Study on Fungistasis of Marine Bacteria BMF04 and Removal Effect on Toxin
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摘要: 为了明确海洋细菌BMF04菌株的抑菌作用和毒素去除作用及其降解毒素机理。采用平板对峙法测定BMF04菌株及无菌发酵液对小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、小麦雪腐镰刀菌（Fusarium nivale (Fr) Ces.）的抑制作用；采用含毒平板法和HPLC法测定该菌株、无菌发酵液、细胞壁悬浮液、胞内液对玉米赤霉烯酮（ZEN）毒素的去除作用和高温以及蛋白酶处理对BMF04菌株去除ZEN毒素作用的影响，明确该菌株去除毒素的作用机理。结果表明，BMF04菌株及无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌具有较强的抑菌作用；BMF04菌株对ZEN毒素具有较强的去除作用，当培养液中ZEN毒素浓度为15 µg/mL时，菌株活菌、无菌发酵液、细胞壁悬浮液和胞内液均对ZEN毒素具有较强的去除作用，去除率分别98.92%±0.07%、98.70%±0.19%、97.85%±0.07%和98.54%±0.10%，菌液在121 ℃条件下高温处理30 min，灭活菌液和灭活无菌发酵液对ZEN毒素的去除率明显下降，仅为60.32%±0.21%、2.09%±1.15%，胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理后，去除率分别下降到3.52%±0.77%、0.50%±0.39% 和0.18%±0.12%，说明高温灭活和蛋白酶对BMF04菌株发酵液去除ZEN毒素作用具有显著影响；菌株去除ZEN毒素既有胞外蛋白质降解作用也有细胞壁的吸附作用。研究结果为微生物去除污染粮食、饲料中的ZEN毒素提供了新的菌种资源。
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关键词:
- 海洋细菌 /
- 玉米赤霉烯酮(ZEN) /
- 抑菌带宽度 /
- 去除率 /
- 生物降解
Abstract: In order to clarify the inhibitory effects, toxin removal capacity and toxin degradation mechanism of marine bacteria BMF04. Firstly, the inhibitory effects of BMF04 strain and its aseptic fermentation broth on Fusarium graminearum and Fusarium nivale (Fr) Ces. were determined by the plate-stand method; Secondly, the removal of ZEN by live strain, aseptic fermentation broth, cell wall suspension and intracellular fluid, as well as the effect of hightemperature and protease treatment on the removal of ZEN by BMF04 strain were determined by toxicity plate method and HPLC method, to clarify the mechanism of its action of removing toxin. The results showed that BMF04 had good inhibitory effect on F. graminearum and F. nivale (Fr) Ces.. The strain BMF04 strain had a strong ability to remove Zen toxin, and when the concentration was 15 µg/mL, the live strain, the aseptic fermentation liquid, the cell wall suspension and the intracellular liquid had strong removal effect on ZEN, the removal rates were 98.92%±0.07%, 98.70%±0.19%, 97.85%±0.07% and 98.54%±0.10%, respectively. After high temperature inactivation, the removal rate of ZEN was reduced to 60.32%±0.21% and 2.09%±1.15%. After treatment with trypsin, pepsin and proteinase K, the removal rates decreased to 3.52%±0.77%, 0.50%±0.39% and 0.18%± 0.12%, indicating that high temperature inactivation and protease had significant effects on the removal of ZEN from BMF04 fermentation broth. Therefore, the removal of ZEN by the strain had both the degradation of extracellular protein and the adsorption of cell wall. The results of this study provided a new strain resource for the biological removal of ZEN toxin from contaminated food and feed, and also provided a theoretical basis for the biodegradation of ZEN toxin.-
