Correlation between in Vitro Anti-inflammatory Activity and Amino Acid Composition of Deer Sinew before and after Enzymolysis
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摘要: 目的：分析酶解前后鹿筋对TNF-α诱导的MH7A细胞抗炎作用的影响。方法：采用MTT法检测鹿筋天然蛋白（DSNP）和鹿筋酶解蛋白（DSEP）不同分子量的超滤组分的增殖抑制活性，筛选增殖抑制活性最佳的组分，测定活性组分对MH7A细胞分泌炎症因子（NO、IL-6）的影响，分析鹿筋酶解前后活性组分中氨基酸组成及含量。采用多元统计分析找出酶解前后鹿筋的差异性氨基酸与抑制MH7A细胞分泌炎症因子之间的关系。结果：酶解前后鹿筋不同的超滤组分中，DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞增殖抑制的作用最强（P<0.05），且能够抑制细胞炎症因子NO、IL-6的分泌。质量浓度为25～200 μg/mL时，DSNP-5给药组炎症因子（NO、IL-6）的释放量均低于DSEP-5给药组，具有显著差异（P<0.05），说明DSNP-5抑制能力更强。酶解前后鹿筋的氨基酸组成基本一致，但含量存在明显差异，其中甘氨酸既是特征性差异成分，又与抑制MH7A细胞分泌炎症因子NO、IL-6密切相关，且DSNP-5的甘氨酸含量（31.01%）高于DSEP-5的甘氨酸含量（28.91%）。结论：甘氨酸为鹿筋酶解前后与抗炎活性相关的差异氨基酸，初步探究酶解对鹿筋抗炎活性的影响，为鹿筋的开发应用提供可靠依据。Abstract: Objective: To analyze the anti-inflammatory effect on TNF-α induced MH7A cells before and after deer sinew enzymolysis. Methods: Proliferative inhibitory activity of each peptide segment from deer sinew natural protein (DSNP) and deer sinew enzymolysis protein (DSEP) in ultrafiltration fraction was determined by MTT assay, and the components with best activity were screened. The effects of active component on the secretion of inflammatory factors (NO and IL-6) by MH7A cells were determined by ELLSA, and analysised the amino acid composition and content before and after deer sinew enzymolysis. Multivariate statistical analysis was used to find out the relationship between the differential amino acids before and after deer sinew enzymolysis and the inhibition of MH7A cells secreting inflammatory factors. Results: DSNP-5 and DSEP-5 had the best inhibitory effect on the proliferation of MH7A cells (P<0.05), and inhibited the secretion of NO and IL-6. When the concentration was 25~200 μg/mL, the release of inflammatory factors (NO and IL-6) in DSNP-5 was lower than that in DSEP-5, with significant difference (P<0.05), indicating that DSNP-5 had better inhibition ability.The amino acid composition before and after deer sinew enzymolysis was basically the same, but the content was significantly different. Gly was not only a characteristic difference component, but also closely related to the inhibition of MH7A cells secreting inflammatory factors NO and IL-6. The Gly content of DSNP-5 (31.01%) was higher than that of DSEP-5 (28.91%). Conclusion: Gly is the difference amino acid related to anti-inflammatory activity before and after deer sinew enzymolysis. The effect of enzymolysis on anti-inflammatory activity of deer sinew is explored, which provide reliable basis for the development and application.
