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中国精品科技期刊2020

高通量测序分析不同采集保存温度下甘南牧区牦牛酸奶真菌多样性

张文齐, 麻和平, 刘彩云, 王洁, 彭章普, 邵建宁

张文齐,麻和平,刘彩云,等. 高通量测序分析不同采集保存温度下甘南牧区牦牛酸奶真菌多样性[J]. 食品工业科技,2021,42(13):163−169. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020110233.
引用本文: 张文齐,麻和平,刘彩云,等. 高通量测序分析不同采集保存温度下甘南牧区牦牛酸奶真菌多样性[J]. 食品工业科技,2021,42(13):163−169. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020110233.
ZHANG Wenqi, MA Heping, LIU Caiyun, et al. Analysis of Fungal Diversity of Yak Yogurt Collected and Preserved at Different Temperatures in Gannan Pastoral Area Based on High-throughput Sequencing[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(13): 163−169. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020110233.
Citation: ZHANG Wenqi, MA Heping, LIU Caiyun, et al. Analysis of Fungal Diversity of Yak Yogurt Collected and Preserved at Different Temperatures in Gannan Pastoral Area Based on High-throughput Sequencing[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(13): 163−169. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020110233.

高通量测序分析不同采集保存温度下甘南牧区牦牛酸奶真菌多样性

基金项目: 兰州市科技计划项目(2018-1-91);甘肃省科学院应用研究与开发项目(2017JK-10)
详细信息
    作者简介:

    张文齐(1981−),男,本科,副研究员,研究方向:食品微生物,E-mail:aeac@163.com

    通讯作者:

    邵建宁(1971−),男,本科,正高级工程师,研究方向:应用微生物,E-mail:69655493@qq.com

  • 中图分类号: Q939.97

Analysis of Fungal Diversity of Yak Yogurt Collected and Preserved at Different Temperatures in Gannan Pastoral Area Based on High-throughput Sequencing

  • 摘要: 采用Illumina NovaSeq 高通量测序技术,对4种不同采集保存温度条件下采集自甘南牧区牦牛酸奶扩增真菌ITS2区序列进行测序,进行OTU聚类、Alpha多样性和Beta多样性等分析,比较不同采集保存温度下样品的真菌群落结构和多样性。结果表明,甘肃甘南牧区牦牛酸奶真菌主要为子囊菌门(Ascomycota),其丰度占总数的82.09%~99.25%;真菌菌属中酵母菌属(Saccharomyces)丰度占总数23.98%~63.49%,克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)丰度占总数16.08%~31.89%,毕赤酵母属(Pichia)丰度占总数3.39%~35.21%,为样品中的优势菌属。4种不同采集保存温度条件下采集甘南牧区牦牛酸奶样品真菌多样性分析比较后无显著差异,各分类水平下,不同组别菌群组成基本相同,各菌群在不同组别中只是占比不同。各分类水平真菌群落组成基本相同,仅组成比例不同。
    Abstract: Illumina NovaSeq high-throughput sequencing technology was used to sequence the fungi gene ITS2 regions of yak yogurt samples in the Gannan pastoral area, OTU clustering, alpha diversity, and beta diversity were analyzed. Through analyzing and comparing the fungal composition and diversity of yak yogurt collected at different preservation temperatures in the Gannan pastoral area, the results showed that the main fungal in yak yogurt in Gannan pastoral area was Ascomycota at the phylum level, the abundance value was 82.09%~99.25%; at the genus level, among which Saccharomyces was the dominant with the abundance value was 23.98%~63.49%, followed by Kluyveromyces with the abundance value 16.08%~31.89%, Pichia with the abundance value 3.39%~35.21%. There was no significant difference in fungal diversity among yak yogurt samples which were collected at four different preservation temperatures in the Gannan pastoral area, the fungal community composition of the sampling groups was similar at all levels of classification, with only some differences in composition ratio.
  • 传统发酵乳制品制备多采用自然发酵,原料的不同、独特的制备方法和环境气温的差异等造就了传统发酵乳制品微生物群落的丰富性和多样性[1-3]。近年来,有关传统发酵乳制品微生物多样性研究,既有传统的分离培养研究,也有高通量测序、宏基因组学分析等非培养研究[4-5]。利用传统的分离技术从样品中获得的微生物,代表具体培养条件所能分离到的微生物,无法分离到样品中所有微生物,不能完整地揭示样品的菌群组成[6-7]。高通量测序、宏基因组学分析等非培养研究无需分离培养微生物,能直接反映样品中微生物群落构成和多样性[8-11]

