葡萄酒高活性干酵母，在18 ℃恒温培养箱中发酵14 d。根据花蜜酒的酒精度、残糖含量和感官评价，确定最适发酵糖度。
1.2.2.2 酵母种类对花蜜酒的影响
花蜜酒酿造过程中的酵母菌株需具有耐高温和高糖的特点，这对花蜜酒成功酿造起着决定性的作用[19]。调节花蜜溶液糖度至22 °Brix，将调配好花蜜溶液加热至80 ℃，保持30 min，经巴氏杀菌后冷却至室温，分别接种0.4 g/L安琪葡萄酒高活性干酵母、0.4 g/L帝伯仕葡萄酒·果酒专用酵母和0.4 g/L M05蜂蜜酒酵母，在18 ℃下发酵14 d。测定酒精度、残糖含量和感官评价，确定最适发酵的酵母。
1.2.2.3 酵母添加量对花蜜酒的影响
调节花蜜溶液糖度至22 °Brix，将调配好花蜜溶液加热至80 ℃，保持30 min，经巴氏杀菌后冷却至室温，分别接种0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的安琪葡萄酒高活性干酵母。在18 ℃下发酵14 d。测定酒精度、残糖含量和感官评价，确定最佳发酵接种量。
1.2.2.4 发酵温度对花蜜酒的影响
调节花蜜溶液糖度至22 °Brix，将调配好花蜜溶液加热至80 ℃,保持30 min，经巴氏杀菌后冷却至室温，分别接种0.4 g/L安琪葡萄酒高活性干酵母。在9、12、15、18、21 ℃下进行发酵，发酵14 d。测定酒精度、残糖含量和感官评价，确定最佳发酵温度。
1.2.2.5 花蜜酒发酵工艺条件的正交试验
结合单因素实验结果，采用初始糖度（A）、酵母种类（B）、酵母添加量（C）和发酵温度（D）作为考察因素，选用L9（34）正交表进行试验分析，以发酵酒的感官评分为衡量指标，试验因素水平见表1所示。
表 1 花蜜酒发酵工艺条件的正交试验因素水平表Table 1. Factors and levels table of orthogonal experiment of fermentation conditions of nectar wine水平 A初始糖
度（°Brix）B酵母种类 C酵母添加
量（g/L）D发酵温
度（℃）1 14 安琪葡萄酒高活性干酵母 0.4 18 2 18 帝伯仕葡萄酒·果酒专用酵母 0.6 15 3 22 M05蜂蜜酒酵母 0.8 12 1.2.3 测定方法
1.2.3.1 花蜜酒感官评价方法
在中国农业科学院感官分析实验室按照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的标准进行感官分析[20]。味觉小组由中国农业科学院蔬菜花卉研究所师生和北京建工建筑设计研究院10位专家组成（5男5女），年龄在22~40岁之间。陈酿后对花蜜酒进行感官评估。在分析过程中，品酒人员品尝了两次花蜜酒，并要求小组成员在品尝下一瓶花蜜酒之前闻咖啡豆以清除前一次留下的酒香，并用水漱口两次，持续20 s。
对花蜜酒的色泽、香气、口感和后味等感官特性及产品指标进行评价，满分 100分，感官评定标准如表2所示。
表 2 花蜜酒感官评定标准Table 2. Sensory evalution standard of nectar wine项目 感官描述 感官评分（分） 色泽 清亮, 透明, 有光泽 21~30 清亮, 透明, 无明显悬浮物 11~20 微浊, 失光, 有悬浮物和沉淀物 5~10 香气 香气清新, 优雅, 蜂蜜与酒香协调 21~30 酒香较淡, 蜂蜜香气不明显, 但无异香 11~20 香气不足有异香 6~10 口感 酒体丰满, 口感醇和细腻, 入口舒适 16~20 酸甜适度, 口感尚细腻, 但不柔和酒体寡淡 12~15 口感平淡, 不协调 6~11 后味 回味醇香 16~20 略有回味，入口柔和 12~15 回味不足，较难入口 6~11 1.2.3.2 花蜜酒酒精度检测
依据GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定花蜜酒中酒精度含量[20]。用容量瓶称取100 mL花蜜酒于500 mL蒸馏瓶中，用50 mL蒸馏水冲洗容量瓶三次，洗液倒入蒸馏瓶中，再加入适量玻璃珠，连接冷凝器，以取样用的原容量瓶作为接收器（外部冰浴）。开启冷却水，缓慢加热蒸馏，收集馏出液接近刻度，取下容量瓶，塞盖。20 ℃水浴保温30 min，补加水至刻度，混匀，备用。将试样倒入干净干燥的500 mL量筒中，静置5 min，待其气泡消失，放入干燥的酒精计，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡 5 min，水平观测，读取刻度值，并记录温度。根据国标附录将酒精计读数和温度，换成20 ℃时酒精温度。