Keywords:
- marine bacteria /
- zearalenone (ZEN) /
- inhibition zone width /
- degradation rate /
- biodegradation
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小麦赤霉病（Fusarium Head Blight, FHB）是由小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）和小麦雪腐镰刀菌（Fusarium nivale（Fr）Ces.）等多种镰刀菌引起的真菌病害[1]，感病后导致籽粒皱缩，品质下降，产生可破坏人和动物的免疫系统、致癌、致畸的等多种毒素，严重威胁到人畜的健康安全[2-4]。ZEN毒素是世界上污染最为广泛的镰刀菌毒素，在全世界谷物以及农副产品中检出率高90%[5]，我国粮食原料及饲料中霉菌毒素污染十分普遍且严重[6-8]，不同地区和不同季节的原料及饲料产品检出率为70%~100%[9]。开发安全有效的方法控制毒素的产生和去除已产生的毒素迫在眉睫。
传统的毒素降解方法主要有物理降解法和化学降解法。工业上主要采取活性炭、硅铝酸盐、寡聚糖等物理吸附剂吸附，其有较强选择性，能有效降低生产成本，但是物理吸附剂易破坏营养成分而影响营养素的吸收。Volko等[10]研究表明，毒素吸附剂不能有效彻底去除ZEN毒素，对动物的生产性能产生很大影响。化学脱毒法通过氧化处理或碱处理，可达到比物理脱毒方法更好的效果，但化学脱毒方法难以在实际生产中大规模进行，添加化学试剂可能在粮食和饲料中有残留，造成营养物质破坏和二次污染等，存在着不可避免的局限性[11]。生物降解法主要由微生物产生的次级代谢产物和胞内、胞外酶分解毒素，产生的降解产物无毒，并对原料中的其他成分没有破坏作用，不会降低营养价值，是解决霉菌毒素污染的发展方向和趋势。目前用于毒素降解的微生物菌株较少，筛选既能够高效抑制小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌生长又能去除毒素的微生物生防菌株，可以有效减少小麦赤霉病的发生和毒素的产生，对于保障食品安全有重要意义[12-14]。国内外不同学者已经从土壤等不同环境中分离到一些降解ZEN毒素的微生物菌株，主要有红球菌（Rhodococcus）[15-16]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[17-18]、链霉菌（Streptomyces）[19]、假单胞菌（Pseudomonas）[20]、酵母菌等[21-22]，应用微生物去除毒素已经成为发展趋势。
BMF04菌株是本实验室从连云港海域分离的对多种病原菌具有较强抑制作用，并具有促生作用的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）[23]，有关该菌株对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀病菌的抑制作用及其对ZEN毒素的去除作用尚未进行研究，本研究测定该菌株对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀病菌菌丝的抑菌作用和对ZEN毒素的降解作用，探究其降解ZEN毒素的降解机理，为该菌株用于降解ZEN毒素提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
供试菌株：海洋甲基营养型芽孢杆菌BMF04（B. methylotrophicus） 由本实验室从连云港海域分离并保存；小麦赤霉病菌（F. graminearum）、小麦雪腐镰刀菌（F. nivale（Fr）Ces.）、大肠杆菌（Escherichia coli）、解淀粉芽孢杆菌GM-1-2（Bacillus amyloliquefaciens） 由本实验室分离并保存；PDA培养基、PD培养基、DF培养基（2.44 g/L Na2HPO4，1.52 g/L KH2PO4，0.5 g/L（NH4）2SO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.05 g/L CaCl2） 实验室自配；玉米赤霉烯酮毒素（ZEN） 江苏省农业科学院粮食作物研究所制备提供；胰蛋白酶（25万 U/g） Biosharp公司；胃蛋白酶（300万~350万 U/g） Bio Basic Inc公司；蛋白酶K（4万 U/g） 德国MERCK公司。
安捷伦1260高效液相色谱仪（配有可变波长紫外检测器、OpenLAB 3.3.2 SP3安捷伦液相色谱化学工作站） 美国安捷伦公司；Biosafer-20TC实验室级超纯水器 赛飞（中国）有限公司；MIKIO 200 R高速冷冻离心机 德国Hettich科学仪器有限公司；JY92-IIDN超声波细胞粉碎机隔音箱 上海净信实业发展有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 BMF04菌株及无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌菌丝生长的抑制作用
1.2.1.1 菌株对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌菌丝生长的抑制作用
采用平板对峙法测定BMF04菌株对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌菌丝的抑制作用。小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌在PDA平板上28 ℃培养3 d，用打孔器取直径1 cm的菌苔分别接种于新的PDA平板中央，在距离培养皿边缘2 cm处划线接种BMF04菌株，接种3次为3重复，以不接菌为对照，28 ℃培养3 d，测定抑菌带宽度。