    目前,对传统发酵乳制品中参与发酵微生物的分离和菌群多样性相关研究较多[12-14],然而,通过高通量测序分析比较不同采集保存温度下的传统发酵乳制品微生物多样性,优化传统发酵乳制品采集保存温度却鲜有报道。Sun等[15]通过高通量焦磷酸测序对17个自然发酵乳制品中的细菌和真菌群落多样性进行研究,所有样品中细菌属47个,真菌属43个;王远微等 [16]对川西北部分牧区的10份传统发酵牦牛酸奶样品进行酵母菌的分离,通过常规形态特征和26S rRNA基因测序分析鉴定出16株马克斯克鲁维酵母菌;袁凤霞等[17]将前期从新疆、西藏和青海等地区传统自制乳制品中分离的27株酵母菌株分别与保加利亚乳杆菌发酵酸乳,筛选优良共生酵母菌株。还有研究表明传统发酵奶制品在发酵过程中乳酸菌和酵母菌的共同作用使得发酵后的奶制品具有独特的风味和口感[18-20]

    本研究以常温、冰袋、干冰和液氮不同保存条件下采集的甘南牧区牧民自制牦牛酸奶样品为研究对象,采用Illumina NovaSeq 高通量测序技术,对牦牛酸奶扩增真菌ITS2区进行测序,通过分析比较不同采集保存温度下样品的真菌群落结构和真菌多样性,探究基于高通量测序不同采集保存温度对传统发酵乳制品微生物真菌多样性分析的影响,为传统发酵乳制品采样条件优化提供理论指导,并为科学保护、开发与利用传统发酵乳制品中优良微生物资源提供参考依据。

    牦牛酸奶样品 20份甘南牧区牦牛酸奶样品的采样具体信息见表1;QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit、QIAquick Gel Extraction Kit 德国QIAGEN公司;PowerSoil DNA Isolation Kit 美国MOBIO公司;KAPA HiFi Hotstart ReadyMix Kit 美国KAPA Biosystems公司; 2× Phanta Master Mix 南京诺唯赞生物科技股份有限公司;AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 美国AXYGEN公司。

    表  1  甘南牧区牦牛酸奶采样信息
    Table  1.  Information of yak yogurt samples collected from Gannan pastoral area
    样品编号采集保存条件采样时间采样地点
    Z1-0常温2019.11卓尼县沙冒村王扎家
    Z1-4冰袋2019.11卓尼县沙冒村王扎家
    Z1-20干冰2019.11卓尼县沙冒村王扎家
    Z1-80液氮2019.11卓尼县沙冒村王扎家
    Z2-0常温2019.11卓尼县沙冒村仁青尕家
    Z2-4冰袋2019.11卓尼县沙冒村仁青尕家
    Z2-20干冰2019.11卓尼县沙冒村仁青尕家
    Z2-80液氮2019.11卓尼县沙冒村仁青尕家
    Z3-0常温2019.11卓尼县沙冒村大桑杰嘉木措家
    Z3-4冰袋2019.11卓尼县沙冒村大桑杰嘉木措家
    Z3-20干冰2019.11卓尼县沙冒村大桑杰嘉木措家
    Z3-80液氮2019.11卓尼县沙冒村大桑杰嘉木措家
    Z4-0常温2019.11卓尼县沙冒村楞本才让家
    Z4-4冰袋2019.11卓尼县沙冒村楞本才让家
    Z4-20干冰2019.11卓尼县沙冒村楞本才让家
    Z4-80液氮2019.11卓尼县沙冒村楞本才让家
    L2-0常温2019.11碌曲县卓玛吉家
    L2-4冰袋2019.11碌曲县卓玛吉家
    L2-20干冰2019.11碌曲县卓玛吉家
    L2-80液氮2019.11碌曲县卓玛吉家
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    5424R低温高速离心机 德国Eppendorf 公司;VDRTEX-5涡旋混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司; Tanon 3500 凝胶成像系统 上海天能科技有限公司;DYY-6C电泳仪 上海天能科技有限公司;ND-2000C微量紫外分光光度计 美国NanoDrop 公司;Applied Biosystems VeritiPro PCR 仪 美国Life Technologies 公司。

    实地采集牧民自制牦牛酸奶,每份样品采集4管,每管30 mL,密封后标记样品号,分别置于常温、冰袋、干冰和液氮容器中保存,运回实验室后,分别于常温、4、−20 ℃和−80 ℃保存备用。样品采集自甘肃省甘南藏族自治州卓尼县(Z)、碌曲县(L),常温采集实验室常温保存样品分组为Z-0,冰袋采集实验室4 ℃保存样品分组为Z-4,干冰采集实验室−20 ℃保存样品分组为Z-20,液氮采集实验室于−80 ℃保存样品分组为Z-80。

    取2 mL牦牛酸奶样品,采用试剂盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit,按照说明书的要求提取牦牛酸奶的总DNA,利用微量紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳,进行总DNA完整性和浓度质检。

