Analysis on Secondary Metabolites Difference of Guiding Yunwu Tea between Native and Introduced Varieties
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摘要: 为了研究贵定云雾茶本地种和引进种次生代谢产物差异，基于超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF-MS）对贵定云雾茶本地种和引进种的次生代谢产物进行了定性、定量分析。结果鉴定出361种代谢物。采用主成分分析（principal component analysis, PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal least squares discriminant analysis, OPLS-DA）筛选出14种显著差异代谢物，包括4种黄酮醇类物质、4种酚酸类物质、3种黄酮糖苷类物质、2种儿茶素和1种原花青素B1。通路富集分析显示这些差异代谢物主要分布于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢途径（phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis）、黄酮和黄酮醇代谢途径（flavone and flavonol biosynthesis）以及类黄酮代谢途径中（flavonoid biosynthesis）。此外，儿茶素和原花青素B1在云雾茶本地种中含量较高，而黄酮醇和黄酮糖苷类物质在引进种中含量较高，这表明云雾茶本地种更适合绿茶的加工，而引进种更适合白茶的加工。
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关键词:
- 贵定云雾茶 /
- 超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS） /
- 代谢差异 /
- 茶叶加工
Abstract: In order to study the secondary metabolites difference of Guiding Yunwu tea between introduced and native varieties, ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS) was used to qualitative and quantitative analyze the secondary metabolites between native and introduced varieties of Guiding Yunwu tea. A total of 361 metabolites were identified. Furthermore, 14 significantly different metabolites were obtained by principal component analysis (PCA) and orthogonal least squares discrimination analysis (OPLS-DA) methods, including four flavonols, four phenolic acids, three flavonoid glycosides, two catechins and one procyanidin. Pathway enrichment analysis showed that these differential metabolites were mainly distributed in phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis, flavone and flavonol biosynthesis, and flavonoid biosynthesis pathways. In addition, the content of catechins and procyanidin B1 was higher in the native samples, while the content of flavonols and flavone glycosides were higher in the introduced samples. The results indicated that the native variety would be more suitable for green tea processing, and the introduced variety would be more suitable for white tea processing. -