1.2.3.3 花蜜酒残糖含量检测
花蜜酒残糖含量采用手持折光仪进行测定，单位为 °Brix。
1.2.4 花蜜酒发酵优化后的成分分析
1.2.4.1 花蜜酒中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量测定
根据GB/T 18932.22《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的测定方法-液相色谱示差折光检测法》测定蜂蜜酒中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量，该方法检测准确度较高[21-22]。
将不同浓度的果糖、葡萄糖和蔗糖标准工作液分别注入戴安离子色谱DIONX ICS-3000液相色谱仪，以峰高为纵坐标，工作溶液的浓度为横坐标绘制标准工作曲线。
1.2.4.2 花蜜酒中的有机酸含量测定
试验采用高效液相色谱法测定有机酸成分含量[23]。
样品前处理：准确称取苹果酸、琥珀酸、草酸和柠檬酸四种标准物质配制成标准溶液。称取花蜜酒在10000 r/min离心10 min后，用HCl水溶液洗脱，收集洗脱液调节pH至3.0，取上清液经0.45 μm滤膜过滤。
试验采用高效液相色谱法测定有机酸成分含量。将待测样品用 0.22 μm 滤膜过滤至液相小瓶中，上机测定。色谱柱是Agilent 5TC-C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），流动相采用pH为2.7的（NH4）2HPO4-H3PO4溶液，利用等度洗脱法进行洗脱。柱温设为25 ℃，流速为0.7 mL/min，进样量为20 μL。
1.2.4.3 花蜜酒中的挥发性成分及含量测定
花蜜酒中挥发性化合物含量较低，但却决定着酒体的风味和品质。本研究采用固相微萃取和GC-MS分析方法检测挥发性化合物。
固相微萃取：为了提取花蜜酒中挥发性化合物，将15 mL蜜酒加入顶空瓶紧紧盖上，40 ℃ 水浴加热，让香气成分挥发；然后将固相萃取装置SUPELCO 50/30 DVB/CAR/PDMS（57298-U）固定在顶空瓶上端，平衡20 min后，推出针头，保持针头在顶空瓶内部且不接触酒液，吸附10 min，再用GC-MS分析方法进行检测挥发性化合物。
进样方式：采用Gerstel全自动样品前处理平台；色谱柱：TG-5SILMS（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度：270 ℃；柱箱升温程序：40 ℃ 保持5 min，以15 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至205 ℃，保持5 min；恒流模式2.0 mL/min；采用分流进样，分流比10:1；离子源温度：230 ℃，四级杆温度：150 ℃，辅助加热：280 ℃；扫描模式：SCAN，扫描范围29~550 m/z，阈值150。在NIST（05.L Database）谱库中进行了香气成分对比。
1.2.4.4 花蜜酒中的氨基酸成分测定
氨基酸的测定和分析按照苗雨田等[24]报道的方法进行。取20 mL花蜜酒和20 mL 6% 磺基水杨酸溶液振荡混匀，静置后取上清液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取2 mL用氨基酸自动分析仪测定。
色谱分析条件：进样量为50 μL；检测波长为570、440 nm；茚三酮流速为0.25 mL/min，流动相流速为0.45 mL/min；反应器温度为130 ℃。
1.3 数据处理
所有数据分析均采用SAS 9.3（SAS institute - institute, Cary, NC, USA）进行单因素方差分析（one-way variance, ANOVA），在P<0.05显著水平下采用邓肯检验（Duncan’s test）进行差异显著性检测。绘图采用Ai Illstrator CS6软件绘制。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 花蜜酒初始糖度对花蜜酒品质影响