    使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kit将提取到的总DNA作为模板进行PCR扩增,采用引物为ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC(F2045)和ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC(R2390)扩增真菌ITS2区(引物中已带特定barcode),PCR反应条件为:95 ℃ 3 min;98 ℃ 20 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,30 个循环;72 ℃ 5 min。PCR 反应体系为:2×KAPA Library Amplification Ready Mix 15 μL,引物(10 μmol/L)各为1 μL,模板 DNA为50 ng,加ddH2O补齐至30 μL。

    扩增PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒切胶回收PCR产物,文库质检合格后,使用Qubit 2.0进行文库定量,并根据每个样品的数据量要求,进行相应比例的混合,采用Illumina NovaSeq PE250进行上机测序,Illumina NovaSeq高通量测序由上海锐翌生物科技有限公司完成。

    ITS2序列被控制在220~500 bp之间,保证每条reads平均质量值不低于20,且含N碱基数不超过3个。将序列完全一样的Clean Reads根据其丰度大小进行排序,将其中的Singletons过滤掉。使用UPARSE(http://drive5.com/uparse/)根据 97%相似度进行OTU聚类,并使用Userach(版本7.0.1090)鉴定和移除嵌合体序列。每个OTU都有一个代表性的序列,使用RDP数据库(http://rdp.cme.msu.edu/),置信度阈值设置为0.8,利用RDP Classifer(http://rdp.cme.msu.edu/)将每个代表性序列进行物种注释。不同样本对应的Reads数量差距较大,为避免因样品数据大小不同而造成分析时的偏差,在样品达到足够的测序深度的情况下,对每个样品进行随机抽平处理。测序深度使用Alpha多样性中的coverage指数来衡量,OTU profiling table、Alpha多样性指数和Beta多样性指数通过QIIME(version 1.9.1)的python脚本实现。

    对从采集至实验室8 d后的牦牛酸奶样品提取总DNA,经质检合格,通过样品真菌ITS2区测序,20份牦牛酸奶样品质控过滤后得到的有效序列为728022条。采用稀释曲线评估各样品测序量是否足够,结果如图1所示,由稀释曲线可知,随着序列数的增加,chao1指数趋于平缓,说明本次样本测序的深度足够,每个样品随机抽取31495条reads,抽平足以反映各样品中真菌物种多样性,测序量满足后续生物信息学分析的要求。各个样品及分组信息,质控后序列数,可观测的物种数量,chao1、shannon、simpson和coverage指数见表2,所有样本的测序深度均大于0.99,说明样本测序结果可以反映样品的真实情况。所有序列按97%的相似度进行OTU聚类,从20份样品中共检测到702个OTU,隶属于6门、24纲、61目、126科、198属。

    图  1  所有样品稀释曲线图
    Figure  1.  Rarefaction curve of all samples
    表  2  20份牦牛酸奶样品的序列信息及α多样性指数
    Table  2.  Sequence information and α diversity of 20 yak yoghurt samples
    组别样品编号质控后序列数可观测的物种数量chao1指数shannon指数simpson指数coverage指数
    Z-0Z1-0385342648.751.100.510.99955
    Z2-0343672631.001.190.490.99981
    Z3-0388055053.750.610.140.99968
    Z4-0373574466.751.380.540.99955
    L2-0361583435.671.720.620.99981
    Z-4Z1-4376973537.501.190.450.99981
    Z2-4378034951.141.610.520.99981
    Z3-4332059091.001.390.330.99990
    Z4-4365073239.501.070.410.99968
    L2-4381455357.672.350.740.99974
    Z-20Z1-20331474949.001.710.590.99997
    Z2-2036933432435.065.340.900.99942
    Z3-20374004954.252.210.660.99978
    Z4-2038584259269.973.580.790.99907
    L2-20382548080.003.110.810.99997
    Z-80Z1-80356315353.332.130.700.99990
    Z2-80338453839.003.390.860.99994
    Z3-80361414646.003.630.871
    Z4-80319283535.200.990.320.99994
    L2-80375816161.253.160.810.99994
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    Z2-20、Z4-20样品可观测的物种数量分别为432、259,明显高于其同一牦牛酸奶不同采集保存温度下的其它样品,但在干冰采集实验室−20 ℃保存的其它样品Z1-20、Z3-20、L2-20可观测的物种数量未出现明显高于同一牦牛酸奶不同采集保存温度下的其它样品,故排除Z2-20、Z4-20异常样本,对不同采集保存温度样品组间α多样性指数进行了kw检验分析,结果见表3,组间α多样性各指数均无显著差异(P>0.05)。对不同采集保存温度样品的真菌群落进行了主成分(PCA)分析,PCA可以初步反映出不同样品可能表现出分散和聚集的分布情况,结果见图2,常温采集组(Z-0)、冰袋采集组(Z-4)、干冰采集组(Z-20)、液氮采集组(Z-80)的样品分布均较为聚集,从而可以判断出不同采集保存温度样品真菌群落组成差异不大,群落组成较为接近。

