特纳草（Damiana），又称达迷草、达米阿那，是墨西哥和中南美洲特有的一种唇形科特纳草属多年生草本植物，主要分布于巴西东北部、中美洲、加勒比海地区、墨西哥和德克萨斯州干旱和半干旱地区^[1,2]。特纳草在国外因壮阳作用而闻名，具有较高的经济效益，可用于治疗阳痿、痛经、激素失衡、性病、抑郁症、痢疾、食欲不振、消化不良等，是很多重要药品和保健品的原料^[2-7]。

黄酮是特纳草中重要的有效成分，Zhao等^[8]和Johanna等^[9]分别从特纳草中分离鉴定出19种和3种黄酮成分，Piacente等^[10]从墨西哥采摘的特纳草中分离出6种黄酮成分。综合分析国外文献，已鉴定结构的特纳草黄酮按母核结构主要分成五类：黄烷酮、柚皮素、芹菜素及其衍生物、木犀草素和苜蓿素衍生物、槲皮素和杨梅素衍生物^[5,8-15]。黄酮可通过溶剂萃取、超临界流体萃取、微波提取、超声提取等方法提取^[16-19]。对于特纳草黄酮的提取，目前文献报道主要采用溶剂萃取法，也有采用超声强化法^[7,9-10]。Piacente等^[10]和Kumar等^[7]分别用沸水和甲醇从墨西哥和印度种植的特纳草中提取出黄酮。常规溶剂提取时间较长，而超声作用能促使细胞壁、细胞膜破裂，利于有效成分溶出和扩散，提高效率，缩短时间^[20,21]。Johanna等^[9]以70%丙酮为溶剂，采用了超声强化提取特纳草黄酮成分，效率高，用时短。

特纳草提取物具有明显的抗氧化作用。Torres-González等^[22]研究发现特纳草醇-水提取物具有明显的清除DPPH自由基作用，提取物浓度为1.0 mg/mL时，清除率达82.47%。Salazar等^[23]试验表明，特纳草甲醇提取物能清除DPPH自由基，还能抑制黄嘌呤氧化酶的活性。Jonathan^[24]的研究显示特纳草提取物具有明显的抗氧化作用，且起作用的主要成分为黄酮类化合物——木犀草素。

近年来，我国云南开展了特纳草的引种种植，由于时间短，尚没有开展有效成分提取及相关性质的研究。基于此，本论文以我国引种的特纳草为原料，进行超声强化黄酮的提取，通过试验考察超声时间、温度、超声功率、料液比、乙醇体积分数等对黄酮提取率的影响，结合响应面法进行优化，并通过清除DPPH自由基、ABTS自由基及还原力试验考察黄酮的抗氧化能力，以期为我国特纳草的开发利用提供参考。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

特纳草　云南红河谷辣木产业有限公司；芦丁（99%）　上海麦克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）、22’-二氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸阳离子自由基（ABTS⁺·）　南京都莱生物技术有限公司；过硫酸钾、醋酸钠　福晨（天津）化学试剂有限公司；醋酸　天津市富宇精细化工有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠　天津市永大化学试剂有限公司；氢氧化钠、无水乙醇　天津市百世化工有限公司；自制去离子水；所有测试用试剂　均为分析纯。

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器　巩义市予华仪器有限公司；UV-1800紫外可见吸收光谱仪　日本岛津公司；800Y高速多功能粉碎机　武义海纳电器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵　巩义市予华仪器有限公司；DHG-9030A鼓风干燥箱　上海一恒科学仪器有限公司；BILON-1000D超声波信号发生器　上海比朗仪器有限公司。

1.2   试验方法

1.2.1   特纳草黄酮的提取工艺流程

60 ℃烘至恒重→粉碎→过50目筛→加入溶剂→超声提取→定容→过滤（滤液作为提取液）。

1.2.2   超声提取试验

1.2.2.1   超声时间对黄酮提取率的影响

以60%乙醇，料液比1:60（g/mL），超声功率240 W，超声温度55 ℃为固定条件，考察超声时间为10、20、30、40、60 min时对特纳草黄酮提取率的影响。

1.2.2.2   超声温度对黄酮提取率的影响

以60%乙醇，料液比1:60（g/mL），超声功率240 W，超声时间30 min为固定条件，考察超声温度为30、40、55、65、75、85 ℃时对特纳草黄酮提取率的影响。