茶（Camellia sinensis（L.）O. Ktze）是世界上仅次于水的第二受欢迎的饮料，茶树作为一种重要的经济作物，已在50多个国家和地区被广泛种植[1]。茶的质量主要通过香气、风味和外观等感官特性来评估，受多种因素的影响，包括遗传背景、生长环境、收获季节、叶片分选、加工和贮藏等[2]。此外，茶中含有大量可溶性物质，例如儿茶素、咖啡因、茶氨酸、多酚、有机酸和维生素等，这些物质含量的多少直接影响茶叶的质量[3]。根据加工方式的不同，茶叶可分为绿茶、白茶、红茶、黑茶、黄茶和乌龙茶等不同类型[4]。已有报道表明，不同类型茶叶之间代谢物含量差异较大[5]。基于此，研究不同茶树品种叶片中代谢物含量的差异就显得尤为重要。
代谢组学是系统生物学的一种研究方法，它能够对生物样本中所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析，并鉴定出具有重要生物学意义的组间显著差异代谢物，阐明这些差异物的生理过程和代谢机制[6]。目前，代谢组学技术已被广泛运用到茶产业的各个环节，更加全面地了解茶叶从栽培到加工过程中内含物质的变化规律，揭示茶叶风味形成的原因，从而提高茶叶品质和健全茶叶安全性保障[7-9]。
贵定云雾茶是世界名茶，已多次获得国际大奖[10]。云雾野生茶树主要分布在贵定县南面云雾镇的云雾山中，海拔高度1300多米。茶树叶色鲜绿，叶芽壮实肥大，形状秀丽，茸毛较多，内部含有物质丰富，是优良的育种原料[11]。近些年来，随着市场需求的变化，云雾茶也引进了小叶种，这就导致云雾茶在生产过程中出现加工混乱、品质差参不齐等现象。鉴于此，本文利用代谢组学研究贵定云雾茶本地种和引进种之间的代谢差异，结果可为云雾茶的加工工艺改良、滋味品质提升和功能性成分富集等方面提供依据。
1. 材料和方法
1.1 材料与仪器
贵定云雾茶本地种（中叶种，宽椭圆形叶片，小乔木）、云雾茶引进种（小叶种，窄椭圆形叶片，灌木） 茶树样品于2020年4月采自贵定县云雾镇茶场（26°34'48" N, 107°13'52" E），每个品种随机挑选9株茶树并采集新鲜叶片样品，共18个样品；乙腈、氨水、甲醇、醋酸铵 色谱纯，德国Merck公司。
BSA124S-CW型天平 德国赛多利斯科学仪器有限公司；D24 UV纯水仪 德国Merck Millipore公司；JXFSTPRP-24型研磨仪 上海净信科技有限公司；Agilent 1290超高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；TripleTOF 4600型四极杆串联飞行时间高分辨质谱仪 美国AB SCIEX公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
将茶树叶片置于研钵中加入液氮捣碎，接着用料理机打成粗粉，然后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，最后用组织研磨机研磨成细粉。每个茶树称取研磨后的粉末状叶片样品50 mg左右，加入500 μL甲醇（含5 μg/mL L-2-氯-苯丙氨酸作为内标），匀浆破碎2 min。超声功率为250 W，60 ℃下提取15 min。4 ℃，13000 r/min离心15 min，取200 μL上清进样。每个茶树品种设置9个平行样品。此外，取等量的18份待测样品进行混合，作为质控样品。
1.2.2 色谱条件
色谱柱为XSelect ® HSS T3（2.5 µm, 100 mm×2.1 mm）。流动相A：水溶液（0.1%甲酸），流动相B：乙腈溶液（0.1%甲酸）。流速：0.35 mL/min，柱温：25 ℃，进样量：2.0 µL。优化的色谱梯度为：0~2 min，5%B；2~10 min，5%~95%B；10~15 min，95%B；15~18 min，95%~5%B。
1.2.3 质谱条件
质谱以正、负离子两种模式运行。优化的参数如下：毛细管电压：正离子模式为4 kV，负离子模式为3.5 kV；扫描范围70~1000 m/z；扫描速率7 Hz；毛细管温度320 ℃；鞘气流速45 PSI；辅助气流速15 PSI。
1.3 数据处理
本研究利用XCMS软件和METLIN数据库对代谢物进行定性分析，首先将原始数据通过安捷伦Masshunter Qualitative Analysis分析软件转换为通用格式（mz.data）。然后基于R语言XCMS程序对数据进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化处理，得到一个数据矩阵。接着将矩阵导入到SIMCA-P软件用于代谢物的定量分析和后续的主成分分析（principal component analysis, PCA）以及正交偏最小二乘判别分析（orthogonal least squares discriminant analysis, OPLS-DA），以检测代谢差异物[12]。应用MetaboAnalyst软件和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库进行代谢通路分析[13]。最后根据差异代谢物含量的不同利用MeV 4.9软件进行热图分析[14]。