    表  3  组间样品α多样性指数比较
    Table  3.  Comparison of α diversity indices among groups
    组别可观测的
    物种数量
    chao1指数shannon指数simpson指数coverage指数
    均值(Z-0)34.4040.651.200.460.99976
    均值(Z-4)48.6051.021.520.490.99985
    均值Z-20)57.3358.442.340.680.99995
    均值(Z-80)46.2047.172.660.710.99991
    P0.1954260.5141990.1062190.121510.063209
    注:“均值”是各组数据为物种丰度的平均值。
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    图  2  各组样品的PCA分析
    Figure  2.  PCA analysis of the different groups

    在真菌门水平,样品中一共鉴定出6个门水平物种,图3显示不同采集保存温度样品组在门水平真菌相对丰度物种,主要5个门,其余相对丰度太低的合并为other。常温采集组的牦牛酸奶真菌ITS2区测序,共检测出4个真菌菌门,其中子囊菌门(Ascomycota)平均丰度值为99.25%,担子菌门(Basidiomycota)平均丰度值为0.73%,接合菌门(Zygomycota)平均丰度值为0.0052%,未分类菌门平均丰度值为0.010%。冰袋采集组的牦牛酸奶经高通量测序共检测出5个真菌菌门,其中子囊菌门(Ascomycota)平均丰度值为 98.39%,担子菌门(Basidiomycota)平均丰度值为1.26%,接合菌门(Zygomycota)平均丰度值为0.043%,壶菌门(Chytridiomycota)平均丰度值为0.022%,未分类菌门平均丰度值为0.28%。干冰采集组的牦牛酸奶经高通量测序共检测出5个真菌菌门,其中子囊菌门(Ascomycota)平均丰度值为 96.04%,担子菌门(Basidiomycota)平均丰度值为3.28%,接合菌门(Zygomycota)平均丰度值为0.19%,壶菌门(Chytridiomycota)平均丰度值为0.057%,未分类菌门平均丰度值为0.44%。液氮采集组的牦牛酸奶经高通量测序共检测出5个真菌菌门,其中子囊菌门(Ascomycota)平均丰度值为 82.09%,担子菌门(Basidiomycota)平均丰度值为16.90%,接合菌门(Zygomycota)平均丰度值为0.36%,壶菌门(Chytridiomycota)平均丰度值为0.013%,未分类菌门平均丰度值为0.64%。ITS2区测序分析的甘南牧区牦牛酸奶样品中子囊菌门(Ascomycota)丰度占总数的82.09%~99.25%,为样品中真菌优势菌门。通过门水平真菌群落结构分析比较,不同采集保存温度样品组间真菌群落组成基本相同,仅组成比例不同。

    图  3  门分类水平真菌相对丰度
    Figure  3.  Relative abundance of fungi at phylum level

    在真菌属水平,图4显示了不同采集保存温度牦牛酸奶样品在属水平真菌相对丰度前20的物种,其它物种合并为other。常温采集组的牦牛酸奶相对丰度大于1%的菌属包括酵母菌属(Saccharomyces,63.49%)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces,31.89%)、毕赤酵母属(Pichia,3.39%)。冰袋采集组的牦牛酸奶相对丰度大于1%的菌属包括酵母菌属(Saccharomyces,61.59%)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces,16.08%)、毕赤酵母属(Pichia,10.01%)、假丝酵母属(Candida,9.48%)。干冰采集组的牦牛酸奶相对丰度大于1%的菌属包括酵母菌属(Saccharomyces,23.98%)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces,27.35%)、毕赤酵母属(Pichia,35.21%)、Davidiella属(3.12%)、马拉色氏霉菌属(Malassezia,1.76%)。液氮采集组的牦牛酸奶相对丰度大于1%的菌属包括酵母菌属(Saccharomyces,37.58%)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces,22.68%)、毕赤酵母属(Pichia,13.91%)、Davidiella属(2.53%),马拉色氏霉菌属(Malassezia,12.28%)。测序分析的甘南牧区牦牛酸奶样品中酵母菌属(Saccharomyces)丰度占总数的23.98%~63.49%,克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)丰度占总数的16.08%~31.89%,毕赤酵母属(Pichia)丰度占总数的3.39%~35.21%,是相对丰度较高的真菌属,为样品中的优势菌属。通过属水平真菌群落结构分析比较,不同采集保存温度下牦牛酸奶样品组间真菌群落组成相似,仅组成比例不同。