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鹿筋为鹿科动物梅花鹿（Cervus nipport Temminck）四肢的筋，性温，味淡微咸，具有壮筋骨、续劳损等功效，可用于治疗风湿关节疼痛、腰膝软弱等疾病[1-2]。鹿筋含有丰富的胶原蛋白、氨基酸，作为药食同源的名贵中药材，营养及药用价值极高，因而需要测定鹿筋的氨基酸种类及含量[3]，目前已有一些文献对鹿筋的氨基酸组成及其含量进行了研究。
王晓通等[4]采用聚类分析的定性研究方法分析了鹿产品中17种水解氨基酸的含量；庞博等[5]利用柱前衍生化法测定了鹿筋中氨基酸的含量。机体发生炎症反应主要是由于细胞炎症因子的过度释放，其中NO、IL-6为典型的致炎因子，通过抑制细胞分泌致炎因子，可达到一定的抗炎效果[6-8]，故抗炎功效与降低细胞炎症因子的含量水平密切相关。现代研究表明鹿筋蛋白具有抗炎、镇痛等作用，孙晓迪等[9]研究发现鹿筋胶原通过抑制炎性细胞因子IL-lβ和TNF-α的释放从而减轻小鼠的炎性反应。由于鹿筋胶原在抗炎方面表现出良好的活性，氨基酸作为构成胶原蛋白的基本单位，鹿筋酶解过程中氨基酸组成及含量的变化可能会影响抗炎活性，近几年的报道仅对鹿筋的氨基酸组成及含量进行了测定，并没有研究氨基酸组成及含量的变化与抗炎活性之间的关系，不能全面地评价酶解法对鹿筋品质特征的影响，因此本研究具有一定意义。
本研究筛选鹿筋天然蛋白（DSNP）和鹿筋酶解蛋白（DSEP）中对MH7A细胞增殖抑制作用最强的活性组分，测定了活性组分的氨基酸组成、含量以及细胞炎症因子分泌量，结合多元统计分析[10-11]，揭示其特征差异氨基酸，并筛选出潜在具有抗炎活性的氨基酸，初步探索鹿筋的药用价值与其氨基酸组成及含量变化的相关性，为鹿筋的进一步开发与应用提供了一定的参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
梅花鹿鹿筋 吉林省东鳌鹿业科技开发有限公司；类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞（MH7A） 广东吉尼欧生物技术公司；牛血清蛋白 上海源叶生物科技有限公司；噻唑蓝（MTT） 美国Amersco公司；TNF-α 北京索莱宝科技有限公司；NO、IL-6试剂盒 长春百金生物科技有限公司；碱性蛋白酶（20000 U/mg） 上海宝曼生物科技有限公司；DMEM高糖培养基 美国Hyclone公司；其余试剂 均为国产分析纯。
pH计 北京赛多利斯科学仪器有限公司；1、3、10 kDa超滤离心管 Millipore；680型酶标仪 日本TAKARA公司；HERAEUS HERAcell 150 CO2培养箱 日本三洋公司；L-8900型氨基酸自动分析仪 日本日立公司；Alpha1-2LDplus冷冻干燥机 德国CHRIST冻干机有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
1.2.1.1 DSNP样品制备
称取5.0 g鹿筋，剪碎成8 mm×8 mm的小块，按料液比1:20 g/mL溶于水中，于80 °C下磁力搅拌8 h[12]，过滤，微滤，滤液用超滤离心管进行超滤分级（1、3、10 kDa超滤离心管），按不同分子量分为：DSNP总提物、DSNP>10 kDa组分、DSNP 3～10 kDa组分、DSNP 1～3 kDa、DSNP<1 kDa，依次命名为DSNP-1、DSNP-2、DSNP-3、DSNP-4、DSNP-5，−40 ℃真空冷冻干燥，制得冻干粉备用。
1.2.1.2 DSEP样品制备
称取一定量的DSNP-1冻干粉，加入一定量的水，超声溶解，选用碱性蛋白酶，经前期实验筛选，在酶解最适条件下（温度50 ℃、pH9.0、底物浓度3%、酶底比1%）酶解5 h，酶解后沸水浴加热15 min灭酶，冷却至室温，3600 r/min离心15 min取上清液[13]，超滤分级方法同“1.2.1.1”节，所获得组分依次命名为DSEP-1、DSEP-2、DSEP-3、DSEP-4、DSEP-5，−40 ℃冻干备用。
1.2.2 MH7A细胞培养
MH7A细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养[14]。
1.2.3 DSNP和DSEP不同超滤组分对MH7A细胞增殖抑制的影响
实验分别设置空白组、模型组、给药组，每组设置5个复孔。选取对数生长期的细胞以5×104 个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h后，除空白组（加DMEM高糖培养液）外，其余各组加入终浓度为60 ng/mL的TNF-α 100 μL，继续培养24 h后，给药组分别加入终浓度为50 μg/mL的DSNP-1～DSNP-5和DSEP-1～DSEP-5溶液进行给药干预，培养24 h后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h，弃上清液，加入150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪检测490 nm波长处的吸光度OD值，计算细胞增殖抑制率，实验独立重复3次[15]。
细胞增殖抑制率(%)=A模型组−A药物组A模型组×100 1.2.4 不同质量浓度DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞增殖抑制的影响