花蜜酒初始糖度是影响花蜜酒品质的关键因素之一，初始糖度不仅影响花蜜酒的口感，还影响生物胺的生成, 选择适当的初始糖度对花蜜酒品质至关重要[24]。初始糖度决定了酒精度和残糖量，是花蜜酒酿造过程中最重要的工艺条件之一。由表3可知，感官评分由高到低对应的初始糖度为22 °Brix>18 °Brix>14 °Brix>26 °Brix>10 °Brix，即初始发酵糖度为22 °Brix时花蜜酒品质最好。通过本次实验发现，发酵初始糖度越低，酒精度越低，所产生的花蜜酒酒体单薄。发酵初始糖度越高，蜜香浓厚，发酵后甜度更高，发酵时间延长，口感协调度较差。此外，杨晓满等[17]的研究表明，糖度对花蜜酒中组胺和酪胺的形成有显著影响，当醪液的糖度为30 °Brix时, 组胺和酪胺含量高达3. 48 mg/L 和13. 01 mg/L, 是初始糖度为21 °Brix时的2.0 倍，可能造成人过敏现象，综合考虑以上结论，初步确定初始糖度为22 °Brix。
表 3 不同初始糖度对花蜜酒品质影响Table 3. Effects of different initial sugar levels on the quality of nectar wine初始糖度（°Brix） 残糖量（°Brix） 酒精度（%Vol） 感官评分（分） 10 4 6.0 70 14 7 9.5 78 18 10 10.5 85 22 15 13.5 87 26 19 14.5 77 2.1.2 酵母种类对花蜜酒品质影响
酵母种类是决定酒品质的又一重要因素。实验选择了工业化生产中常用的安琪葡萄酒高活性干酵母、酿酒品质较高的帝伯仕葡萄酒·果酒专用酵母和蜂蜜酿造专用的M05蜂蜜酒酵母进行实验。酵母可以使糖度转化为酒精，从表4可以看出，帝伯仕葡萄酒·果酒专用酵母发酵后的花蜜酒酒精度为8.5%Vol，其对糖的利用率低，酒精度含量最低，酵母活性相对其他两种蜂蜜较差，感官评分最低。安琪葡萄酒高活性干酵母和M05蜂蜜酒酵母，残糖量分别为16 °Brix与15 °Brix；酒精度分别为 13.0%Vol与 13.5%Vol，差异较小。经过感官评定为安琪葡萄酒高活性干酵母优于M05蜂蜜酒酵母，感官评分高，安琪葡萄酒高活性干酵母酿造的花蜜酒，酒体更加清透，而M05蜂蜜酒酵母次之。M05酿造的花蜜酒虽然酒体协调，但颜色较混浊，不利于后处理。根据酒精度、残糖量和感官评定结果，安琪葡萄酒高活性干酵母更适合酿造花蜜酒。
表 4 不同种酵母对花蜜酒品质影响Table 4. Effects of different kinds of yeast on the quality of nectar wine酵母品种 残糖量
（°Brix）酒精度
（%Vol）感官评分
（分）安琪高活性葡萄酒干酵母 16 13.0 87 M05蜂蜜酒酵母 15 13.5 85 帝伯仕葡萄酒·果酒专用酵母 18 8.5 80 2.1.3 酵母添加量对花蜜酒品质影响
酵母的添加量决定了发酵启动情况，对发酵时间有重要的影响，在工业生产中有重要意义。由表5可知，随着酵母添加量增大，残糖量逐渐减少。当添加量为0.2 g/L 时，残糖量最高为 18 °Brix；当添加量0.8~1.0 g/L 时，残糖量最低为14 °Brix。当酵母添加量为1.0 g/L时，花蜜酒酒精度可达到14%Vol，发酵速度快，但酒体寡淡，感官评分低。添加量较少时，在相同发酵时间内，发酵速度较低，残糖量较高，口感甜腻。当酵母量过高时，发酵基质中的营养物质同样会被其他微生物利用，导致发酵环境变恶劣，从而使酒体口感较差。此外，酵母菌会产生氨基酸, 导致生物胺增加，所以过高时会增加食用风险[17]。因此，根据残糖量、酒精度和感官评定确定酵母添加量为0.4 g/L 时，花蜜酒酒度适中，酒体协调，品质最好。
表 5 酵母添加量对花蜜酒品质影响Table 5. Effects of yeast addition on the quality of nectar wine酵母添加量（g/L） 残糖量（°Brix） 酒精度（%Vol） 感官评分（分） 0.2 18 9.5 78 0.4 15 12.0 86 0.6 15 12.5 84 0.8 14 13.5 85 1.0 14 14.0 79 2.1.4 发酵温度对花蜜酒品质影响