    图  4  属水平前20名真菌的相对丰度
    Figure  4.  Relative abundance of the top 20 fungi at genus level

    属水平的组间物种差异分析,采用秩和检验得到不同采集保存温度下牦牛酸奶样品组间的差异细菌属共2个,其中液氮采集组,DavidiellaHypocreales unidentified 2个菌属显著高于其它组别的真菌群落菌属(P<0.05),结果见表4。为了直观展示各组及各样品间真菌属差异,对差异真菌属进行热图(Heatmap)分析和主成分分析(PCA),Heatmap图是以颜色梯度来表征二维矩阵或表格中的数据大小,反映不同分组或样本在各分类水平上群落组成的相似性与差异性,由图5可知,液氮采集组样品的群落组成和其它样品组差异较大。PCA图能够直观地把样品之间相似或差异的程度呈现在二维坐标系上,在图6中常温采集组和冰袋采集组样品表现出聚集的分布,表明常温、冰袋采集组样品的群落组成更为接近;干冰采集组和液氮采集组样品表现出聚集的分布,表明干冰、液氮采集组样品的群落更为接近。

    表  4  差异显著物种
    Table  4.  Significantly different genus among groups
    组别DavidiellaHypocreales unidentified
    均值(Z-0)0.001080.000172
    均值(Z-4)0.0029920.000718
    均值(Z-20)0.0222740.006098
    均值(Z-80)0.0221940.01367
    P0.0236760.004809
    注:“均值”是物种丰度的平均值。
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    图  5  属水平差异物种的Heatmap
    Figure  5.  Heatmap of different genus among groups
    图  6  属水平差异物种的PCA分析
    Figure  6.  PCA analysis of different genus among groups

    牦牛酸奶是由牦牛奶通过传统发酵方法制得,是经过长期自然驯化优良食品微生物的天然载体,含有极具开发利用价值的微生物资源[21]。本研究采用Illumina NovaSeq高通量测序技术测序甘南牧区牦牛酸奶样品真菌ITS2区,分析牦牛酸奶中真菌菌群组成,比较不同采集保存温度样品真菌多样性,对20份甘南牧区牦牛酸奶样品高通量测序结果分析表明,子囊菌门(Ascomycota)为样品中真菌优势菌群门,酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)为优势菌属。Zhang等[22]报道青海地区牦牛酸奶与其它发酵酸奶相比含有更多的乳酸菌和酵母菌,其中青海西北部的高原牦牛酸奶和青海东部的环湖牦牛酸奶中乳酸菌是优势菌,而青海南部的环湖牦牛酸奶中酵母菌是优势菌。Wu等[23]研究发现,3种乳酸菌以及5种酵母菌是西藏不同海拔地区牦牛酸奶中主要发酵菌群。孙志宏等[24]运用宏基因组学技术对西藏地区自然发酵乳中微生物多样性进行分析,结果表明在真菌门水平上子囊菌门(Ascomycota)为最优势菌门,在属水平上优势菌属为毕赤酵母属(Pichia)、耐碱酵母属(Galactomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)。乌仁图雅[25]、张冬蕾[26]、杨彦荣[27]通过焦磷酸测序技术对传统发酵乳制品酸牦牛奶、酸牛奶进行了真菌多样性研究,结果表明,酸牦牛奶、酸牛奶中真菌优势菌门均为子囊菌门。从以上研究结果中可以看出牦牛乳制品中的真菌菌群尽管比较复杂,但是都以酵母菌为主,只是优势的酵母菌的种类有所不同,本次甘南牧区牦牛酸奶样品真菌菌群组成分析结果与上述学者研究结论较为一致。

    采用Illumina高通量测序技术分析比较了4种不同采集保存温度下牦牛酸奶样品真菌多样性。目前,尚未见不同采集保存温度对传统发酵乳制品微生物多样性分析影响的报道,呼斯楞等[28]在内蒙古呼伦贝尔地区传统发酵乳中乳酸菌的多样性分析中,样品采集采用低温保存,带回实验室于−80 ℃超低温保藏;陈芝兰等[29]在西藏地区传统发酵乳中乳酸菌多样性及微生物数量分析中,将牧民自然发酵制作的酸奶放入冰盒内保存;刘振东等[30]在西藏不同产区曲拉细菌群落结构的比较分析中将采集样品放入冰盒保存并立即运送到实验室,置于−80 ℃冰箱中备用;张敏等[31] 在基于16S rDNA高通量测序方法比较新疆西北部地区乳品中微生物的多样性中,将采集样品放入车载冰箱运回实验室,在−80 ℃超低温冰箱保存;马江等[32]在甘南牦牛曲拉中真菌群落结构研究中,将样品置于冷藏箱中,运输至实验室。以上乳制品微生物多样性研究采样均以低温采集为主。在未来研究中,为了更大可能的获得牦牛酸奶中不同种类的微生物多样性信息和定向的分离出目标微生物,可在借鉴已有最新测序技术在传统发酵乳制品微生物基因组和生物多样性中的研究结果,进一步优化不同的采样方法与分离策略,更好地开展传统发酵乳制品中优良微生物资源的保护与发掘研究工作。