按“1.2.4”项下方法，给药组分别加入25、50、100、200 μg/mL的DSNP-5、DSEP-5溶液100 μL，37 ℃、5% CO2培养24 h，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，培养4 h后弃去上清，加入150 μLDMSO，振荡10 min，于490 nm波长处测其OD值，计算细胞增殖抑制率，实验独立重复3次。
1.2.5 DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞释放NO、IL-6含量水平的影响
细胞给药培养24 h后（分别加入50 μg/mL DSNP-1～DSNP-5和DSEP-1～DSEP-5溶液，25、50、100、200 μg/mL的DSNP-5、DSEP-5溶液进行给药干预），吸取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测NO、IL-6的释放量，实验独立重复3次[16]。
1.2.6 氨基酸含量的测定
1.2.6.1 检测样品制备
称取10 mg鹿筋DSNP-5、DSEP-5样品各6份，分别加入10 mL浓度为6 mol/L的盐酸溶液中，110 °C水解24 h，用氨基酸分析仪进行测定[17]。
1.2.6.2 色谱条件
色谱柱：P/N 855-3507色谱柱（4.6 mm×60 mm）,分离柱内填料为3 μm磺酸型阳离子交换树脂；柱温50 ℃；流速0.4 mL/min；进样量20 µL。
1.3 数据分析
测定的实验结果以
¯x±s 表示，采用SPSS 25.0软件进行数据的显著性分析，组间比较采用单因素方差分析和t检验。将得到的18个氨基酸峰面积数据导入SIMCA-P14.0（Umetrics,Umea,Sweden）软件中进行多元统计分析。运用主成分分析（principal component analysis, PCA）、偏最小二乘法（partial least squares, PLS）、偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonalPLS-DA, OPLS-DA）[18-20]，找出酶解前后DSNP-5、DSEP-5的差异氨基酸，采用灰色关联度（the grey relational degree analysis, GRA）和偏最小二乘法（partial least squares, PLS），筛选抑制MH7A细胞分泌炎症因子的氨基酸。2. 结果与分析
2.1 DSNP和DSEP不同超滤组分对MH7A细胞的增殖抑制作用
由表1可知，与空白组相比，模型组能显著促进MH7A细胞的增殖（P<0.05）；在50 μg/mL质量浓度下，给药组中DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞的增殖抑制作用最强，分别为56.99%、52.68%，与其他给药组相比具有显著性差异（P<0.05），故选择DSNP-5、DSEP-5做进一步研究。
表 1 不同超滤组分的DSNP和DSEP对MH7A细胞的增殖抑制作用Table 1. Inhibitory effect of different ultrafiltration fractions DSNP and DSEP on the proliferation of MH7A cells组别 A值 增殖抑制率（%） 空白组 0.220±0.07l − TNF-α模型组 1.209±0.011a − DSNP-1 0.592±0.020i 51.03±0.015c DSNP-2 0.651±0.026g 46.15±0.019e DSNP-3 0.728±0.019e 39.78±0.014g DSNP-4 0.697±0.015f 42.35±0.012f DSNP-5 0.520±0.021k 56.99±0.016a DSEP-1 0.636±0.007h 47.39±0.006d DSEP-2 0.731±0.012d 39.54±0.010h DSEP-3 0.826±0.014b 31.70±0.011j DSEP-4 0.754±0.022c 37.64±0.017i DSEP-5 0.572±0.009j 52.68±0.008b 注: 同列不同小写字母表示差异显著，P<0.05；表2、表3同。 2.2 不同质量浓度DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞的增殖抑制作用
由表2可知，TNF-α诱导剂能显著促进MH7A细胞的增殖（P<0.05），在25～200 μg/mL质量浓度范围内，随着DSNP-5、DSEP-5质量浓度的增加，细胞增殖抑制率呈现向上升后下降的趋势，当质量浓度为100 μg/mL时，DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞增殖抑制作用最强，与其他给药组相比具有显著性差异（P<0.05），在25～200 μg/mL质量浓度范围内，与DSEP-5组相比，DSNP-5抑制MH7A细胞增殖的能力更强，具有显著性差异（P<0.05）。