发酵温度对花蜜酒的香气有重要的影响, 工业化生产中经常选择温度18~25 ℃时发酵。且花蜜酒中组胺和酪胺的含量会随发酵温度升高而增加，而过量的组胺和酪胺会使人体中毒，引起头疼、呼吸紊乱、心悸、呕吐等反应。这是因为发酵温度升高,酵母及一些其他的微生物在发酵酒中的生长代谢速度也会加快，从而使组胺和酪胺含量增加，因此控制食品中组胺和酪胺的形成是酒类食品的重要安全问题[17]。由表6可知，在9~21 ℃ 范围内，发酵温度越高，发酵速度快，但风味单薄，口感较差。发酵温度为15 ℃，残糖含量为15 °Brix，酒精度12%Vol，酒体风味、颜色和口感最佳,感官评分最高。发酵温度对花蜜酒品质影响的感官评价结果依次是：15 ℃>18 ℃>12 ℃>21 ℃>9 ℃。综合考虑以上因素，以15 ℃为花蜜酒的发酵温度，发酵的花蜜酒口感最佳。
表 6 发酵温度对花蜜酒品质影响Table 6. Effects of fermentation temperature on the quality of nectar wine发酵温度（℃） 残糖量（°Brix） 酒精度（%Vol） 感官评分（分） 9 19 8.5 72 12 17 10.5 74 15 15 12.0 86 18 15 12.5 82 21 13 13.5 73 2.1.5 花蜜酒发酵工艺条件的正交试验分析
根据不同初始糖度含量（A）、酵母的种类（B）、酵母添加量（C）和发酵温度（D）对花蜜酒感官影响，选用L9（34）正交表进行正交试验。由表7可知，影响发酵工艺条件的主要因素是发酵温度，因素主要次序为D>A>B>C，即发酵温度>初始糖度>酵母的种类>酵母添加量；同时得到最佳组合为A3B1C1D2，最佳发酵参数为:初始糖度（A）为22 °Brix，酵母的种类（B）为安琪葡萄酒高活性干酵母、接种酵母量（C）为0.4 g/L，发酵温度（D）15 ℃，发酵的花蜜酒蜜香清晰，酒体协调，回味丰富。由表8可知，初始糖度（A）、酵母的种类（B）、接种酵母量（C）和发酵温度（D）四个因素对感官评价的影响达到极显著水平（P<0.01）。
表 7 花蜜酒发酵工艺条件的正交试验因素水平表Table 7. Factors and levels table of orthogonal experiment of fermentation conditions of nectar wine试验号 A初始糖度
（°Brix）B酵母
种类C酵母添加量
（g/L）D发酵温度
（℃）感官评分
（分）1 1 1 1 1 83.25 2 1 2 2 2 83.25 3 1 3 3 3 79.25 4 2 1 2 3 82.50 5 2 2 3 1 84.25 6 2 3 1 2 84.25 7 3 1 3 2 86.25 8 3 2 1 3 83.00 9 3 3 2 1 83.25 k1 81.917 84.000 83.500 83.583 k2 83.667 83.500 83.000 84.583 k3 84.167 82.250 83.250 81.583 R 2.250 1.750 0.500 3.000 最优水平 A3 B1 C1 D2 主次因素 D>A>B>C 最优工艺 A3B1C1D2 表 8 花蜜酒发酵工艺优化正交试验结果方差分析Table 8. Variance analysis of orthogonal experiments results for nectar wine fermentation condition optimization因素 偏差平方和 自由度 MS F值 显著性 A 8.375 2 4.1875 8375 ** B 4.875 2 2.4375 4875 ** C 0.375 2 0.1875 375 ** D 14.000 2 7.0000 14000 ** 误差 0.005 9 0.0005 总变异 27.630 17 注：**表示有极显著差异, F0.01（2,2）= 99.00，F值>F0.01，P<0.01。 2.2 优化条件下的花蜜酒成分分析
2.2.1 花蜜酒中葡萄糖、果糖、蔗糖及有机酸成分及含量