抑菌带宽度（mm）=对照病原菌菌落半径（mm）−处理病原菌菌落半径（mm）[24]
1.2.1.2 无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌菌丝生长的抑制作用
将BMF04菌株接种到装有60 mL PD培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃，180 r/min振荡培养52 h。发酵液于4 ℃、8000 r/min离心15 min，将上清液用0.22 μm的微孔过滤器过滤得到无菌发酵液。采用打孔法测定无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌菌丝的抑制作用。在PDA平板中央接种直径5 mm的培养了3 d的小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌菌苔，在距病原菌15 mm处等距离用直径8 mm的打孔器打孔，每孔分别加入150 μL不同菌株的无菌发酵液，以等量PD培养基为对照，28 ℃恒温培养3 d，测量BMF04菌株无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌的抑菌圈直径，每个病原菌株3次重复[24]。
1.2.2 BMF04菌株对ZEN毒素去除作用的研究
1.2.2.1 定性测定
挑取BMF04菌株接种在浓度为4 µg/mL含ZEN毒素平板上，28 ℃培养3 d，观察BMF04菌株的生长情况，若BMF04菌株能生长，说明该菌株具有去除ZEN毒素作用。以不具有毒素去除作用的大肠杆菌（E. coli）为阴性对照，以具有解毒作用的B. amyloliquefaciens的GM-1-2菌株为阳性对照[25]。
1.2.2.2 定量测定
ZEN毒素标准曲线的制作：分别配制2、4、6、8、10、12、14、16 μg/mL ZEN毒素溶液，采用HPLC法测定不同浓度毒素溶液的色谱峰面积，每个浓度测定3次取平均值。HPLC检测ZEN毒素的条件：色谱仪为安捷伦高效液相色谱仪；色谱柱为安捷伦反相C18柱，孔径4 µm，长250 mm×宽4.6 mm；流动相为甲醇:水=80:20（V/V）；紫外检测波长为236 nm；柱温25 ℃；进样量20 µL；流速1 mL/min。以ZEN浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制ZEN标准曲线。
BMF04菌株对ZEN毒素的去除作用测定：挑取BMF04菌株接种于PDA培养基斜面，28 ℃培养18 h，用无菌DF培养基洗下菌体，并调节其菌悬液浓度为107 CFU/mL，菌悬液中加入浓度为1 mg/mL的ZEN毒素母液，使毒素的终浓度为4 μg/mL，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h，4 ℃、12000 r/min条件下离心15 min，上清液用孔径为0.45 µm细菌过滤器过滤，利用HPLC检测上清液中的峰面积，3次重复，以不加菌悬液的含等量毒素的DF培养基为对照（CK），将峰面积代入所建立的ZEN毒素标准曲线，计算溶液中毒素浓度和去除率，如去除率达到100%，再增加菌悬液中毒素含量[26]。
去除率（%）=（CK毒素浓度−样品中毒素浓度）/CK毒素浓度×100
1.2.3 BMF04菌株去除ZEN毒素的作用机理研究
1.2.3.1 BMF04菌株去除ZEN毒素方式研究
将活化18 h的BMF04菌株斜面用5 mL PD洗下制成菌悬液，倒入装有55 mL种子液培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振荡培养24 h，发酵液于4 ℃、8000 r/min离心15 min，分别收集发酵上清液和菌体沉淀。上清液过滤除菌得到无菌发酵液；将菌体沉淀用DF培养基洗涤3次，用等体积DF培养基重悬菌体得到活菌悬浮液，菌体密度为107 CFU/mL。无菌发酵液和活菌悬浮液121 ℃灭菌30 min，得到灭活无菌发酵液和灭活菌悬浮液；活菌悬浮液用超声细胞破碎仪处理，至菌体充分破碎，冰浴功率比20%，工作时间为3 s，间隙时间5 s，循环工作至活菌悬浮液呈透明状，4 ℃，8000 r/min，离心15 min，分别收集上清液和沉淀，上清液用0.45 µm滤膜过滤，滤液为胞内液；沉淀为细胞壁组分，用等量DF培养基重悬，得到细胞壁悬浮液。取BMF04菌株活菌悬浮液、灭活菌悬浮液、无菌发酵液、灭活无菌发酵液、胞内液和细胞壁悬浮液，分别加入ZEN 毒素母液，使ZEN毒素终浓度为15 μg/mL，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h，测定不同处理的峰面积，计算不同样品中ZEN毒素浓度和去除率[27]。
1.2.3.2 蛋白酶对BMF04菌株去除ZEN毒素作用的影响
BMF04菌株的无菌发酵液中，分别加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K，使酶的终浓度为1 mg/mL，用2 mol/L的HCl和NaOH溶液调节胰蛋白酶反应体系pH为7.6、胃蛋白酶为pH2.0、蛋白酶K为pH8.7，37 ℃水浴2 h，调回初始pH。取不同蛋白酶酶解后的样品，加入ZEN毒素母液，ZEN毒素终浓度为4 μg/mL，28 ℃静置12 h，采用HPLC的方法检测样品中ZEN毒素峰面积，计算不同蛋白酶处理的无菌发酵液对ZEN毒素的降解率。以未加蛋白酶的无菌发酵液为对照（CK1），未加无菌发酵液为空白对照（CK2），每种蛋白酶为1处理，每个处理3次重复[28-29]。
1.3 数据处理
实验中每个处理重复三次，使用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，差异显著性采用Duncan检验进行多重比较（P<0.05），利用Microsoft Excel进行图形绘制。
2. 结果与分析