表 2 不同质量浓度的DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞的增殖抑制作用Table 2. Inhibitory effects of different concentrations of DSNP-5 and DSEP-5 on the proliferation of MH7A cells组别 A值 增殖抑制率（%） 空白组 0.236±0.013j − TNF-α模型组 1.223±0.017a − DSNP-5-25 μg/mL 0.688±0.024c 43.74±0.018g DSNP-5-50 μg/mL 0.505±0.015e 58.71±0.012e DSNP-5-100 μg/mL 0.274±0.019i 77.60±0.014a DSNP-5-200 μg/mL 0.445±0.015g 63.61±0.012c DSEP-5-25 μg/mL 0.708±0.020b 42.11±0.015h DSEP-5-50 μg/mL 0.573±0.009d 53.15±0.008f DSEP-5-100 μg/mL 0.391±0.014h 68.03±0.011b DSEP-5-200 μg/mL 0.497±0.007f 59.36±0.006d 结果表明，不同质量浓度的DSNP-5、DSEP-5均可不同程度的抑制MH7A细胞增殖，在质量浓度为100 μg/mL时，对MH7A细胞的增殖抑制作用最强，抑制率分别为77.60%、68.03%。
2.3 DSNP-5、DSMP-5对MH7A细胞NO、IL-6分泌量的影响
2.3.1 对MH7A细胞释放NO的影响
NO是炎症反应发生的重要介质，在炎症反应的发展与归转中起着多种作用，具有代表性意义，过度释放NO，会引发炎症，造成组织损伤[21]。由图1可知，与空白组相比，模型组可以显著诱导MH7A细胞分泌NO（P<0.05）；随着样品质量浓度的增加，NO的分泌量呈现先下降后上升的趋势，其中，当质量浓度达到100 μg/mL时，NO分泌量达到最低，显著低于其他给药组（P<0.05），抑制作用最强，与DSEP-5相比，DSNP-5抑制MH7A细胞释放NO的能力更强（P<0.05）。
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图 1 DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞NO分泌量的影响注:不同小写字母表示差异显著，P<0.05；图2同。Figure 1. Effects of DSNP-5 and DSEP-5 on NO secretion of MH7A cells2.3.2 对MH7A细胞释放IL-6的影响
IL-6作为刺激因子，在炎症反应过程中扮演重要角色[22]，由图2可知，与空白组相比，TNF-α 模型组可以显著诱导MH7A细胞分泌IL-6（P<0.05）；与TNF-α 模型组相比，质量浓度在25~200 μg/mL范围内，各剂量组均可不同程度地下调IL-6的含量水平，有显著性差异（P<0.05），当质量浓度达到100 μg/mL时，IL-6的分泌量达到最低，显著低于其他给药组（P<0.05），效果最佳，与DSEP-5相比，DSNP-5抑制MH7A细胞释放IL-6的能力更强（P<0.05）。
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图 2 DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞IL-6分泌量的影响Figure 2. Effects of DSNP-5 and DSEP-5 on IL-6 secretion in MH7A cells结果表明DSNP-5、DSEP-5能抑制MH7A细胞炎症因子的释放，在质量浓度为100 μg/mL时，炎症因子NO、IL-6释放量达到最低，效果最显著。由此推测DSNP-5、DSEP-5可能通过抑制炎症因子（NO、IL-6）的释放，减缓细胞炎症反应，从而达到抗炎的效果。同时DSNP-5、DSEP-5对炎症因子NO、IL-6抑制的最佳浓度（100 μg/mL）与对细胞增殖抑制率的最佳浓度（100 μg/mL）一致，推测可能是由于DSNP-5、DSEP-5抑制MH7A细胞释放两种炎症因子NO、IL-6，降低炎症因子含量水平，从而抑制了MH7A细胞的增殖。与DSEP-5相比，DSNP-5对细胞增殖及细胞炎症因子分泌的抑制能力更强，具有显著性差异（P<0.05），推测酶解过程中可能使蛋白质的结构或成分发生了变化从而降低了生物活性。
2.4 DSNP-5和DSEP-5氨基酸的组成与含量
DSNP-5、DSEP-5（每组样品数量n=6）的氨基酸种类和含量测定结果见表3。从表3中可以看出，DSNP-5、DSEP-5均含有18种氨基酸，说明酶解前后的氨基酸组成基本一致，但含量有所差异。甘氨酸的含量是DSNP-5、DSEP-5氨基酸总含量中占比最高的，分别为31.01%、28.91%，且DSNP-5的甘氨酸含量高于DSEP-5的甘氨酸含量，据文献报道甘氨酸与炎症密切关联[23-24]，当LPS刺激机体时，炎症模型中甘氨酸合成减少、含量下降，抗炎的作用机制可能是与受体特异性结合或抑制炎症细胞因子的合成与分泌，由此推测甘氨酸含量的高低与鹿筋蛋白的抗炎效果有一定的关系。
表 3 DSNP-5、DSEP-5的氨基酸组成及含量（¯x±s ，n=3）Table 3. Aminoacid composition and content of DSNP-5 and DSEP-5（¯x±s ，n=3）氨基酸种类 DSNP-5（%） 氨基酸种类 DSEP-5（%） 天冬氨酸（Asp） 5.27±0.033g 天冬氨酸（Asp） 4.76±0.025g 苏氨酸（Thr）* 2.01±0.024l 苏氨酸（Thr）* 1.95±0.016m 丝氨酸（Ser） 4.35±0.011h 丝氨酸（Ser） 4.65±0.019h 谷氨酸（Glu） 8.57±0.017d 谷氨酸（Glu） 8.74±0.024d 甘氨酸（Gly） 31.01±0.013a 甘氨酸（Gly） 28.91±0.018a 丙氨酸（Ala） 10.63±0.028b 丙氨酸（Ala） 12.00±0.014b 半胱氨酸（Cys） 2.64±0.026k 半胱氨酸（Cys） 2.74±0.013k 缬氨酸（Val）* 