果酒中适量的酸可以使果酒有酸爽感，平衡酒精度和甜度，甚至还可以影响各类物质的化学平衡。在陈酿期间，酸类物质和醇类物质发生酯化反应，使发酵酒具有酯香味。有研究表明酸类物质具有抗氧化性，可以减缓果酒氧化速度，延长保质期[25]。有机酸是蜂蜜酸味物质的主要来源，这些酸味物质是形成蜂蜜酒独特口感必不可少的物质之一[26]。本研究通过高效液相色谱法检测了花蜜酒中4种有机酸:苹果酸、琥珀酸、草酸和柠檬酸。检测结果见表9，苹果酸含量为0.700 g/L, 草酸含量为0.049 g/L，琥珀酸和柠檬酸含量均为0 g/L，通过对4种蜂蜜酒中有机酸的风味强度分析得出:苹果酸是影响百花酒口感的主要有机酸。有研究表明，蜂蜜中柠檬酸含量的检出，是鉴定蜂蜜是否掺假的重要参考依据[23]。本试验酿造的花蜜酒并未有柠檬酸检出，进一步说明了该研究的花蜜酒通过自然发酵产酸，无需其他调配，可达到酸度适中、酒体协调的口感。
表 9 优化条件下的花蜜酒指标Table 9. Physical and chemical indexes of nectar wine under optimized conditions指标 含量 葡萄糖含量 20.000 g/L 果糖含量 76.600 g/L 蔗糖含量 0 g/L 苹果酸含量 0.700 g/L 草酸含量 0.049 g/L 酒精度 12.0%Vol 残糖量 15 °Brix 无论是单花蜜还是百花蜜，蜂蜜的主要成分均是糖类物质，花蜜酒发酵后葡萄糖含量为20.000 g/L，果糖含量为76.600 g/L，蔗糖含量为0 g/L，可以得出果糖是影响花蜜酒糖度的主要物质。优化工艺条件下花蜜酒的糖酸比适中，酒体丰富，各理化指标也较理想。
2.2.2 花蜜酒挥发性化合物成分及含量
花蜜酒不同于果酒、葡萄酒和黄酒，具有独特的蜜香。因此，通过测定花蜜酒的挥发性成分来解释花蜜酒独特的香气。试验应用 GC-MS 检测出了16种挥发性成分。较高的酒精含量对葡萄酒品质起着重要作用，适当的含量和比例同样可以提高花蜜酒的口感[27]。这些挥发性化合物大部分是在酵母发酵过程中由氨基酸产生的[28]。由表10可知，试验从蜂蜜酒中检测到5种醇，分别是乙醇、异丁醇、异戊醇、2-甲基丁醇、苯乙醇，其中乙醇和苯乙醇的浓度最高，分别为50.13%和38.41%。这五种醇类物质都是花蜜酒风味的主要来源[29]。如苯乙醇是由酵母利用糖或由苯丙氨酸代谢产生的高级醇，可以赋予花蜜酒丰富的风味[30]。有研究表明[31]，普通蜂蜜酒中含3-甲基-1-丁醇、苯乙醇，没有乙醇和异戊醇检出，而异戊醇能为酒提供苹果、香蕉芳香味和涩的口感。由此对比可知，花蜜酒不仅能提供普通蜂蜜酒所含的丁醇、苯乙醇，还能提供具有特殊芳香成分的异戊醇和乙醇。
表 10 优化条件下的花蜜酒中挥发性成分Table 10. Contents of volatile component of nectar wine under optimized conditions组分编号 物质名称 相对含量（%） 1 乙醇 50.13 2 乙酸乙酯 0.50 3 异丁醇 0.47 4 异戊醇 4.31 5 2-甲基丁醇 1.74 6 苯乙醇 38.41 7 1,2,4,5-四甲苯 0.26 8 萘 0.59 9 2,5-二甲基甲醛 0.43 10 乙酸苯乙酯 1.61 11 癸酸乙酯 0.13 12 2,4-二叔丁基苯酚 0.30 13 月桂酸乙酯 0.16 14 十四酸乙酯 0.07 15 9-十六碳烯酸乙酯 0.22 16 棕榈酸乙酯 0. 67 酯类主要来源于发酵过程中乙醇酯化和陈酿，绝大多数酯类使酒具有花果香，是酒中一类重要的香气物质。酯类物质种类较多，对特征香气至关重要[32]。由表10可知，优化条件下的蜂蜜酒中酯类成分主要包括乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯和棕榈酸乙酯。与已报到的研究结果不同，花蜜酒中检测出乙酸乙酯，相对含量为0.5%，对花蜜酒的花香和果香特性起到了积极的促进作用[32]。花蜜酒中乙酸苯乙酯的浓度最高，为1.61%，赋予花蜜酒果味，但普通蜂蜜酒中并未检出。癸酸乙酯具有蜂蜜和椰子的香气味，花蜜酒和普通蜂蜜酒均含有癸酸乙酯，这说明发酵保留了癸酸乙酯，使酿造的花蜜酒依然保留蜂蜜的特殊香味。值得注意的是花蜜酒中还检测出月桂酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯和棕榈酸乙酯，会呈现出柔和的青香、果香和花香，而普通蜂蜜酒中并未检出[32]，说明百花蜜发酵过程中，产生了更多的风味物质，丰富了花蜜酒的口感和风味。