2. 结果与分析
2.1 UPLC-QTOF-MS鉴定结果
本研究基于UPLC-QTOF-MS技术分析了贵定云雾茶本地种和引进种的代谢差异，结果同时与一级m/z和碎片离子（二级）m/z数据库匹配到的代谢物正离子模式下为147个（本地种147个，引进种144个），负离子模式下为361个（本地种和引进种各361个）。鉴于在负离子模式下可以检测到更多的峰，并且在后续的多元统计分析中负离子模式下的模型参数更可靠和更具有预测性，所以本文的后续数据分析都采用负离子模式下采集到的数据。图1即为本地种和引进种样品在质谱ESI-条件模式下扫描的基峰图。从图1中可以看出本地种样品在0.3~0.96 min、2.45~4.08 min和7.94~10.95 min时物质相对丰度较高，而引进种样品在0.3~0.91 min、2.53~4.34 min和7.95~10.93 min时物质相对丰度较高，这表明不同品种茶树样品在负离子模式下的出峰数量和相对丰度存在一定的差异。
2.2 多元统计分析
将负离子模式下收集到的数据进行PCA和OPLS-DA分析，结果表明本地种和引进种样品呈现出明显的分离趋势（图2）。在PCA得分图中，主成分1和2的贡献值分别为61.4%和23.8%，样品累计贡献值超过85%，说明代表性较好。另外，主成分分析也可以反映物质丰度的分布情况，越相似的样品距离越近，反之则越远。主成分分析中，本地种样品主要分布在主成分1的负轴位置，而引进种样品主要分布在主成分1的正轴位置，并且不同品种间的样本距离较远，这表明云雾茶本地种和引进种代谢物差异较大。OPLS-DA得分图中，各品种的样本划分明确，没有分散，模型验证后参数值R2X为88.5%，R2Y为92.4%，Q2为87.1%，值均接近1，说明负离子模型下具有较好的预测性和可靠性。
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图 2 主成分分析和正交偏最小二乘判别分析Figure 2. Principal component analysis and orthogonal least squares discriminant analysis2.3 差异代谢物和代谢通路分析
OPLS-DA载荷图可以直观地显示不同品种样本间的差异代谢物，其中的各点代表不同的代谢物，距离坐标原点越远越分散的为显著差异代谢物。本研究对鉴定到的361个代谢物进行差异性筛选，标准为VIP≥1、P<0.05和FC≥2或FC≤−2。其中FC（fold change）代表样本间代谢物的差异倍数，即代谢物在本地种和引进种中含量的比值。结果共筛选到14个显著差异代谢物，OPLS-DA载荷图见图3，其中包括4种黄酮醇类物质（1~4号）、4种酚酸类物质（5~8号）、3种黄酮糖苷类物质（9~11号）、2种儿茶素（12~13号）和1种原花青素B1（14号）（表1），均为茶树常见的次生代谢产物，其中儿茶素是茶汤苦味的主要来源，黄酮醇和黄酮糖苷类物质对于涩味贡献较大，这些物质含量的多少直接决定茶叶的品质。
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图 3 正交偏最小二乘判别分析载荷图注：代谢物编号对应表1。Figure 3. Loading plot of orthogonal least squares discriminant analysis表 1 不同云雾茶树品种的差异代谢物Table 1. Differencial metabolites between two varieties编号 代谢物 名称 分子式 保留时间（min） 质荷比（m/z） VIP值 倍数值log2（FC） 1 Myriletin 杨梅素 C15H10O8 3.47 319.04439 6.25 3.61 2 Dihydroquercetin 二氢槲皮素 C15H12O7 3.59 303.05066 1.85 1.29 3 Quercetin 槲皮素 C15H10O7 4.15 301.04953 9.47 4.27 4 Kaempferol 山奈酚 C15H10O6 4.27 287.05467 3.81 8.36 5 Quinic acid 奎尼酸 C7H12O6 0.46 191.05578 21.92 −1.91 6 Phenylpyruvic acid 苯丙酮酸 C9H8O3 0.95 163.03995 2.26 −4.24 7 Caffeoyl quinic acid 咖啡酰奎宁酸 C16H18O9 2.67 353.08747 2.01 2.07 8 Hydroxybenzoic acid 羟基苯甲酸 C7H6O3 3.33 137.02380 1.36 1.98 9 Quercetin-3-O-hexosyl（1-2）