2.1 BMF04菌株及无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌菌丝生长的抑制作用
BMF04菌株和无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌菌丝生长具有明显的抑制作用（图1）。BMF04菌株对两种病原菌的抑菌带宽度分别为（25.73±1.42）mm和（26.80±1.31）mm，无菌发酵液对两种病原菌的抑菌圈直径分别为（14.67±2.52）mm和（15.00±1.00）mm，表明该菌株与无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌都具有较强的抑制作用。
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图 1 BMF04菌株及无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌菌丝的抑制作用注：A和C为菌株及无菌发酵液对小麦赤霉病菌的抑制作用；B和D为菌株及无菌发酵液对小麦雪腐镰刀菌的抑制作用。Figure 1. Inhibitory effects of strain BMF04 and its aseptic fermentation broth on F. graminearum and F. nivale (Fr) Ces2.2 BMF04菌株对ZEN毒素去除作用的定性测定
BMF04菌株和阳性对照GM-1-2菌株在含ZEN毒素平板上生长良好（图2），阴性对照大肠杆菌（E. coli）不生长，说明BMF04菌株能够在以ZEN毒素为唯一碳源的DF培养基上生长，具有去除ZEN毒素的作用。
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图 2 不同菌株在含ZEN毒素平板上的生长状态注：大写字母A、B、C分别为BMF04菌株、大肠杆菌（E. coli）、GM-1-2菌株。Figure 2. The growth state of different strains on ZEN plate2.3 BMF04菌株对ZEN毒素降解的定量测定
2.3.1 ZEN毒素标准品的检测
由图3可知，ZEN标准品的出峰时间约为2.689 min，峰型清晰无拖尾，与其他的峰没有重合，能够清晰地测量出相应的峰面积。表明该检测方法可用于ZEN毒素的检测。
2.3.2 ZEN毒素标准曲线的建立
配制不同梯度浓度的ZEN毒素溶液，利用HPLC测定其毒素的峰面积，以ZEN毒素浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制ZEN标准曲线（图4）。结果表明，在0~16 µg/mL浓度范围内，峰面积随着ZEN毒素浓度的增加而逐渐增大，呈正相关，标准曲线方程为y=82.727x+1.2333，R2为0.9996，线性相关性较好。
2.3.3 BMF04菌株对ZEN毒素去除率的测定
HPLC检测ZEN毒素初始浓度为4、10和15 µg/mL的对照峰面积分别为（323.28±5.69）、（818.29±4.74）和（1234.68±24.83），加标回收率分别为97.25%±1.75%、98.80%±0.60%和99.40%±2.00%，与加入的ZEN标准品初始浓度拟合程度较高，说明仪器灵敏度好，检测结果准确。将BMF04菌株接种到ZEN毒素终浓度为4和10 µg/mL的DF培养液中，28 ℃培养48 h，HPLC检测ZEN毒素未出现吸收峰，说明该浓度下BMF04菌株能完全降解ZEN毒素，去除率为100%；当增加ZEN毒素浓度为15 µg/mL，检测到ZEN毒素峰面积为（12.96±0.14），ZEN毒素浓度为（0.14±0.01）µg/mL，去除率仍为98.95%±1.27%（表1）。说明BMF04菌株对ZEN毒素具有较强的去除能力。
表 1 BMF04菌株对不同浓度ZEN毒素的去除率Table 1. Removal rate of BMF04 strain to different concentration of ZENZEN初始浓度
（µg/mL）CK 处理 去除率（%） ZEN浓度（µg/mL） ZEN浓度（µg/mL） 4 3.89±0.07 0.00±0.00 100.00±0.00 10 9.88±0.06 0.00±0.00 100.00±0.00 15 14.91±0.30 0.14±0.01 98.95±1.27 2.4 BMF04菌株去除ZEN毒素的机理研究
2.4.1 BMF04菌株活菌悬液和灭活菌悬液对ZEN毒素的去除作用
BMF04菌株活菌悬液在含15 µg/mL ZEN毒素的培养基中培养48 h，HPLC检测峰面积为（14.29±0.77），浓度为（0.16±0.01）µg/mL，去除率为98.92%±0.07%；灭活菌悬液峰面积和毒素浓度分别（488.92±2.38）和（5.90±0.03）µg/mL（表2），去除率为60.32%±0.21%，比菌株活菌悬液的峰面积和毒素浓度明显下降，差异显著（P<0.05），说明去除ZEN毒素作用是活菌生长过程中产生了具有去除ZEN毒素作用的活性物质，高温处理后活性物质失活，导致去除率降低[30]，高温灭活后细胞壁依然存在，灭活后活菌的去除作用消失，细胞壁的吸附作用受温度影响较小，因而灭活后仍然具有一定的去除率，表明BMF04菌株对ZEN毒素的去除作用是菌株产生活性物质和细胞壁吸附的共同作用。
表 2 不同处理BMF04菌株ZEN毒素的峰面积和浓度Table 2. Peak area and concentration of ZEN by strain BMF04 with different treatments处理 ZEN浓度（µg/mL） 去除率（%） CK 14.86±0.08a 0.00±0.00d 活菌菌悬液 0.16±0.01d 98.92±0.07a 灭活菌悬液 5.90±0.03b 60.32±0.21b 细胞壁悬液 0.32±0.01c 97.85±0.07a 胞内液 0.22±0.02c 98.54±0.10a 无菌发酵液 0.19±0.03cd 98.70±0.19a 灭活的无菌发酵液 14.55±0.17a 2.09±1.15c 注：不同字母表示差异显著（P<0.05），表3同。 2.4.2 BMF04菌株无菌发酵液和灭活无菌发酵液对ZEN毒素的去除作用
