不同贮藏温度下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长预测模型的建立

陈雨; 梁莹; 周萍萍; 任建鸾; 杨捷琳; 郭德华; 薛峰; 蒋原; 汤芳; 戴建君

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2020110003

不同贮藏温度下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长预测模型的建立

陈雨^1,,
梁莹¹,
周萍萍²,
任建鸾¹,
杨捷琳³,
郭德华³,
薛峰^1, ,,
蒋原^{1, 3},
汤芳¹,
戴建君^{1, 4}

1.
南京农业大学，动物健康与食品安全国际合作实验室，江苏南京 210095
2.
国家食品安全风险评估中心，北京 100022
3.
上海海关动植物与食品检测中心，上海 200135
4.
中国药科大学，江苏南京 211199

基金项目: 国家重点研发计划（2018YFC1603605）

详细信息

作者简介:
陈雨（1996−），女，硕士研究生，研究方向：食源性病原菌预测模型研究，E-mail：1146814740@qq.com

通讯作者:
薛峰（1978−），男，博士，教授，研究方向：人畜共患病病原微生物研究，E-mail：xuefeng@njau.edu.cn

中图分类号: TS201.3
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出版历程
- 收稿日期: 2020-11-02
- 网络出版日期: 2021-04-20
- 刊出日期: 2021-06-14

Establishment of Growth Prediction Model of Escherichia coli in Imported Fresh Beef at Different Temperatures

1.
International Laboratory of Animal Health and Food Safety, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
2.
National Food Safety Risk Assessment Center, Beijing 100022, China
3.
Shanghai Customs Animal, Plant And Food Testing Center, Shanghai 200135, China
4.
China Pharmaceutical University, Nanjing 211199, China

摘要

摘要: 为了建立不同温度条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌O157:H7的生长预测模型。将于超市购买的进口生鲜牛肉和大肠杆菌O157:H7作为研究对象，监测其在4、16、25、30、37 ℃贮藏温度条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长数据，绘制生长曲线，采用修正Gompertz、Logistic、Richards、MMF四种模型进行拟合，建立进口生鲜牛肉中大肠杆菌一级模型，将一级模型拟合的数据代入Ratkowsky方程建立二级模型，通过准确因子、偏差因子以及均方根误差，对模型的准确性进行检验。结果表明，四种模型拟合后得到的相关系数均为0.98以上，修正Gompertz模型数据表明该模型拟合程度最好，最适合预测大肠杆菌在进口生鲜牛肉上的生长动态，模型的准确因子均为0.99，偏差因子为1.14和1.03，决定系数R²为0.97和0.99，说明所建立的模型可靠性较高。本研究建立的生长预测模型能够有效预测4~37 ℃不同温度条件下大肠杆菌O157:H7在进口生鲜牛肉上的生长情况。
- 大肠杆菌O157:H7 /
- 进口 /
- 生鲜牛肉 /
- 贮藏温度 /
- 生长预测模型
Abstract: In order to establish the growth prediction model of Escherichia coli O157:H7 in imported fresh beef at different temperatures. Fresh imported beef purchased from supermarkets and Escherichia coli O157:H7 were selected as the research objects. The growth data of Escherichia coli in imported fresh beef stored at 4, 16, 25, 30 and 37 ℃ were monitored and the growth curve was drawn. Four models of modified Gompertz, Logistic, Richards and MMF were used to fit the growth curve, and the first-order model of Escherichia coli in imported fresh beef was established. The data fitted by the first-order model was substituted into Ratkowsky equation to establish the second-order model. The accuracy of the model was tested by the accuracy factor, bias factor and root mean square error. Results showed that, the correlation coefficients of the four models were all above 0.98. The data of modified Gompertz model showed that the fitting degree of the modified Gompertz model was the best, and it was most suitable to predict the growth dynamics of E.coli in imported fresh beef. The accuracy factors of the models were 0.99, the bias factors were 1.14 and 1.03, and the determination coefficients R² were 0.97 and 0.99, indicating that the established model was highly reliable. The growth prediction model established in this study could effectively predict the growth of Escherichia coliO157:H7 in imported fresh beef at 4~37 ℃.
- Escherichia coli O157:H7 /
- imports /
- fresh beef /
- storage temperature /
- growth prediction model

HTML全文

大肠杆菌（Escherichia coli）是属肠杆菌科的杆状革兰氏阴性食源性病原菌，大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E. coli，EHEC）中最常见的血清型，它的重要宿主是牛^[1]，可通过饮用受污染的水或进食未熟透的食物传染给人类^[2]，主要栖息在包括人类在内的温血动物的下肠道，经常被用作评估水质和食品的粪便污染指示细菌^[3]，能够在恶劣的环境条件下和冷藏温度下生存，在许多国家都引发了严重的食源性疾病^[4-6]，全球每年由于食源性或水源性腹泻导致约220万人死亡，由大肠杆菌所引起的疾病严重危害着人们的身体健康，已经成为了最重要的世界性卫生疾病问题之一^[7]。