1.32±0.015o 缬氨酸（Val）* 1.92±0.026n 蛋氨酸（Met）* 0.60±0.023q 蛋氨酸（Met）* 0.67±0.020q 异亮氨酸（Ile）* 1.45±0.011n 异亮氨酸（Ile）* 1.39±0.010p 亮氨酸（Leu）* 2.91±0.019j 亮氨酸（Leu）* 2.82±0.025j 酪氨酸（Tyr） 0.39±0.014r 酪氨酸（Tyr） 0.29±0.022r 苯丙氨酸（Phe）* 1.78±0.020m 苯丙氨酸（Phe）* 2.04±0.017l 赖氨酸（Lys）* 3.34±0.012i 赖氨酸（Lys）* 3.73±0.034i 组氨酸（His） 1.24±0.016p 组氨酸（His） 1.54±0.019o 精氨酸（Arg） 5.67±0.017f 精氨酸（Arg） 6.10±0.011f 脯氨酸（Pro） 10.20±0.031c 脯氨酸（Pro） 9.27±0.021c 羟脯氨酸（Hyp） 6.62±0.020e 羟脯氨酸（Hyp） 6.48±0.027e 必需氨基酸 13.41 必需氨基酸 14.52 总和 100.00 总和 100.00 注：*：表示必需氨基酸。 2.5 DSNP-5和DSEP-5的氨基酸多元统计分析
采用PCA分析法对DSNP-5、DSEP-5所含氨基酸进行分析，所得结果见图3。从图3中可以看出，PCA法可以将DSNP-5和DSEP-5分开，二者存在一定差异，推测可能是由于酶解过程中肽键的断裂造成了氨基酸含量的变化。进一步采用OPLS-DA分析，而OPLS-DA分析的基础为PLS模型的验证，采用排列实验对模型进行验证，在PLS-DA模型参数中R2和Q2分别表示对数据的解释程度和对模型的预测能力，从图4中可以看出，PLS-DA模型排列实验中左端任何一次随机变量y变量产生的R2、Q2值均小于右端的原始值,表明模型有效（R2=0.443, Q2=−0.53）。
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图 3 鹿筋DSNP-5及DSEP-5的PCA分析散点图Figure 3. PCA analysis of DSNP-5 and DSEP-5 for deer sinew![]()
图 4 鹿筋DSNP-5及DSEP-5的PLS-DA模型图Figure 4. PLS-DA model diagram of DSNP-5 and DSEP-5 of deer sinewOPLS-DA分析散点图见图5，OPLS-DA分析可以最大程度地将DSNP-5、DSEP-5分离，并且降低样本的组内差异，更准确地找出二者之间的差异氨基酸。由OPLS-DA分析得到DSNP-5、DSEP-5的VIP值见表4，选取VIP>1，表示其差异性贡献率大于其他组分，找出酶解前后DSNP-5、DSEP-5所含的差异氨基酸分别是Phe、Asp、Pro、Arg、Lys、Gly、Glu、Cys、Ala和Hyp。
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图 5 鹿筋DSNP-5及DSEP-5的OPLS-DA分析散点图Figure 5. OPLS-DA of DSNP-5 and DSEP-5 analyzed scatter plots表 4 DSNP-5、DSEP-5组分基于OPLS-DA分析的VIP值Table 4. VIP results of DSNP-5 and DSEP-5 components based on OPLS-DA analysis氨基酸种类 VIP 氨基酸种类 VIP Phe 1.2366 Hyp 1.0784 Asp 1.2360 Met 0.9240 Pro 1.2230 Leu 0.8795 Arg 1.2058 Tyr 0.8538 Lys 1.1949 Val 0.7961 Gly 1.1271 His 0.7869 Glu 1.1094 Ile 0.7071 Cys 1.0955 Thr 0.5380 Ala 1.0871 Ser 0.3483 通过PCA分析得到了酶解前后DSNP-5、DSEP-5中的特征差异氨基酸，但未能筛选出抑制MH7A细胞活性的氨基酸。故本研究以抑制MH7A细胞炎症因子（NO、IL-6）释放量作为活性指标，应用灰色关联度（GRA）分析和偏最小二乘法（PLS）筛选出鹿筋抑制MH7A细胞分泌NO、IL-6细胞炎症因子的氨基酸。
灰色关联分析的目的是确定参考序列和若干个比较序列之间的关联系数和关联度，寻求系统中各个因素间的主要关系[25]。使用EXCEL对实验数据进行灰色关联分析，将DSNP-5、DSEP-5的氨基酸含量Xi（自变量）设为比较数列（子序列）；MH7A分泌的炎症因子（NO、IL-6）的含量Xo（因变量）设为参考序列（母序列），将对应的数据输入到EXCEL表中，进行灰色关联分析，得到各个氨基酸对抑制MH7A炎症因子分泌活性的贡献程度排名：Lys>Phe>Ser>Arg>Ala>Met>Glu>Leu>Cys>Ile>Val>Thr>His>Gly>Pro>Asp>Hyp>Tyr（NO）；Lys>Arg>Leu>Glu>Ala>Ser>Phe>Ile>Thr>Gly>Cys>Met>Pro>Asp>Hyp>Val>His>Tyr（IL-6）。关联度>0.7时，认为子序列与母序列之间存在一定关联性，结果表明（见表5），Lys、Phe、Ser、Arg、Ala、Met、Glu、Leu、Cys、Ile、Val、Thr、Gly与抑制NO、IL-6含量水平相关，由此可以看出DSNP-5、DSEP-5抑制MH7A分泌炎症因子活性是多种氨基酸共同作用的结果。