无菌发酵液经121 ℃高温处理后与无菌发酵液对ZEN毒素的去除作用差异显著（P<0.05），明显降低（表2）。无菌发酵液与浓度为15 µg/mL 的ZEN毒素溶液混合培养48 h后，HPLC检测峰面积为（17.3±2.22），根据标准曲线计算ZEN毒素浓度仅为（0.19±0.03）µg/mL，去除率达98.70%±0.19%；发酵液高温处理后再与毒素溶液混合培养48 h，HPLC检测峰面积为（1204.75±36.29），ZEN毒素浓度为（14.55±0.44）µg/mL（表2），去除率仅为2.09%±1.15%，去除率显著下降（P<0.05）。说明BMF04菌株胞外物质对ZEN毒素具有去除作用，且高温处理影响其去除作用。
2.4.3 BMF04菌株细胞壁悬浮液和胞内液对ZEN毒素的去除作用
细胞壁悬浮液和胞内液在含15 µg/mL ZEN毒素的培养基中培养48 h，测定上清液中毒素含量，计算去除率。结果表明，经细胞壁悬浮液处理的样品峰面积分别为（27.91±0.98），ZEN毒素浓度为（0.32±0.01）µg/mL，去除率为97.85%±0.07%（表2），说明BMF04菌株对ZEN毒素的去除作用有细胞壁吸附的作用。经胞内液处理的样品峰面积为（19.12±1.06），ZEN毒素浓度为（0.22±0.02）µg/mL，去除率为98.54%±0.10%（表2），表明BMF04菌株对ZEN毒素的去除作用也有菌株产生的胞内活性物质的作用。
2.4.4 蛋白酶处理对无菌发酵液去除解ZEN毒素作用的影响
无菌发酵液经胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理后对ZEN毒素的去除作用明显降低，差异显著（P<0.05），反应体系中ZEN毒素浓度分别为（3.83±0.03）、（3.95±0.02）和（3.96±0.00）µg/mL（表3），对应的去除率分别为3.52%±0.77%、0.50%±0.39%和0.18%±0.12%，未处理无菌发酵液对照ZEN毒素峰面积为（45.44±2.37），浓度为（0.53±0.03）µg/mL，去除率为86.54%±0.72%（表3），3种酶处理后对毒素的去除作用与对照CK1差异显著（P<0.05），胃蛋白酶和蛋白酶K之间差异不显著，其中胃蛋白酶和蛋白酶K对BMF04菌株无菌发酵液去除ZEN毒素的影响强于胰蛋白酶。表明胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K能降低BMF04菌株无菌发酵液对ZEN毒素的去除作用，进一步说明BMF04菌株去除ZEN毒素的胞外活性物质为蛋白类物质。
表 3 不同蛋白酶处理BMF04菌株无菌发酵液后ZEN毒素的峰面积、浓度和去除率Table 3. Peak area and concentration of ZEN culture medium after different protease treatment of aseptic fermentation broth不同处理 ZEN浓度（µg/mL） 去除率（%） CK1 0.53±0.03c 86.54±0.72a CK2 3.97±0.02a 0.00±0.00c 胰蛋白酶 3.83±0.03b 3.52±0.77b 胃蛋白酶 3.95 ±0.02a 0.50±0.39c 蛋白酶K 3.96±0.00a 0.18±0.12c 3. 讨论与结论
不同解毒微生物菌株对ZEN毒素的降解作用和机理不同，Cho等[17]从土壤中分离出一株降解ZEN毒素的枯草芽孢杆菌（B. subtilis），对液体培养基和固体培养基中含1和0.25 mg/kg ZEN毒素的降解率分别为99%和95%；Yi等[31]从土壤中分离得到一株能降解ZEN毒素的地衣芽孢杆菌，在ZEN毒素浓度为2 mg/kg的LB培养基中对降解率为95.8%；谭辉[32]从牛瘤胃中分离纯化到假单胞属（Pseudomonas）菌株TH-N 1，在培养基中含2 µg/mL ZEN毒素时降解率为59%；Saumuel等[20]分离出一株假单胞菌（Pseudomonas sp.），在培养基中含0.2 μg/mL ZEN毒素时对其降解率为90%以上。不同降解毒素菌株中芽孢菌属降解ZEN毒素的能力较强[18,33]，张晨曦等[34]筛选获得一株解淀粉芽孢杆菌 NS2对5 μg/mL ZEN的降解率高达95.99%。BMF04菌株在ZEN毒素浓度为15 µg/mL时，去除率仍可达为98.95%，对ZEN毒素的去除作用明显高于已有菌株。
不同微生物菌株降解ZEN毒素的方式、活性物质种类不同。王国兵[35]和Xu等[36]研究发现解淀粉芽抱杆菌ZDS-1和香茅醇假单胞ASAG16对ZEN毒素的去除作用是降解作用，降解过程中，没有产生ZEN的类似物，不是简单的结合或吸收作用；耿海荣等[18]研究表明枯草芽孢杆菌（B. subtilis）Y-33的菌液对2和20 μg/mL ZEN毒素降解率分别为93.79%和82.40%，发酵上清液对ZEN毒素降解率为62.02%，说明该菌株降解ZEN毒素活性成分存在于发酵上清液中；谭辉[32]对菌株TH-N 1的降解机理研究发现活菌体细胞和细胞内含物对ZEN的降解率分别为59%和38%，无菌的上清液和灭活后的菌液对ZEN毒素无降解作用，说明其降解作用可能是由于细胞内的胞内酶的作用。唐彧等[37]研究认为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamate）406降解ZEN和AFB1活性成分存在于发酵上清液中，降解率分别为50%和58%，初步确定其降解活性物质为一种胞外酶，而不是基于细胞壁的吸附作用。本研究结果表明BMF04菌株对ZEN毒素的去除作用既有细胞壁吸附作用又有蛋白质的参与，但有关降解毒素的活性物质种类待于进一步研究。
BMF04菌株及无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌的菌丝生长均具有良好的抑制作用，通过细胞壁的吸附、胞内物质和胞外蛋白的降解对ZEN毒素具有较强的去除作用，去除效果明显高于已有菌株，该结果为菌株进一步用于去除污染粮食、饲料中的ZEN毒素提供了新的菌种资源和理论依据。