1.2.2.3   超声功率对黄酮提取率的影响

以60%乙醇，料液比1:60（g/mL），超声时间30 min，超声温度55 ℃为固定条件，考察超声功率为0、160、240、320、400 W时对特纳草黄酮提取率的影响。

1.2.2.4   料液比对黄酮提取率的影响

以60%乙醇，超声功率240 W，超声时间30 min，超声温度55 ℃为固定条件，考察料液比为1:20、1:40、1:60、1:80、1:100 g/mL时对特纳草黄酮提取率的影响。

1.2.2.5   乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

以料液比1:60（g/mL），超声功率240 W，超声时间30 min，超声温度55 ℃为固定条件，考察乙醇体积分数为0%、20%、40%、60%、80%、90%、无水乙醇时对特纳草黄酮提取率的影响。

1.2.3   响应面试验设计

根据上述试验结果，使用Design-Expert.V8.0.6.1软件，以黄酮提取率为响应值，超声时间、超声功率、超声温度和乙醇体积为响应变量，设计4因素3水平的响应面分析试验，根据结果确定特纳草黄酮的最佳提取条件。试验因素及水平如表1所示。

表  1  响应面试验因素与水平设计

Table  1.  Response surface test factors and level design

水平	因素
	A超声时间（min）	B超声功率（W）	C超声温度（℃）	D乙醇体积分数（%）
−1	30	240	55	70
0	40	320	65	80
1	50	400	75	90

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1.2.4   黄酮提取率的测定

1.2.4.1   标准曲线的制作

按文献方法^[25]进行操作。以芦丁为标准品，采用氯化铝-甲醇法测400 nm波长处的吸光度，以质量浓度对吸光度绘制标准曲线。在0.005~0.050 mg/mL浓度范围内得回归方程为：y=21.0589x−0.00518，R²=0.99969。

1.2.4.2   黄酮提取率的测定

准确吸取适量提取液于10 mL比色管中，摇匀得样品液，其余操作与上述标准曲线的制作相同，测定样品液中黄酮含量，并计算黄酮提取率。

式中，m₁和m₂分别表示提取液中黄酮的质量和原料（干基）中黄酮的质量（g）。

1.2.5   抗氧化性试验

1.2.5.1   清除DPPH自由基试验

参照陈丛瑾等^[26]方法稍作修改，对1.2.1的黄酮粗提液进行浓缩，用去离子水稀释浓缩液制成0.005、0.01、0.015、0.03、0.1 mg/mL 5个不同浓度样品液，取0.5 mL 样品液于10 mL比色管中，加入4.5 mL 0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液充分混匀，室温下反应30 min，于519 nm处测定吸光值A₀，同时测定0.5 mL样品液与4.5 mL无水乙醇混合后的吸光值A_j和空白样品吸光值A_c。

1.2.5.2   清除ABTS自由基试验

参照李培源等^[27]方法稍作修改，称取一定量ABTS溶解于20 mmol/L、pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，振荡溶解配制成7 mmol/L的ABTS储备液；称取一定量的过硫酸钾溶解于去离子水中，配制成2.45 mmol/L过硫酸钾溶液，取体积比为1:1的ABTS储备液和过硫酸钾溶液混合摇匀，在黑暗处氧化12 h，稀释30倍得到ABTS自由基工作液。设置5个样品浓度，分别为0.005、0.01、0.015、0.05、0.1 mg/mL，取1 mL不同浓度的样品液与4 mL工作液于25 mL比色管中，充分混合后在黑暗处反应30 min，在734 nm处测吸光值，记为${{\rm{A}}}_{0}'$，再取1 mL样品液与4 mL无水乙醇充分混合后测量吸光值，记为${{\rm{A}}}_{{\rm{j}}}'$，空白样品吸光值为${{\rm{A}}}_{{\rm{c}}}'$。

1.2.5.3   还原力试验

参考文献[28]，分别移取0.01、0.02、0.03、0.0785、0.157 mg/mL 5个不同浓度的样品溶液1.5 mL于离心管中，加入0.2 moL/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）1.5 mL和1%铁氰化钾溶液1.5 mL，将混合物于50 ℃水浴保温20 min，加入1.5 mL 10%（w/v）三氯乙酸溶液，混合溶液3000 r/min离心10 min，精密吸取上清液2.00 mL，加入7.5 mL蒸馏水和0.5 mL 1%的三氯化铁溶液，在700 nm处测吸光度（吸光度值越大，还原力越强）。