醛类也是蜂蜜重要的一种香气物质，也能为花蜜酒香气做出贡献[17]。由表10可知，2,5-二甲基甲醛含量为 0.43%，但普通蜂蜜酒中并未检出醛类物质[31]。花蜜酒除了以上的香气物质外，还含有一定苯酚，烷烯烃类及其他物质，含量较少，对香气贡献不大。因此，采用百花蜜酿蜂蜜酒会增加酒的花果香，可以显著提高酒的品质。
2.2.3 花蜜酒氨基酸成分及含量
花蜜富含游离氨基酸。氨基酸是一些重要的挥发性化合物的前体，如高级醇、酯、醛和酮，它们构成了酒重要的香气特征[33]。此外，氨基酸还是花蜜酒重要的呈味物质，具有甜味，鲜味，酸味，苦味，涩味，氨基酸转化的醛和醇类物质能与酒中的醇类、酯类、有机酸、醛酮类等物质协同作用，增强酒体的层次感。花蜜酒中含有16种氨基酸, 它们分别是Phe（苯丙氨酸）、Ala（丙氨酸）、Met（蛋氨酸）、Pro（脯氨酸）、Gly（甘氨酸）、Glu（谷氨酸）、Arg（精氨酸）、Lys（赖氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Leu（亮氨酸）、Ser（丝氨酸）、Thr（苏氨酸）、Asn（天冬氨酸）、Val（缬氨酸）、Ile（异亮氨酸）和His（组氨酸）。
大量研究表明，酵母发酵过程中特定氨基酸转化为酒中与风味相关的关键醇类和酯类的途径。例如，亮氨酸和缬氨酸转化为异戊醇和异丁醇；苯丙氨酸促进了苯乙基醇缔合酯生成乙酸苯乙酯；苏氨酸是乙醇的前体[34-35]。从表11可知，优化条件下发酵的花蜜酒中含有16种氨基酸, 主要Ile、Asn、Phe和Glu氨基酸含量较高，有助于提高其醇类和酯类含量，从而改善花蜜酒的风味。研究发现，市面蜂蜜酒与本研究的花蜜酒的组氨酸（His）含量均不高，可能是由于在发酵过程中，被酵母利用所导致。花蜜酒天冬氨酸（Asn）含量为5.60 mg/100 L，市面蜂蜜酒天冬氨酸（Asn）含量仅为0.36 mg/100 L，天冬氨酸是蛋白质构造单位，是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体。此外，花蜜酒中检测出2.60 mg/100 L精氨酸（Arg），而市面上的蜂蜜酒未检出，精氨酸在人体发育不成熟或应激条件下，可以作为必需氨基酸为人体提供生长和发育的营养补充。精氨酸不仅能促进人体伤口愈合，还与人体免疫息息相关。由此对比分析可知，富含丰富天冬氨酸和组氨酸的花蜜酒相比市面蜂蜜酒能更好给人体以外源性的补充，可以起到促进人体蛋白质合成、伤口愈合、人体发育等功效。
表 11 优化条件下的花蜜酒中氨基酸含量Table 11. Contents of amino acid of nectar wine under optimized conditions组分编号 组分名称 含量（mg/100 L） 1 Phe 4.90 2 Ala 3.90 3 Met 3.00 4 Pro 3.50 5 Gly 1.60 6 Glu 4.80 7 Arg 2.60 8 Lys 2.00 9 Tyr 3.80 10 Leu 2.60 11 Ser 2.80 12 Thr 2.10 13 Asn 5.60 14 Val 2.90 15 Ile 8.10 16 His 0. 87 3. 结论
花蜜酒具有特殊的蜜香，酒体清淡且富有层次，营养较好，具有很好的开发潜力。本文通过单因素实验，得到花蜜酒的最佳发酵工艺是:以百花蜜为发酵蜜源，初始糖度22 °Brix，安琪葡萄酒高活性干酵母 0.4 g/L，在15 ℃发酵14 d。最佳工艺条件下发酵的花蜜酒糖酸比适中，蜜香清晰，酒体协调，回味丰富。此外，本实验还研究了最优发酵工艺条件下花蜜酒的挥发性化合物含量和氨基酸含量。结果表明，优化后的花蜜酒16种氨基酸，Ile、Asn、Phe和Glu氨基酸含量较高，氨基酸是酵母发酵过程中醇类物质的前体物质，醇类物质在发酵过程进行酯化和陈酿生成酯类，Phe可以促进了苯乙基醇缔合酯生成乙酸苯乙酯；Asn是His和Ile合成前体，His又是乙醇的前体；Leu和Val能转化为异戊醇和异丁醇 [31-32]，赋予花蜜酒丰富的风味。产生的醇类物质还可以与花蜜酒中的有机酸发生酯化反应，使发酵酒具有酯香味。本研究为酿造花蜜酒的工艺提供了参考。