deoxyhexosyl-7-O-hexoside槲皮素-己糖苷 C41H70O13 3.41 771.19808 12.44 5.63 10 Kaempferol-3-Rhamnoside-7-Rhamnoside 山奈酚-鼠李糖苷 C27H30O14 3.50 755.20307 10.39 2.06 11 Kaempferol-3-Galactoside-6-
Rhamnoside-3-Rhamnoside山奈酚-半乳糖苷-鼠李糖苷 C33H40O19 3.61 739.20836 5.53 −8.03 12 Epigallocatechin 表没食子儿茶素 C15H14O7 10.72 305.06639 1.87 1.91 13 Epicatechin 表儿茶素 C15H14O6 3.32 289.07144 25.45 2.41 14 Procyanidin B1 原花青素B1 C30H26O12 3.18 577.13455 3.14 −1.68 注：表中log2（FC）表示对代谢物在本地种和引进种中含量的倍数值求log2的对数。 根据14种差异代谢物的相对丰度进行了热图分析（图4）。结果显示儿茶素和原花青素B1在云雾茶本地种中含量较高，而黄酮醇和黄酮糖苷类物质在引进种中含量较高。
另外，利用KEGG数据库对14个差异代谢物进行代谢通路分析（图5，图6）。结果显示这些差异代谢物主要集中分布于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢途径（phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis）、类黄酮代谢途径（flavnoid biosynthesis）以及黄酮和黄酮醇代谢途径中（flavone and flavonol biosynthesis）。它们属于茶叶代谢的主要途径，直接影响着决定茶叶品质关键物质的积累。首先，4种酚酸类差异代谢物集中在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢途径中（图5），这些物质含量的变化关系到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的积累，间接影响茶叶的鲜味。其余10种差异代谢物分布于类黄酮代谢途径以及黄酮和黄酮醇代谢途径中（图6），这两个途径是类黄酮化合物合成的关键途径。类黄酮化合物主要包括黄酮醇、黄酮、儿茶素（黄烷-3-醇）、花青素和原花青素等，在茶树中其含量约占鲜叶干重的30%，远高于其它物种[15]。在茶叶加工过程中，这些化合物含量的差异是制作不同茶类的依据。如Gai等[16]利用代谢组学技术研究不同茶树品种代谢差异时发现QN3品种类黄酮生物合成途径比较活跃，特别是儿茶素组分的含量明显高于其它品种，基于此认为QN3品种是绿茶加工的良好原料。Li等[17]分析了适合绿茶和黑茶加工的不同茶树品种的代谢特点，其中氨基酸和类黄酮类物质差异较大，研究结果为不同茶树品种的加工提供参考依据。此外，Zeng等[18]研究不同时期白茶叶片代谢组学时检测到很多差异代谢物都分布在黄酮和黄酮醇代谢途径中，尤其在叶片复绿期间黄酮醇和黄酮糖苷类物质含量增加显著。同样，已有报道表明较高含量的黄酮醇和黄酮糖苷类物质是白茶区别与其它类型茶叶的标志[15]。
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图 5 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢途径注：加粗的为差异代谢物，柱状图代表物质相对丰度；图6同。Figure 5. Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis![]()
图 6 黄酮和黄酮醇代谢途径以及类黄酮代谢途径Figure 6. Flavone and flavonol biosynthesis, and flavnoid biosynthesis云雾茶本地种生长在贵定云雾山中，这里海拔高，昼夜温差大，雨量充沛，云雾多，湿度较大。这些生态条件有利于含氮化合物和芳香类物质的积累，而涩味较重的黄酮醇和黄酮糖苷类物质含量则较低[19]。另外，茶叶中儿茶素、原花青素B1、黄酮醇和黄酮糖苷类物质在代谢途径中存在共同前体（图6），黄酮醇和黄酮糖苷组分合成的减少会相对的增加儿茶素和原花青素B1的积累。这些物质含量的差异对于茶叶加工至关重要。已有研究表明白茶与绿茶之间代谢物含量分布存在较大差异，儿茶素组分含量白茶低于绿茶，而黄酮醇和黄酮糖苷类则相反[20]。这是因为绿茶加工过程中高温杀青作用使多酚氧化酶等酶类活性钝化后儿茶素得以保留[21-22]，同时高温作用也会引起黄酮醇或黄酮糖苷类物质分解而导致含量降低[23-24]；而白茶全程萎凋的工艺特点使得叶片物理结构保持完整，酶活性未受破坏导致儿茶素组分较大程度降低，非酯型儿茶素尤为明显，但是没有高温作用黄酮醇或黄酮糖苷类物质在白茶中得以保留[15,25]。花青素组分与儿茶素组分规律类似，大部分花青素组分在白茶中明显低于绿茶，因为花青素萎凋过程中含量会降低[26]。在本研究中，原花青素B1和2种非酯型儿茶素在云雾茶本地种中要高于引进种，而3种黄酮醇和4种黄酮糖苷物质在引进种中要高于本地种。鉴于此得出，云雾茶本地种更适合绿茶的加工，而引进种更适合白茶的加工。