表 5 DSNP-5、DSEP-5的氨基酸含量与抗炎指标的关联序和关联度Table 5. Correlation order and correlation degree of amino acid content andanti-inflammatory index of DSNP-5 and DSEP-5关联序 NO含量 IL-6含量 氨基酸种类 关联度 氨基酸种类 关联度 1 Lys 0.8865 Lys 0.9776 2 Phe 0.8861 Arg 0.9657 3 Ser 0.8757 Leu 0.9623 4 Arg 0.8706 Glu 0.9127 5 Ala 0.8462 Ala 0.9109 6 Met 0.8346 Ser 0.8633 7 Glu 0.8237 Phe 0.8613 8 Leu 0.7959 Ile 0.8455 9 Cys 0.7875 Thr 0.8421 10 Ile 0.7560 Gly 0.8129 11 Val 0.7494 Cys 0.7971 12 Thr 0.7489 Met 0.7784 13 His 0.7441 Pro 0.7761 14 Gly 0.7120 Asp 0.7724 15 Pro 0.6834 Hyp 0.7596 16 Asp 0.6816 Val 0.7531 17 Hyp 0.6719 His 0.6529 18 Tyr 0.5932 Tyr 0.6175 偏最小二乘回归法是一种能广泛使用的多元统计分析方法，该方法集多元线性回归分析、主成分分析、典型相关分析基本功能于一体，与其他统计方法相比，具有计算简单、建模效果好、解释性强、预测性较高等优点[26-27]。利用SIMCA-P14.1软件，经过多次提取主成分，多次迭代，拟合出酶解前后DSNP-5、DSEP-5的氨基酸含量与抑制MH7A细胞炎症因子NO、IL-6分泌活性数据之间的数理方程：Y=−0.11230XAsp−0.06724XThr−0.11420XSer+0.03196XGlu−0.10012XGly+0.07324XAla+0.05723XCys+0.01513XMet−0.10235XIle+0.0061XLeu−0.00608XTyr+0.07580XPhe+0.12093XLys+0.03706XVal+0.12401XHis+0.07391XArg−0.07735XPro−0.02773XHyp (NO)；Y=−0.12345XAsp−0.12381XThr+0.04279XSer−0.00482XGlu−0.08449XGly+0.09871XAla−0.04969XCys+0.01149XMet−0.11810XIle−0.11237XLeu−0.04932XTyr+0.07780XPhe+0.08740XLys+0.17387XVal+0.13180XHis+0.07661XArg−0.09188XPro−0.01731XHyp（IL-6）（XAsp～XHyp为氨基酸含量丰度，Y为酶解前后鹿筋抑制MH7A细胞释放炎症因子NO、IL-6的活性）。
相关系数的绝对值大小反映对MH7A细胞炎症因子NO、IL-6分泌活性抑制的贡献程度，绝对值越大，贡献程度越大，相关系数的符号反映与抑制MH7A细胞炎症因子NO、IL-6分泌活性的相关性[28]，由于炎症因子释放量与药效呈负相关，故相关系数为负值的氨基酸是对药效的贡献氨基酸。各氨基酸对抑制MH7A细胞炎症因子NO分泌活性贡献绝对值大小顺序为：His>Lys>Ser>Asp>Ile>Gly>Pro>Phe>Arg>Ala>Thr>Cys>Val>Glu>Hyp>Met>Leu>Tyr，其中Asp、Thr、Gly、Ile、Tyr、Pro、Hyp与活性呈负相关，各氨基酸对抑制MH7A细胞炎症因子IL-6分泌活性贡献绝对值大小顺序为：Val>His>Thr>Asp>Ile>Leu>Ala>Pro>Lys>Gly>Phe>Arg>Cys>Tyr>Ser>Hyp>Met>Glu，其中Asp、Thr、Glu、Gly、Cys、Ile、Leu、Tyr、Pro、Hyp与活性呈负相关，相关系数见表6。
表 6 DSNP-5、DSEP-5的氨基酸含量与抗炎指标的相关系数Table 6. Correlation coefficient of amino acid content andanti-inflammatory index of DSNP-5 and DSEP-5氨基酸种类 NO相关系数 IL-6相关系数 Asp −0.11230 −0.12345 Thr −0.06724 −0.12381 Ser 0.11420 0.04279 Glu 0.03196 −0.00482 Gly −0.10012 −0.08449 Ala 0.07324 0.09871 Cys 0.05723 −0.04969 Met 0.01513 0.01149 Ile −0.10235 −0.11810 Leu 0.00611 −0.11237 Tyr −0.00608 −0.04932 Phe 0.07580 0.07780 Lys 0.12093 0.08740 Val 0.03706 0.17387 His 0.12401 0.13180 Arg 0.07391 0.07661 Pro −0.07735 −0.09188 Hyp −0.02773 −0.01737 综合三种分析方法，多元统计分析VIP值>1，灰色相关度>0.7，与活性呈负相关的特征性氨基酸为Gly。
3. 结论