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图 1 BMF04菌株及无菌发酵液对小麦赤霉病菌和小麦雪腐镰刀菌菌丝的抑制作用
注：A和C为菌株及无菌发酵液对小麦赤霉病菌的抑制作用；B和D为菌株及无菌发酵液对小麦雪腐镰刀菌的抑制作用。
Figure 1. Inhibitory effects of strain BMF04 and its aseptic fermentation broth on F. graminearum and F. nivale (Fr) Ces
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图 2 不同菌株在含ZEN毒素平板上的生长状态
注：大写字母A、B、C分别为BMF04菌株、大肠杆菌（E. coli）、GM-1-2菌株。
Figure 2. The growth state of different strains on ZEN plate
表 1 BMF04菌株对不同浓度ZEN毒素的去除率
Table 1 Removal rate of BMF04 strain to different concentration of ZEN
ZEN初始浓度
（µg/mL）CK 处理 去除率（%） ZEN浓度（µg/mL） ZEN浓度（µg/mL） 4 3.89±0.07 0.00±0.00 100.00±0.00 10 9.88±0.06 0.00±0.00 100.00±0.00 15 14.91±0.30 0.14±0.01 98.95±1.27 
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表 2 不同处理BMF04菌株ZEN毒素的峰面积和浓度
Table 2 Peak area and concentration of ZEN by strain BMF04 with different treatments
处理 ZEN浓度（µg/mL） 去除率（%） CK 14.86±0.08a 0.00±0.00d 活菌菌悬液 0.16±0.01d 98.92±0.07a 灭活菌悬液 5.90±0.03b 60.32±0.21b 细胞壁悬液 0.32±0.01c 97.85±0.07a 胞内液 0.22±0.02c 98.54±0.10a 无菌发酵液 0.19±0.03cd 98.70±0.19a 灭活的无菌发酵液 14.55±0.17a 2.09±1.15c 注：不同字母表示差异显著（P<0.05），表3同。
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表 3 不同蛋白酶处理BMF04菌株无菌发酵液后ZEN毒素的峰面积、浓度和去除率
Table 3 Peak area and concentration of ZEN culture medium after different protease treatment of aseptic fermentation broth
不同处理 ZEN浓度（µg/mL） 去除率（%） CK1 0.53±0.03c 86.54±0.72a CK2 3.97±0.02a 0.00±0.00c 胰蛋白酶 3.83±0.03b 3.52±0.77b 胃蛋白酶 3.95 ±0.02a 0.50±0.39c 蛋白酶K 3.96±0.00a 0.18±0.12c
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[1] 裴世春, 李妍, 高建伟, 等. 采收期谷物中真菌毒素产毒菌的筛选鉴定[J]. 食品科学,2018,39(10):312−317. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201810047 [2] 周红姿, 周方园, 赵晓燕. 小麦赤霉病生防菌的筛选及其田间防效研究[J]. 中国农业科技导报,2020,22(1):67−77. [3] 史建荣, 刘馨, 仇剑波. 小麦中镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染现状与防控研究进展[J]. 中国农业科学,2014,47(18):3641−3654. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.18.012 [4] 刘盼, 蔡俊, 廖兆民, 等. 降解玉米赤霉烯酮菌株的鉴定及其发酵条件优化[J]. 食品工业科技,2018,39(21):119−123. [5] 雷元培, 周建川, 王利通, 等. 2018年中国饲料原料及配合饲料中霉菌毒素污染调查报告[J]. 饲料工业,2020,41(10):60−64. [6] 陈心仪. 2009-2010年中国部分省市饲料原料及配合饲料的霉菌毒素污染概况[J]. 浙江畜牧兽医,2011,36(2):7−10. doi: 10.3969/j.issn.1005-7307.2011.02.005 [7] 周建川, 雷元培, 王利通, 等. 2017年中国饲料原料及配合饲料中霉菌毒素污染调查报告[J]. 饲料工业,2018,39(11):52−56. [8] 李安平, 朱连勤, 陈甫, 等. 2017年山东地区鸡饲料及原料中AFB-1、DON和ZEN污染情况调查[J]. 中国家禽,2018,40(10):69−72. [9] 宋丹, 李蕴玉, 杨彩然, 等. 河北省蛋鸡配合饲料及原料中霉菌毒素的污染情况[J]. 中国家禽,2019,41(10):78−80. [10] Volko A, Karlovsky P. Biological detoxification of fungal toxins and its use in plant breeding, feed and food production[J]. Natural Toxins,1998(7):1−23.