    采用Illumina NovaSeq 高通量测序技术,对4种不同保存温度条件下采集自甘南牧区20份牦牛酸奶样品真菌ITS2区进行测序,经OTU 聚类分析,采集的甘南牧区牦牛酸奶样品中的真菌分属于6门、24纲、61目、126科、198属。子囊菌门(Ascomycota)在采集牦牛酸奶样本真菌中占比最高,其丰度值变化范围为82.09%~99.25%,是20份样品中的真菌优势菌门。酵母菌属(Saccharomyces)丰度值变化范围为23.98%~63.49%,克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)丰度值变化范围为16.08%~31.89%,毕赤酵母属(Pichia)丰度值变化范围为3.39%~35.21%,是样品中的真菌优势菌属。基于Illumina NovaSeq高通量测序分析比较,常温、冰袋、干冰和液氮4种不同保存温度条件下采集自甘南牧区牦牛酸奶真菌多样性之间无显著差异,真菌群落组成基本相同,仅组成比例不同。

  • 图  1   所有样品稀释曲线图

    Figure  1.   Rarefaction curve of all samples

    图  2   各组样品的PCA分析

    Figure  2.   PCA analysis of the different groups

    图  3   门分类水平真菌相对丰度

    Figure  3.   Relative abundance of fungi at phylum level

    图  4   属水平前20名真菌的相对丰度

    Figure  4.   Relative abundance of the top 20 fungi at genus level

    图  5   属水平差异物种的Heatmap

    Figure  5.   Heatmap of different genus among groups

    图  6   属水平差异物种的PCA分析

    Figure  6.   PCA analysis of different genus among groups

    表  1   甘南牧区牦牛酸奶采样信息

    Table  1   Information of yak yogurt samples collected from Gannan pastoral area

    样品编号采集保存条件采样时间采样地点
    Z1-0常温2019.11卓尼县沙冒村王扎家
    Z1-4冰袋2019.11卓尼县沙冒村王扎家
    Z1-20干冰2019.11卓尼县沙冒村王扎家
    Z1-80液氮2019.11卓尼县沙冒村王扎家
    Z2-0常温2019.11卓尼县沙冒村仁青尕家
    Z2-4冰袋2019.11卓尼县沙冒村仁青尕家
    Z2-20干冰2019.11卓尼县沙冒村仁青尕家
    Z2-80液氮2019.11卓尼县沙冒村仁青尕家
    Z3-0常温2019.11卓尼县沙冒村大桑杰嘉木措家
    Z3-4冰袋2019.11卓尼县沙冒村大桑杰嘉木措家
    Z3-20干冰2019.11卓尼县沙冒村大桑杰嘉木措家
    Z3-80液氮2019.11卓尼县沙冒村大桑杰嘉木措家
    Z4-0常温2019.11卓尼县沙冒村楞本才让家
    Z4-4冰袋2019.11卓尼县沙冒村楞本才让家
    Z4-20干冰2019.11卓尼县沙冒村楞本才让家
    Z4-80液氮2019.11卓尼县沙冒村楞本才让家
    L2-0常温2019.11碌曲县卓玛吉家
    L2-4冰袋2019.11碌曲县卓玛吉家
    L2-20干冰2019.11碌曲县卓玛吉家
    L2-80液氮2019.11碌曲县卓玛吉家
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    表  2   20份牦牛酸奶样品的序列信息及α多样性指数

    Table  2   Sequence information and α diversity of 20 yak yoghurt samples

    组别样品编号质控后序列数可观测的物种数量chao1指数shannon指数simpson指数coverage指数
    Z-0Z1-0385342648.751.100.510.99955
    Z2-0343672631.001.190.490.99981
    Z3-0388055053.750.610.140.99968
    Z4-0373574466.751.380.540.99955
    L2-0361583435.671.720.620.99981
    Z-4Z1-4376973537.501.190.450.99981
    Z2-4378034951.141.610.520.99981
    Z3-4332059091.001.390.330.99990
    Z4-4365073239.501.070.410.99968
    L2-4381455357.672.350.740.99974
    Z-20Z1-20331474949.001.710.590.99997
    Z2-2036933432435.065.340.900.99942
    Z3-20374004954.252.210.660.99978
    Z4-2038584259269.973.580.790.99907
    L2-20382548080.003.110.810.99997
    Z-80Z1-80356315353.332.130.700.99990
    Z2-80338453839.003.390.860.99994
    Z3-80361414646.003.630.871
    Z4-80319283535.200.990.320.99994
    L2-80375816161.253.160.810.99994
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    表  3   组间样品α多样性指数比较