近年来，我国果酒酿造工艺尤其是葡萄酒酿造的研究越来越多，主要集中在菌种的筛选和香气成分分析等，而关于花蜜酒的相关研究较少。未来，应在花蜜酒专用酵母的筛选、花蜜酒体特殊香气的解析以及香气保存等方面进行深入研究，以期促进花蜜酒的产业化应用。
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表 1 花蜜酒发酵工艺条件的正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment of fermentation conditions of nectar wine
水平 A初始糖
度（°Brix）B酵母种类 C酵母添加
量（g/L）D发酵温
度（℃）1 14 安琪葡萄酒高活性干酵母 0.4 18 2 18 帝伯仕葡萄酒·果酒专用酵母 0.6 15 3 22 M05蜂蜜酒酵母 0.8 12 
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表 2 花蜜酒感官评定标准
Table 2 Sensory evalution standard of nectar wine
项目 感官描述 感官评分（分） 色泽 清亮, 透明, 有光泽 21~30 清亮, 透明, 无明显悬浮物 11~20 微浊, 失光, 有悬浮物和沉淀物 5~10 香气 香气清新, 优雅, 蜂蜜与酒香协调 21~30 酒香较淡, 蜂蜜香气不明显, 但无异香 11~20 香气不足有异香 6~10 口感 酒体丰满, 口感醇和细腻, 入口舒适 16~20 酸甜适度, 口感尚细腻, 但不柔和酒体寡淡 12~15 口感平淡, 不协调 6~11 后味 回味醇香 16~20 略有回味，入口柔和 12~15 回味不足，较难入口 6~11
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表 3 不同初始糖度对花蜜酒品质影响
Table 3 Effects of different initial sugar levels on the quality of nectar wine
初始糖度（°Brix） 残糖量（°Brix） 酒精度（%Vol） 感官评分（分） 10 4 6.0 70 14 7 9.5 78 18 10 10.5 85 22 15 13.5 87 26 19 14.5 77
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表 4 不同种酵母对花蜜酒品质影响
Table 4 Effects of different kinds of yeast on the quality of nectar wine
酵母品种 残糖量
（°Brix）酒精度
（%Vol）感官评分
（分）安琪高活性葡萄酒干酵母 16 13.0 87 M05蜂蜜酒酵母 15 13.5 85 帝伯仕葡萄酒·果酒专用酵母 18 8.5 80
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表 5 酵母添加量对花蜜酒品质影响
Table 5 Effects of yeast addition on the quality of nectar wine
酵母添加量（g/L） 残糖量（°Brix） 酒精度（%Vol） 感官评分（分） 0.2 18 9.5 78 0.4 15 12.0 86 0.6 15 12.5 84 0.8 14 13.5 85 1.0 14 14.0 79
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表 6 发酵温度对花蜜酒品质影响
Table 6 Effects of fermentation temperature on the quality of nectar wine
发酵温度（℃） 残糖量（°Brix） 酒精度（%Vol） 感官评分（分） 9 19 8.5 72 12 17 10.5 74 15 15 12.0 86 18 15 12.5 82 21 13 13.5 73
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表 7 花蜜酒发酵工艺条件的正交试验因素水平表