[11] 孙玲玉. 枯草芽孢杆菌泰山株的分离鉴定及其对黄曲霉毒素的降解作用研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2014. [12] Yunus A W, Razzazi-fazeli E, Bohm J. Aflatoxin B1 in affecting broiler’s performance, immunity, and gastrointestinal tract: A review of history and contemporary issues[J]. Toxins,2011,3(6):566−590. doi: 10.3390/toxins3060566
[13] 张俊楠, 王金全, 杨凡, 等. 饲料霉菌毒素生物降解研究进展[J]. 饲料工业,2019,40(21):51−58. [14] Mannon J, Johnaon E. Fungi down on the farm[J]. New Scientist,1985,105:12−16.
[15] Kriszt R, Krifaton C, Szoboszlay S, et al. A new zearalenone biodegradation strategy using non-pathogenic Rhodococcus pyridinivorans K408 strain[J]. Plos One,2012,7(9):e43608. doi: 10.1371/journal.pone.0043608
[16] 龙淼, 何润霞, 刘义, 等. 玉米赤霉烯酮降解菌的分离与鉴定[J]. 畜牧与兽医,2015,47(8):34−38. [17] Cho K J, Kang J S, Cho W T, et al. In vitro degradation of zearalenone by Bacillus subtilis[J]. Biotechnology Letters,2010,32(12):1921−1924. doi: 10.1007/s10529-010-0373-y
[18] 耿海荣, 张晨曦, 赵月菊, 等. 一株高效降解玉米赤霉烯酮的耐酸耐高温枯草芽孢杆菌的研究[J]. 核农学报,2019,33(7):1399−1407. doi: 10.11869/j.issn.100-8551.2019.07.1399 [19] Harkai P, Szabṓ I, Cserhati M, et al. Biodegradation of aflatoxin B1 and zearalenone by Streptomyces sp. collection[J]. International Biodeterioration & Biodegradation,2016,108:48−56.
[20] Saumuel M S, Sivaramakrishna A, Mehta A. Degradation and detoxification of aflatoxin B1 by Pseudomonas putida[J]. International Biodeterioration& Biodegradation,2014,86:202−209.
[21] 董曼佳, 杨其亚, 孙伟, 等. 拮抗酵母菌控制玉米赤霉烯酮的研究进展[J]. 食品科学,2016,37(1):230−234. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201601040 [22] Bakutis B, Baliukoniene V, Paṥkevicius A. Use of biological method for detoxification of mycotoxins[J]. Botanica Lithuanica,2005,7:123−129.
[23] 王亚楠, 陈莹莹, 吴玉洪, 等. 甲基营养型芽孢杆菌对黄瓜促生作用及其机理研究[J]. 北方园艺,2020(12):1−7. [24] 李欢, 曹雪梅, 陈茹, 等. 高效拮抗链孢霉和绿色木霉海洋细菌的筛选及鉴定[J]. 南方农业学报,2019,50(7):1519−1526. doi: 10.3969/j.issn.2095-1191.2019.07.16 [25] 胡晓丹, 王建伟, 李孝敬. 赤霉病菌拮抗菌Bacillus subtilis AF0907抗菌物质研究[J]. 中国生物防治学报,2015,31(3):378−385. [26] 潘丽婷. 玉米赤霉烯酮降解菌的分离鉴定、降解特性及机理研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2018. [27] 何润霞. 玉米赤霉烯酮降解菌的筛选鉴定及降解特性研究[D]. 沈阳: 沈阳农业大学, 2016. [28] 张倩. 玉米赤霉烯酮脱毒菌株的筛选及Fosmid文库构建[D]. 华南理工大学, 2016. [29] 张倩, 熊犍, 赵晨, 等. 玉米赤霉烯酮脱毒菌株的筛选及脱毒机理初探[J]. 粮油食品科技,2016,24(6):76−81. doi: 10.3969/j.issn.1007-7561.2016.06.017 [30] 骆翼. 玉米赤霉烯酮的微生物脱毒研究[D]. 上海: 上海交通大学, 2014. [31] Yi P J, Pai C K, Liu J R. Isolation and characterization of a Bacillus licheniformis strain capable of degrading zearalenone[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2011,27:1035−1043. doi: 10.1007/s11274-010-0548-7
[32] 谭辉. 牛瘤胃液中玉米赤霉烯酮降解菌的分离、鉴定及降解特性研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2014. [33] 雷元培. ANSB01G菌对玉米赤霉烯酮的降解机制及其动物试验效果研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2014. [34] 张晨曦, Yawa M E F, 赵月菊, 等. 解淀粉芽孢杆菌 NS2 降解玉米赤霉烯酮的研究[J]. 核农学报,2020,34(7):1507−1517. doi: 10.11869/j.issn.100-8551.2020.07.1507 [35] 王国兵. 一株高效降解玉米赤霉烯酮细菌的研究[D]. 北京: 北京化工大学, 2015. [36] Xu J H, Wang H, Zhu Z, et al. Isolation and characterization of Bacillus amyloliquefaciens ZDS-1: Exploring the degradation of zearalenone by Bacillus spp.[J]. Food Control,2016,68:244−250. doi: 10.1016/j.foodcont.2016.03.030
[37] 唐彧, 张琼琼, 郭永鹏, 等. 一株同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的谷氨酸棒状杆菌及其降解特性研究[J]. 饲料工业,2019,40(20):34−39. -
期刊类型引用(22)
1. 熊波，杨丽涓，尹涛，普娅丽. QuEChERS净化-气相色谱-串联质谱法测定玫瑰花中24种农药残留. 食品安全导刊. 2025(02): 56-60 . 