    Table  3   Comparison of α diversity indices among groups

    组别可观测的
    物种数量
    chao1指数shannon指数simpson指数coverage指数
    均值(Z-0)34.4040.651.200.460.99976
    均值(Z-4)48.6051.021.520.490.99985
    均值Z-20)57.3358.442.340.680.99995
    均值(Z-80)46.2047.172.660.710.99991
    P0.1954260.5141990.1062190.121510.063209
    注:“均值”是各组数据为物种丰度的平均值。
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    表  4   差异显著物种

    Table  4   Significantly different genus among groups

    组别DavidiellaHypocreales unidentified
    均值(Z-0)0.001080.000172
    均值(Z-4)0.0029920.000718
    均值(Z-20)0.0222740.006098
    均值(Z-80)0.0221940.01367
    P0.0236760.004809
    注:“均值”是物种丰度的平均值。
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  • [1] 张和平. 自然发酵乳制品中乳酸菌的生物多样性[J]. 生命科学,2015,27(7):837−846.
    [2] 李伟程, 侯强川, 于洁, 等. 传统发酵乳制品中微生物多样性研究[J]. 食品工业科技,2018,39(1):131−136.
    [3]

    Jiang Y, Li N, Wang Q, et al. Microbial diversity and volatile profile of traditional fermented yak milk[J]. Journal of Dairy Science,2020,103(1):87−97. doi: 10.3168/jds.2019-16753

    [4]

    Chen H C, Wang S Y, Chen M J. Microbiological study of lactic acid bacteria in kefir grains by culture-dependent and culture-independent methods[J]. Food Microbiol,2008,25(3):492−501. doi: 10.1016/j.fm.2008.01.003

    [5]

    Nahidul-Islam S M, Takashi K, Hajime T, et al. Bacterial and fungal microbiota in traditional Bangladeshi fermented milk products analysed by culture-dependent and culture-independent methods[J]. Food Research International,2018,111(9):431−437.

    [6] 孙天松, 王俊国, 张列兵, 等. 中国新疆地区酸马奶中乳酸菌生物多样性研究[J]. 微生物学通报,2007,34(3):451−454. doi: 10.3969/j.issn.0253-2654.2007.03.013
    [7] 张亚川, 蔡静静, 剡文莉, 等. 新疆伊犁地区乳品中发酵菌种的筛选及产酸性能研究[J]. 中国乳品工业,2019,47(7):4−7, 18. doi: 10.3969/j.issn.1001-2230.2019.07.001
    [8] 张和平, 郑艺. 高通量测序技术在乳制品研究中的应用[J]. 中国食品学报,2015,15(3):1−7.
    [9] 周丹燕, 戴世鲲, 王广华, 等. 宏基因组学技术的研究与挑战[J]. 微生物学通报,2011,38(4):591−600.
    [10] 孟飞, 俞春娜, 王秋岩, 等. 宏基因组与宏基因组学[J]. 中国生物化学与分子生物学报,2010,.26(2):116−120.
    [11] 曹晨霞, 韩琬, 张和平. 第三代测序技术在微生物研究中的应用[J]. 微生物学通报,2016,43(10):2269−2276.
    [12]

    Yu J, Wang W H, Menghe B L, et al. Diversity of lactic acid bacteria associated with traditional fermented dairy products in Mongolia[J]. Journal of Dairy Science,2011,94(7):3229−3241. doi: 10.3168/jds.2010-3727

    [13]

    Rakhmanova A, Wang T, Xing G, et al. Isolation and identification of microorganisms in Kazakhstan koumiss and their application in preparing cow-milk koumiss[J]. Journal of Dairy Science. 2021, 104(1): 151−166.

    [14]

    Yamei, Guo Y S, Zhu J J, et al. Investigation of physicochemical composition and microbial communities in traditionally fermented vrum from Inner Mongolia[J]. Journal of Dairy Science 2019, 102(10): 8745−8755.