本实验研究发现DSNP-5、DSEP-5在体外抗炎实验中表现出较强的增殖抑制活性，能够抑制MH7A细胞分泌炎症因子（NO、IL-6），与DSEP-5相比，DSNP-5对细胞增殖及细胞炎症因子分泌的抑制能力更强，具有显著性差异（P<0.05）。将多元统计分析筛选出的特征差异氨基酸（VIP值>1）、PLS（相关系数>0.7）、GRA（活性呈负相关）结果相结合，分析得到Gly是特征差异性成分。DSNP-5的Gly含量（31.01%）高于DSEP-5的Gly含量（28.91%），Gly参与了许多重要生理活性分子的合成，具有抗炎、免疫调节的作用，可通过抑制炎症因子的分泌来降低炎症损伤[29-30]，而在相同浓度下，DSNP-5较DSEP-5抗炎效果好，可能是由于DSNP-5所含的Gly含量更高，具有更好的抗炎效果，但是DSNP-5中的Gly含量的高低与DSNP-5抑制MH7A细胞分泌活性的能力强弱的内在关系尚不清楚，需要进一步研究。
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图 1 DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞NO分泌量的影响
注:不同小写字母表示差异显著，P<0.05；图2同。
Figure 1. Effects of DSNP-5 and DSEP-5 on NO secretion of MH7A cells
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图 2 DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞IL-6分泌量的影响
Figure 2. Effects of DSNP-5 and DSEP-5 on IL-6 secretion in MH7A cells
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图 3 鹿筋DSNP-5及DSEP-5的PCA分析散点图
Figure 3. PCA analysis of DSNP-5 and DSEP-5 for deer sinew
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图 4 鹿筋DSNP-5及DSEP-5的PLS-DA模型图
Figure 4. PLS-DA model diagram of DSNP-5 and DSEP-5 of deer sinew
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图 5 鹿筋DSNP-5及DSEP-5的OPLS-DA分析散点图
Figure 5. OPLS-DA of DSNP-5 and DSEP-5 analyzed scatter plots
表 1 不同超滤组分的DSNP和DSEP对MH7A细胞的增殖抑制作用
Table 1 Inhibitory effect of different ultrafiltration fractions DSNP and DSEP on the proliferation of MH7A cells
组别 A值 增殖抑制率（%） 空白组 0.220±0.07l − TNF-α模型组 1.209±0.011a − DSNP-1 0.592±0.020i 51.03±0.015c DSNP-2 0.651±0.026g 46.15±0.019e DSNP-3 0.728±0.019e 39.78±0.014g DSNP-4 0.697±0.015f 42.35±0.012f DSNP-5 0.520±0.021k 56.99±0.016a DSEP-1 0.636±0.007h 47.39±0.006d DSEP-2 0.731±0.012d 39.54±0.010h DSEP-3 0.826±0.014b 31.70±0.011j DSEP-4 0.754±0.022c 37.64±0.017i DSEP-5 0.572±0.009j 52.68±0.008b 注: 同列不同小写字母表示差异显著，P<0.05；表2、表3同。 
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表 2 不同质量浓度的DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞的增殖抑制作用
Table 2 Inhibitory effects of different concentrations of DSNP-5 and DSEP-5 on the proliferation of MH7A cells
组别 A值 增殖抑制率（%） 空白组 0.236±0.013j − TNF-α模型组 1.223±0.017a − DSNP-5-25 μg/mL 0.688±0.024c 43.74±0.018g DSNP-5-50 μg/mL 0.505±0.015e 58.71±0.012e DSNP-5-100 μg/mL 0.274±0.019i 77.60±0.014a DSNP-5-200 μg/mL 0.445±0.015g 63.61±0.012c DSEP-5-25 μg/mL 0.708±0.020b 42.11±0.015h DSEP-5-50 μg/mL 0.573±0.009d 53.15±0.008f DSEP-5-100 μg/mL 0.391±0.014h 68.03±0.011b DSEP-5-200 μg/mL 0.497±0.007f 59.36±0.006d
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表 3 DSNP-5、DSEP-5的氨基酸组成及含量（
Table 3 Aminoacid composition and content of DSNP-5 and DSEP-5（