1.3   数据处理

所有试验重复3次，采用Origin2017和Design-Expert.V8.0.6.1软件对试验数据进行作图和分析。

2.   结果与分析

2.1   单因素实验结果

2.1.1   超声时间对提取率的影响

由图1可知，随着提取时间的延长，黄酮提取率先升高后趋于稳定，体现了提取量随时间延长的累积效应^[29]，在提取时间为40 min时基本趋于平稳，可能是随着时间的增加，粘液等物质溶出，溶液中杂质的含量增加，降低了黄酮类物质在溶剂中的扩散速度，影响黄酮的提取率^[30]。选择40 min左右比较适宜。

图  1  超声时间对黄酮提取率的影响

Figure  1.  Effect of ultrasound time on the extraction rate of flavonoids

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2.1.2   超声温度对提取率的影响

由图2可知，随超声温度的升高，特纳草黄酮的提取率先升高后下降，在65 ℃时提取率达到最大，当超声温度超过65 ℃时，含量下降。从理论上讲，升高超声温度，分子的运动速率加快，提取液黏度降低，利于黄酮的溶解与溶出，提取率增加^[31]。但当超声温度继续升高，溶剂挥发加剧，有效溶剂量降低，溶剂与特纳草接触面积减少，降低了扩散速率，使得提取率降低；此外，在高温条件下，杂质更容易溶出，对后续分离不利，同时也增加了能耗^[32]。综合各因素考虑，适宜的超声温度为65 ℃。

图  2  超声温度对黄酮提取率的影响

Figure  2.  Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of flavonoids

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2.1.3   超声功率对提取率的影响

由图3可知，随超声功率的加大，特纳草黄酮的提取率先升高后下降，在320 W时提取率达到最大。由于超声波在溶液中传播时，具有空化效应，能破坏细胞壁和细胞膜，使存在于细胞内的物质更容易溶出，超声功率越大，空化越剧烈，细胞破坏越充分，黄酮越易溶出，提取率越大^[33]。但超声功率过大，会产生大量无用的气泡，形成声屏障，阻碍声传播，对提取反而不利^[34]。本试验较佳的超声功率为320 W。

图  3  超声功率对黄酮提取率的影响

Figure  3.  Effect of ultrasonic power on the extraction rate of flavonoids

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2.1.4   料液比对提取率的影响

由图4可知，随着溶剂用量的增大，黄酮的提取率大体呈上升趋势，但料液比从1:40 g/mL增加到1:100 g/mL之间，提取率增加的幅度较小，提取率增加小于2%。随着料液比的增加，溶剂用量大，会大幅提高提取液中溶剂回收的成本。因此，适宜的料液比为1:40 g/mL。

图  4  料液比对黄酮提取率的影响

Figure  4.  Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

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2.1.5   乙醇体积分数对提取率的影响

由图5可知，随着乙醇体积分数的提高，特纳草黄酮提取率逐渐增大。当乙醇体积分数达到80%时，黄酮的提取率最大。超过80%时，溶剂极性降低，根据相似相溶原理，亲水性强的黄酮溶出减少，反而醇溶性的杂质溶出增多，降低了黄酮的提取率^[32]。所以，乙醇体积分数80%左右比较适宜。

图  5  乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

Figure  5.  Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of flavonoids

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2.2   响应面法优化提取工艺

前述试验结果表明，料液比对特纳草黄酮提取率的影响较小，为简化试验，减少试验次数，选择超声时间、超声功率、超声温度和乙醇体积为响应设计变量，设置4因素3水平响应面分析试验共有29个试验点，其中5个中心点，24个析因点，设计方案及结果见表2。