百度学术
2. 邓涵玉，鲁莎莎，陈非凡，毛涛，邓祥宜，李继伟. 白萝卜精酿啤酒酿造工艺优化及品质分析. 中国酿造. 2025(02): 231-238 . 百度学术
3. 和丽媛. 蓝莓-玫瑰复合饮料的研制. 轻工科技. 2024(01): 1-3+32 . 百度学术
4. 丁献华，周红琴，马雪玲. 芳香植物缓解大学生焦虑情绪的比较研究. 现代园艺. 2024(06): 13-15 . 百度学术
5. 刘晓雨，李雪松，单艳琴，张博雅，李景明. PDMS膜渗透浓缩对天然玫瑰冻干露香气的影响. 食品科学. 2024(05): 158-165 . 百度学术
6. 欧阳雪灵，江新凤，刘书玲，王国行，彭玉辅，彭勇，彭火辉，陈紫梅，杨雪珍. 基于顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法和相对气味活性值分析不同发酵时间玫瑰花茶香气的差异. 食品安全质量检测学报. 2024(10): 243-250 . 百度学术
7. 和丽媛，李安佳，玉叫勐，钱星蓉. 藜麦玫瑰面包研制. 粮食科技与经济. 2024(02): 109-112 . 百度学术
8. 高飞，尹思雨，皮汨源，朱月星. 大马士革玫瑰纯露发酵液制备工艺及功效评价. 广东化工. 2024(16): 49-51+27 . 百度学术
9. 李芬，夏瑞萍，王智慧，王玮，李梅. 不同花源窨制红茶研究进展. 蚕桑茶叶通讯. 2024(05): 17-19 . 百度学术
10. 丁献华，段丽君，乔晓丽，万丽，肖敏. 芳香植物玫瑰缓解高职学生焦虑情绪的研究. 现代园艺. 2023(03): 175-177+180 . 百度学术
11. 赵珊，杨飞洋，秦琳，李曦，黄世群，郑幸果，雷欣宇，仲伶俐. 代用茶茶汤中功能性成分组成及含量分析. 食品研究与开发. 2023(02): 162-168 . 百度学术
12. 代丽凤，蒋洁琳，官兴丽，邹小林，杨智，符宗林，罗赛. 普洱茶玫瑰花葡萄籽复合饮料的研制及其抗氧化活性评价. 茶叶学报. 2023(02): 1-13 . 百度学术
13. 和丽媛，杨志龙，樊丹敏. 黑松露玫瑰酥性饼干的研制. 现代食品. 2022(02): 81-84 . 百度学术
14. 黄一承，史玉，马艳丽，丁云峰，马琳，李丹，李晓磊. 玫瑰、百合煎饼风味成分比较研究. 食品工业科技. 2022(05): 302-309 . 本站查看
15. 姜苗，黄晓琴，伊冉，曹美琪，丁凯华，代智慧，刘红，焦春梅，扈兴强，王庆卫，石磊. 玫瑰花红茶抗氧化性研究. 山东林业科技. 2022(05): 39-47 . 百度学术
16. 姜苗，黄晓琴，伊冉，曹美琪. 不同加工工艺对玫瑰花红茶品质的影响. 中国茶叶. 2022(12): 34-40 . 百度学术
17. 杨丽，柯南，龚秋霞，刘雯雯，魏琴. 响应面法优化玫瑰风味酸奶工艺. 宜宾学院学报. 2022(12): 56-61+84 . 百度学术
18. 郭香香，胥鑫萌，张恺欣，宋锦博，刘军海. 几种植物提取物在抗衰老化妆品中的应用. 中国洗涤用品工业. 2021(04): 94-97 . 百度学术
19. 孙瑶，朱雅婧，李武，赵付安. 玫瑰花冠茶总黄酮提取的工艺优化. 农产品加工. 2021(14): 31-34 . 百度学术
20. 丁强，董纪超，荚启安，吴泽宇，张文成. 响应面法优化固定超声辅助提取玫瑰花黄酮的工艺. 安徽化工. 2021(05): 37-40 . 百度学术
21. 青舒婷，杨丰，张海仑，李宇龙，许军，岳进. 远红外辅助热泵干燥食用玫瑰花瓣及产品品质分析. 食品工业科技. 2021(22): 246-253 . 本站查看
22. 熊海燕，林敏，鲁萌. 蟠桃玫瑰米露酒加工工艺研究. 食品安全导刊. 2021(31): 114-116 . 百度学术
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