    [15]

    Sun Z, Liu W, Bao Q, et al. Investigation of bacterial and fungal diversity in tarag using high-throughput sequencing[J]. Journal of Dairy Science,2014,97(10):6085−6096. doi: 10.3168/jds.2014-8360

    [16] 王远微, 张诚民, 索化夷, 等. 传统发酵牦牛酸奶中马克斯克鲁维酵母菌的分离鉴定及系统发育分析[J]. 食品科学,2014,35(15):216−220. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201415044
    [17] 袁凤霞, 田莎, 曹晓虹, 等. 酸乳发酵中优良共生酵母菌的筛选[J]. 食品工业科技,2018,39(7):70−77.
    [18]

    Bai M, Qing M, Guo Z, et a1. Occurrence and dominance of yeast species in naturally fermented milk from the Tibetan Plateau of China[J]. Canadian Journal of Microbiology,2010,56(9):707−714. doi: 10.1139/W10-056

    [19] 谢婕, 赵欣, 骞宇, 等. 传统发酵牦牛酸乳中酵母菌的分子生物学鉴定[J]. 食品科学,2015,36(11):114−118. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201511022
    [20] 李字辉, 王俊钢, 刘成江, 等. 新疆伊犁牧区发酵乳制品中酵母菌的分离和多样性分析[J]. 食品与发酵工业,2013,39(7):98−103.
    [21] 梁明明, 曹菲薇, 杨欢东, 等. 传统藏式牦牛酸奶中优良乳酸菌筛选与产香性能分析[J]. 食品工业科技,2020,41(16):108−113.
    [22]

    Zhang H, Xu J, Wang J, et al. A survey on chemical and microbiological composition of kurut, naturally fermented yak milk from qinghai in china[J]. Food Control,2008,19(6):578−586. doi: 10.1016/j.foodcont.2007.06.010

    [23]

    Wu X, Luo Z, Yu L, et al. A survey on composition and microbiota of fresh and fermented yak milk at different tibetan altitudes[J]. Dairy Science and Technology,2009,89(2):201−209. doi: 10.1051/dst/2009007

    [24] 孙志宏, 刘文俊, 张和平. 基于宏基因组方法对西藏传统发酵牦牛奶中微生物多样性的研究[J]. 北京工商大学学报(自然科学版),2012,30(4):19−24.
    [25] 乌仁图雅. 应用454焦磷酸测序技术对传统发酵乳制品微生物多样性的研究[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2014.
    [26] 张冬蕾. 应用焦磷酸测序技术对新疆地区传统发酵乳制品中微生物多样性的研究[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2016.
    [27] 杨彦荣. 应用高通量测序研究西藏地区传统发酵牦牛乳中微生物的多样性[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2016.
    [28] 呼斯楞, 刘红新, 于洁, 等. 内蒙古呼伦贝尔地区传统发酵乳中乳酸菌的多样性分析[J]. 微生物学通报,2016,43(5):984−990.
    [29] 陈芝兰, 杨吉霞, 李梦寒, 等. 西藏地区传统发酵乳中乳酸菌多样性及微生物数量分析[J]. 食品科学,2013,34(17):140−145. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201317031
    [30] 刘振东, 毕娜, 李哲, 等. 西藏不同产区曲拉细菌群落结构的比较分析[J]. 食品与发酵工业,2020,46(6):60−66.
    [31] 张敏, 张艳, 黄丽丽, 等. 基于16S rDNA高通量测序方法比较新疆西北部地区乳品中微生物的多样性[J]. 食品科学,2017,38(20):27−33. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201720005
    [32] 马江, 文鹏程, 罗俏俏, 等. 甘南牦牛曲拉中真菌群落结构[J]. 食品与发酵工业,2020,46(4):51−56.
  • 期刊类型引用(6)

    1. 代桂丽,张超锋. 反相高效液相色谱-脉冲安培检测法对硫酸新霉素的药物分析研究. 化学与粘合. 2024(02): 200-205 . 百度学术
    2. 苗晶,宋戈,朱琳,王树奇,李茜,杨文敏. 离子交换色谱法测定调制乳粉和固体饮料中异麦芽糖、异麦芽三糖和潘糖. 中国乳品工业. 2023(05): 50-54 . 百度学术
    3. 颉东妹,王宁丽,刘笑笑,吴福祥,裴栋,郭玫,邸多隆. 微波消解-离子色谱法测定枸杞多糖的含量及组成. 食品安全质量检测学报. 2022(04): 1065-1072 . 百度学术
    4. 陈修红,冀鹏,何国亮,夏然,李祖明,刘佳. 离子色谱-脉冲安培法同时测定牛肉水解产物中6种糖组分的含量. 食品工业科技. 2022(11): 267-275 . 本站查看
    5. 胡佳偲,孙晨,张昊,霍宗利. 高效液相色谱法同时测定全血中的原卟啉和锌原卟啉. 江苏预防医学. 2022(03): 272-276 . 百度学术
    6. 梁静. 离子色谱在食品检测中的应用. 食品安全导刊. 2021(29): 152-153 . 百度学术

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出版历程
  • 收稿日期:  2020-11-05
  • 网络出版日期:  2021-05-10
  • 刊出日期:  2021-06-30

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