表  2  试验设计方案及结果

Table  2.  Experimental design scheme and results

试验号	A	B	C	D	黄酮提取率（%）
1	0	1	0	−1	91.19
2	0	−1	0	−1	87.66
3	1	0	−1	0	83.67
4	0	0	1	1	91.72
5	1	0	0	−1	87.78
6	0	0	−1	−1	83.61
7	0	0	0	0	93.39
8	−1	0	1	0	89.05
9	0	1	1	0	90.95
10	−1	−1	0	0	83.61
11	−1	0	0	−1	88.2
12	0	0	0	0	94.52
13	−1	0	0	1	89.15
14	0	0	0	0	95.71
15	1	0	0	1	93.26
16	1	1	0	0	87.97
17	1	−1	0	0	89.46
18	0	0	−1	1	86.83
19	1	0	1	0	94.24
20	−1	1	0	0	89.69
21	0	−1	1	0	88.98
22	0	0	0	0	95.77
23	0	−1	−1	0	83.13
24	0	−1	0	1	90.3
25	0	1	−1	0	86.18
26	−1	0	−1	0	84.26
27	0	0	0	0	93.92
28	0	0	1	−1	93.40
29	0	1	0	1	91.01

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2.2.1   模型的建立及其显著性检验

利用Design-Expert.V8.0.6.1对表2的试验结果进行响应面分析法分析，以黄酮提取率为响应值，对超声时间（A）、超声功率（B）、超声温度（C）、乙醇体积分数（D）经回归拟合后，得到的回归方程为：

Y=94.66+1.04A+1.15B+3.39C+0.87D−1.89AB+1.45AC+1.13AD−0.27BC−0.70BD−1.23CD−3.34A²−3.37B²−3.88C²−1.62D²

根据回归方程方差分析及相关系数来考察模型的可靠性。由表3可知，二次回归模型的F值为29.74，P值<0.0001，失拟项P=0.6710>0.1000，表示试验结果和数学模型拟合良好。试验模型的决定系数R²=0.9675，说明该回归方程能很好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以用其确定最佳提取工艺条件，试验结果与模型预测结果有着良好的一致性。试验模型的校正系数R_adj ²=0.9349，试验结果有93.49%受试验因素的影响。因此，结果可靠，该数学模型可用于推测特纳草黄酮提取量试验结果。4个因素对黄酮提取量的影响顺序为：超声温度>超声功率>超声时间>乙醇体积分数。一次项A、B、C、D，交互项AB、AC及二次项A²、B²、C²、D²对试验指标有极显著的影响（P<0.01），交互项AD、CD对试验有显著的影响（P<0.05），其余项不显著。

表  3  回归方程各项的方差分析

Table  3.  Analysis of variance of the regression equation

来源	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	389.51	14	27.82	29.74	<0.0001	**
A	12.85	1	12.85	13.74	0.0023	**
B	15.99	1	15.99	17.09	0.0010	**
C	137.77	1	137.77	147.28	<0.0001	**
D	9.07	1	9.07	9.69	0.0076	**
AB	14.33	1	14.33	15.32	0.0016	**
AC	8.35	1	8.35	8.93	0.0098	**
AD	5.13	1	5.13	5.48	0.0345	*
BC	0.29	1	0.29	0.31	0.5854
BD	1.99	1	1.99	2.13	0.1669
CD	6.00	1	6.00	6.42	0.0239	*
A2	72.48	1	72.48	77.48	<0.0001	**
B2	73.62	1	73.62	78.70	<0.0001	**
C2	97.78	1	97.78	104.54	<0.0001	**
D2	17.05	1	17.05	18.23	0.0008	**
残差	13.10	14	0.94
失拟项	8.58	10	0.86	0.76	0.6710
净误差	4.51	4	1.13
总误差	402.60	28
注：*，P<0.05，差异显著；**，P<0.01，差异极显著。

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2.2.2   响应面交互作用分析及最优条件验证

利用Box-Behnken分析各因素交互作用，拟合出响应面立体图，更直观描述各因素之间的交互作用对特纳草黄酮提取率的影响，结果如图6~图11所示。

图  6  超声功率和超声时间对特纳草黄酮提取率的影响

Figure  6.  Effect of ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction rate of damiana flavonoids

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图  7  超声时间和超声温度对特纳草黄酮提取率的影响

Figure  7.  Effect of ultrasonic time and temperature on the extraction rate of damiana flavonoids

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图  8  超声时间和乙醇体积分数对特纳草黄酮提取率的影响

Figure  8.  Effect of ultrasound time and ethanol volume fraction on the extraction rate of damiana flavonoids

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图  9  超声功率和超声温度对特纳草黄酮提取率的影响

Figure  9.  Effect of ultrasonic power and temperature on the extraction rate of damiana flavonoids