3. 结论
本文利用UPLC-QTOF-MS技术并结合多元统计方法分析了贵定云雾茶本地种和引进种之间的代谢差异，结果由于正离子模型参数不可靠且没有预测性，只在负离子模型下鉴定出14个显著差异代谢物。这些差异代谢物主要分布于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢途径、类黄酮代谢途径以及黄酮和黄酮醇代谢途径中。另外，不同茶树品种中差异代谢物含量变化分析表明云雾茶本地种更适合绿茶的加工，而引进种更适合白茶的加工，但这些差异代谢物含量变化的具体生理过程和机制还有待后续深入的研究。综上所述，本研究结果可为云雾茶的加工方法和良种选育提供理论依据。
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图 2 主成分分析和正交偏最小二乘判别分析
Figure 2. Principal component analysis and orthogonal least squares discriminant analysis
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图 3 正交偏最小二乘判别分析载荷图
注：代谢物编号对应表1。
Figure 3. Loading plot of orthogonal least squares discriminant analysis
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图 5 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢途径
注：加粗的为差异代谢物，柱状图代表物质相对丰度；图6同。
Figure 5. Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis
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图 6 黄酮和黄酮醇代谢途径以及类黄酮代谢途径
Figure 6. Flavone and flavonol biosynthesis, and flavnoid biosynthesis
表 1 不同云雾茶树品种的差异代谢物
Table 1 Differencial metabolites between two varieties
编号 代谢物 名称 分子式 保留时间（min） 质荷比（m/z） VIP值 倍数值log2（FC） 1 Myriletin 杨梅素 C15H10O8 3.47 319.04439 6.25 3.61 2 Dihydroquercetin 二氢槲皮素 C15H12O7 3.59 303.05066 1.85 1.29 3 Quercetin 槲皮素 C15H10O7 4.15 301.04953 9.47 4.27 4 Kaempferol 山奈酚 C15H10O6 4.27 287.05467 3.81 8.36 5 Quinic acid 奎尼酸 C7H12O6 0.46 191.05578 21.92 −1.91 6 Phenylpyruvic acid 苯丙酮酸 C9H8O3 0.95 163.03995 2.26 −4.24 7 Caffeoyl quinic acid 咖啡酰奎宁酸 C16H18O9 2.67 353.08747 2.01 2.07 8 Hydroxybenzoic acid 羟基苯甲酸 C7H6O3 3.33 137.02380 1.36 1.98 9 Quercetin-3-O-hexosyl（1-2）
deoxyhexosyl-7-O-hexoside槲皮素-己糖苷 C41H70O13 3.41 771.19808 12.44 5.63 10 Kaempferol-3-Rhamnoside-7-Rhamnoside 山奈酚-鼠李糖苷 C27H30O14 3.50 755.20307 10.39 2.06 11 Kaempferol-3-Galactoside-6-
Rhamnoside-3-Rhamnoside山奈酚-半乳糖苷-鼠李糖苷 C33H40O19 3.61 739.20836 5.53 −8.03 12 Epigallocatechin 表没食子儿茶素 C15H14O7 10.72 305.06639 1.87 1.91 13 Epicatechin 表儿茶素 C15H14O6 3.32 289.07144 25.45 2.41 14 Procyanidin B1 原花青素B1 C30H26O12 3.18 577.13455 3.14 −1.68 注：表中log2（FC）表示对代谢物在本地种和引进种中含量的倍数值求log2的对数。 
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