氨基酸种类 DSNP-5（%） 氨基酸种类 DSEP-5（%） 天冬氨酸（Asp） 5.27±0.033g 天冬氨酸（Asp） 4.76±0.025g 苏氨酸（Thr）* 2.01±0.024l 苏氨酸（Thr）* 1.95±0.016m 丝氨酸（Ser） 4.35±0.011h 丝氨酸（Ser） 4.65±0.019h 谷氨酸（Glu） 8.57±0.017d 谷氨酸（Glu） 8.74±0.024d 甘氨酸（Gly） 31.01±0.013a 甘氨酸（Gly） 28.91±0.018a 丙氨酸（Ala） 10.63±0.028b 丙氨酸（Ala） 12.00±0.014b 半胱氨酸（Cys） 2.64±0.026k 半胱氨酸（Cys） 2.74±0.013k 缬氨酸（Val）* 1.32±0.015o 缬氨酸（Val）* 1.92±0.026n 蛋氨酸（Met）* 0.60±0.023q 蛋氨酸（Met）* 0.67±0.020q 异亮氨酸（Ile）* 1.45±0.011n 异亮氨酸（Ile）* 1.39±0.010p 亮氨酸（Leu）* 2.91±0.019j 亮氨酸（Leu）* 2.82±0.025j 酪氨酸（Tyr） 0.39±0.014r 酪氨酸（Tyr） 0.29±0.022r 苯丙氨酸（Phe）* 1.78±0.020m 苯丙氨酸（Phe）* 2.04±0.017l 赖氨酸（Lys）* 3.34±0.012i 赖氨酸（Lys）* 3.73±0.034i 组氨酸（His） 1.24±0.016p 组氨酸（His） 1.54±0.019o 精氨酸（Arg） 5.67±0.017f 精氨酸（Arg） 6.10±0.011f 脯氨酸（Pro） 10.20±0.031c 脯氨酸（Pro） 9.27±0.021c 羟脯氨酸（Hyp） 6.62±0.020e 羟脯氨酸（Hyp） 6.48±0.027e 必需氨基酸 13.41 必需氨基酸 14.52 总和 100.00 总和 100.00 注：*：表示必需氨基酸。
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表 4 DSNP-5、DSEP-5组分基于OPLS-DA分析的VIP值
Table 4 VIP results of DSNP-5 and DSEP-5 components based on OPLS-DA analysis
氨基酸种类 VIP 氨基酸种类 VIP Phe 1.2366 Hyp 1.0784 Asp 1.2360 Met 0.9240 Pro 1.2230 Leu 0.8795 Arg 1.2058 Tyr 0.8538 Lys 1.1949 Val 0.7961 Gly 1.1271 His 0.7869 Glu 1.1094 Ile 0.7071 Cys 1.0955 Thr 0.5380 Ala 1.0871 Ser 0.3483
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表 5 DSNP-5、DSEP-5的氨基酸含量与抗炎指标的关联序和关联度
Table 5 Correlation order and correlation degree of amino acid content andanti-inflammatory index of DSNP-5 and DSEP-5
关联序 NO含量 IL-6含量 氨基酸种类 关联度 氨基酸种类 关联度 1 Lys 0.8865 Lys 0.9776 2 Phe 0.8861 Arg 0.9657 3 Ser 0.8757 Leu 0.9623 4 Arg 0.8706 Glu 0.9127 5 Ala 0.8462 Ala 0.9109 6 Met 0.8346 Ser 0.8633 7 Glu 0.8237 Phe 0.8613 8 Leu 0.7959 Ile 0.8455 9 Cys 0.7875 Thr 0.8421 10 Ile 0.7560 Gly 0.8129 11 Val 0.7494 Cys 0.7971 12 Thr 0.7489 Met 0.7784 13 His 0.7441 Pro 0.7761 14 Gly 0.7120 Asp 0.7724 15 Pro 0.6834 Hyp 0.7596 16 Asp 0.6816 Val 0.7531 17 Hyp 0.6719 His 0.6529 18 Tyr 0.5932 Tyr 0.6175
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表 6 DSNP-5、DSEP-5的氨基酸含量与抗炎指标的相关系数
Table 6 Correlation coefficient of amino acid content andanti-inflammatory index of DSNP-5 and DSEP-5
氨基酸种类 NO相关系数 IL-6相关系数 Asp −0.11230 −0.12345 Thr −0.06724 −0.12381 Ser 0.11420 0.04279 Glu 0.03196 −0.00482 Gly −0.10012 −0.08449 Ala 0.07324 0.09871 Cys 0.05723 −0.04969 Met 0.01513 0.01149 Ile −0.10235 −0.11810 Leu 0.00611 −0.11237 Tyr −0.00608 −0.04932 Phe 0.07580 0.07780 Lys 0.12093 0.08740 Val 0.03706 0.17387 His 0.12401 0.13180 Arg 0.07391 0.07661 Pro −0.07735 −0.09188 Hyp −0.02773 −0.01737
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