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图  10  超声功率和乙醇体积分数对特纳草黄酮提取率的影响

Figure  10.  Effect of ultrasonic power and ethanol volume fraction on the extraction rate of damiana flavonoids

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图  11  超声温度和乙醇体积分数对特纳草黄酮提取率的影响

Figure  11.  Effect of ultrasonic temperature and ethanol volume fraction on the extraction rate of damiana flavonoids

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由图6~图11可知，超声温度对特纳草黄酮提取效果的影响最为显著。在交互项对提取率的影响中，超声时间与超声功率、超声时间与超声温度之间交互作用明显，表现为曲线较陡，响应值变化较大；超声时间和乙醇体积分数、超声温度和乙醇体积分数之间的交互作用对响应值的影响较小，曲线较为平滑，对响应值变化较小。

由响应面分析建立的数学模型可知，预测黄酮提取最佳工艺条件为超声时间42.26 min、超声温度69.55 ℃、超声功率324.8 W、乙醇体积分数81.75%，考虑实际操作方便，调整最佳工艺条件为超声时间42 min、超声温度70 ℃、超声功率320 W、乙醇体积分数82%，在此工艺条件下，特纳草黄酮提取率为94.4%±2.37%，与模型预测值95.68%之间的标准差为0.9051，模型能较好预测特纳草中黄酮提取率，优化工艺条件真实可靠。

2.3   特纳草黄酮抗氧化试验

2.3.1   清除DPPH自由基效果

黄酮类物质可以提供质子与DPPH自由基结合而形成一种稳定的抗磁性分子，降低DPPH自由基的含量^[25,35]。由图12可知，随着黄酮提取液浓度的增加，DPPH自由基的清除率也在增加，黄酮提取液对DPPH自由基清除作用的IC₅₀值为0.0283 mg/mL，而V_C为0.0070 mg/mL。由此可知，特纳草黄酮提取液对DPPH自由基的清除能力弱于V_C。

图  12  特纳草黄酮提取液对DPPH自由基的清除效果

Figure  12.  Scavenging effect of damiana flavonoids extract on DPPH free radicals

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2.3.2   清除ABTS自由基效果

由图13可知，样品液中黄酮含量与对ABTS自由基的清除能力正相关。特纳草黄酮提取液对ABTS自由基清除作用的IC₅₀值为0.0272 mg/mL，说明其对水溶性自由基有良好的清除作用；而V_C的IC₅₀值为0.0065 mg/mL，说明特纳草黄酮提取物有一定的清除ABTS自由基的能力，但是效果较V_C弱。

图  13  特纳草黄酮提取液对ABTS自由基的清除效果

Figure  13.  Scavenging effect of damiana flavonoids extract on ABTS free radicals

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2.3.3   还原力测定

特纳草黄酮提取物的还原力变化如图14所示，随着提取液黄酮浓度的增加，吸光值呈线性增加，吸光度值越大，还原力越强。当浓度小于0.09 mg/mL时，特纳草黄酮的还原力与V_C基本相同，当浓度大于0.09 mg/mL时，特纳草黄酮的还原力比相同浓度的V_C强，浓度越大还原力差异越明显，表明特纳草黄酮具有较高的抗氧化性。

图  14  特纳草黄酮提取液的还原力

Figure  14.  Reducing power of damiana flavonoid extract

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3.   结论

在单因素实验基础上，使用Design-Expert 8.0 软件对乙醇体积分数、超声时间、超声温度和液料比进行中心组合实验设计和数据拟合，得到模型的决定系数R²=0.9675，说明试验结果与模型预测结果有着良好的一致性；各因素对黄酮提取率的影响顺序为：超声温度>超声功率>超声时间>乙醇体积分数；最佳提取工艺条件为超声时间42 min、超声温度70 ℃、超声功率320 W、乙醇体积分数82%，在此工艺条件下，特纳草黄酮提取率为94.4%。特纳草黄酮的抗氧化试验结果表明，特纳草黄酮具有较强的清除DPPH自由基和ABTS自由基能力以及还原力，是良好的天然抗氧化剂。试验表明特纳草黄酮具有抗氧化作用，但本文所用原料是特纳草的黄酮粗提液，杂质较多，黄酮可能不是其唯一抗氧化作用的物质，还需进一步纯化、结构鉴定，用得到的纯化产物进行抗氧化试验等研究。