Table 7 Factors and levels table of orthogonal experiment of fermentation conditions of nectar wine
试验号 A初始糖度
（°Brix）B酵母
种类C酵母添加量
（g/L）D发酵温度
（℃）感官评分
（分）1 1 1 1 1 83.25 2 1 2 2 2 83.25 3 1 3 3 3 79.25 4 2 1 2 3 82.50 5 2 2 3 1 84.25 6 2 3 1 2 84.25 7 3 1 3 2 86.25 8 3 2 1 3 83.00 9 3 3 2 1 83.25 k1 81.917 84.000 83.500 83.583 k2 83.667 83.500 83.000 84.583 k3 84.167 82.250 83.250 81.583 R 2.250 1.750 0.500 3.000 最优水平 A3 B1 C1 D2 主次因素 D>A>B>C 最优工艺 A3B1C1D2
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表 8 花蜜酒发酵工艺优化正交试验结果方差分析
Table 8 Variance analysis of orthogonal experiments results for nectar wine fermentation condition optimization
因素 偏差平方和 自由度 MS F值 显著性 A 8.375 2 4.1875 8375 ** B 4.875 2 2.4375 4875 ** C 0.375 2 0.1875 375 ** D 14.000 2 7.0000 14000 ** 误差 0.005 9 0.0005 总变异 27.630 17 注：**表示有极显著差异, F0.01（2,2）= 99.00，F值>F0.01，P<0.01。
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表 9 优化条件下的花蜜酒指标
Table 9 Physical and chemical indexes of nectar wine under optimized conditions
指标 含量 葡萄糖含量 20.000 g/L 果糖含量 76.600 g/L 蔗糖含量 0 g/L 苹果酸含量 0.700 g/L 草酸含量 0.049 g/L 酒精度 12.0%Vol 残糖量 15 °Brix
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表 10 优化条件下的花蜜酒中挥发性成分
Table 10 Contents of volatile component of nectar wine under optimized conditions
组分编号 物质名称 相对含量（%） 1 乙醇 50.13 2 乙酸乙酯 0.50 3 异丁醇 0.47 4 异戊醇 4.31 5 2-甲基丁醇 1.74 6 苯乙醇 38.41 7 1,2,4,5-四甲苯 0.26 8 萘 0.59 9 2,5-二甲基甲醛 0.43 10 乙酸苯乙酯 1.61 11 癸酸乙酯 0.13 12 2,4-二叔丁基苯酚 0.30 13 月桂酸乙酯 0.16 14 十四酸乙酯 0.07 15 9-十六碳烯酸乙酯 0.22 16 棕榈酸乙酯 0. 67
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表 11 优化条件下的花蜜酒中氨基酸含量
Table 11 Contents of amino acid of nectar wine under optimized conditions
组分编号 组分名称 含量（mg/100 L） 1 Phe 4.90 2 Ala 3.90 3 Met 3.00 4 Pro 3.50 5 Gly 1.60 6 Glu 4.80 7 Arg 2.60 8 Lys 2.00 9 Tyr 3.80 10 Leu 2.60 11 Ser 2.80 12 Thr 2.10 13 Asn 5.60 14 Val 2.90 15 Ile 8.10 16 His 0. 87
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