生牛肉中含有丰富的营养物质，随着我国居民生活水平不断提高，人们对于牛肉营养丰富意识加深，结合非洲猪瘟爆发以来，更多人选择牛肉来代替猪肉食用，然而受饲养周期长、饲养成本高等因素影响，国内牛肉产量远不能满足居民消费需求，进口牛肉口感好营养丰富价格低，所以我国长期依靠大量进口来弥补国内牛肉产需缺口。但是进口生鲜牛肉可能的污染途径较多，在肉牛养殖环节、屠宰加工环节、运输环节、营销环节，若存放和贮藏方式不当，都可能造成牛肉表面微生物生长繁殖^[8]，引起肉品腐败变质，更有可能引起食源性疾患，按进食场所统计，家庭是食源性疾病发生的主要场所占61.2%^[9]，近些年的监测数据表明，我国牛肉中检测出肠出血性大肠杆菌的几率可达到4.46%^[10-12]，我国市售生肉中存在一定程度的大肠杆菌O157:H7的污染^[13-15]，许多国家在评估生鲜肉安全性时都对大肠杆菌进行标准限量的规定，这说明大肠杆菌在生鲜肉中的重要性，人们越来越重视进口生鲜食品的食用安全问题，所以研究进口生鲜牛肉上微生物的生长规律对于保障生鲜牛肉、乃至食品安全都十分必要。

预测微生物学是建立于微生物生长学、数学模型、统计学和计算机基础上模拟和预测在特定条件下食品微生物的生长和存活的模型的一种新兴学科^[16]，依据食源性微生物在不同关键环节中的特征性数据，它能够通过计算机来进行分析以及处理，建立温度、pH、水分活度等各种环境因素与食源性微生物之间关系的数学模型，从而对快速评估食品安全和预测提高卫生检验效率^[17-18]。

本实验以生鲜牛肉为原料，分别测定在4、16、25、30、37 ℃储藏条件下大肠杆菌的生长数据分别采用Modified Gompertz模型、Logistic模型、Richards模型和MMF模型构建恒定温度下生鲜牛肉中大肠杆菌的生长动力学一级模型，另建立二级模型以描述温度与最大比生长速率（μ_max）和迟滞期（λ）的关系并检验预测模型的准确性，以期为进口生鲜牛肉的定量风险评估提供参考。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌O157:H7（NCTC12900）　南京农业大学人兽共患病实验室；结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）　青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；进口生鲜牛肉　北京华联超市。

BJPX-150生化培养箱美国　Thermo Fisher公司；ZQZY-AS8振荡培养箱　上海知楚仪器有限公司；BagMixer400SW拍击式匀质器　法国Interscienc公司；SW-CJ-2FD超净工作台　苏州安泰空气技术有限公司；GR60DA立式自动压力蒸汽灭菌器　致微（厦门）仪器有限公司；SQP电子天平　赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 悬菌液的制备

将大肠杆菌在VRBA平板划线培养18 h，挑取单个菌落于LB液体培养基中，置于摇床中，37 ℃、180 r/min培养18 h，测定菌液浓度（约10⁷~10⁸cfu/mL），再将菌液用1×PBS缓冲液稀释成浓度为10⁴cfu/mL的悬菌液，备用。

1.2.2 灭菌进口生鲜牛肉的制备

将从超市2 h内新鲜购买的进口生鲜牛肉平铺放置于无菌操作台中，开启紫外光照射20 min后，用无菌镊子翻动牛肉至另一面，继续用紫外光照射20 min。将生牛肉浸入无菌水中处理1 min，用无菌镊子取出牛肉，使用无菌手术刀将灭菌牛肉切成块状（质量约10 g）。

1.2.3 大肠杆菌的接种、培养和计数

将生牛肉放入上述已制备好的大肠杆菌菌悬液中浸泡1 min，每份牛肉均混合均匀后取出沥去多余水分，使牛肉的细菌接种量约为10³cfu/g，将处理好的牛肉分装于匀质袋中，分别置于4、16、25、30、37 ℃恒温培养箱中培养。为了保证实验的准确性，在每个温度下设3组平行试验，每组平行试验在每个取样点设3个重复样品。每隔一定的时间，将实验牛肉块放置到匀质袋中，并加入90 mL 1×PBS缓冲液，用拍击式匀质器拍打5 min；用1×PBS缓冲液经适当的倍比稀释后，取0.1 mL菌悬液在VRBA大肠杆菌计数培养基上进行涂布，将涂布后的培养基放置于37 ℃恒温培养箱中培养18~24 h，用平板计数法计算大肠杆菌数量。

1.2.4 一级模型的建立

利用Origin2019b软件，将在不同温度下进口生鲜牛肉中测得的大肠杆菌生长数据，用Modified Gompertz、Logistic、Richards、MMF 4种模型进行拟合，对4种模型相关系数进行比较，选择出最适合的模型。4种模型的方程表达式见式（1）：

Modified Gompertz模型：

$\mathrm{l}\mathrm{g}({{\rm{N}}}_{{\rm{t}}}/{{\rm{N}}}_{0})={\rm{a}} \times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}({\rm{b}}-{\rm{c}}\times {\rm{t}} \left)\right]$

(1)

式中：N₀表示0时的菌数量，即初始菌数量lg（cfu/g）；N_t表示t时的菌数量lg（cfu/g）；t表示生长时间（h）；exp表示返回e的n次方，e是一个常数为2.71828；a、b、c表示模型参数。

Logistic模型：

$\mathrm{l}\mathrm{g}({{\rm{N}}}_{{\rm{t}}}/{{\rm{N}}}_{0})={\rm{a}}/[1+{\rm{b}}\times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}\mathrm{ }(-{\rm{c}}\times {\rm{t}}\left)\mathrm{ }\right]$

(2)

式中：N₀表示0时的菌数量，即初始菌数量lg（cfu/g）；Nt表示t时的菌数量lg（cfu/g）；t表示生长时间（h）；exp表示返回e的n次方，e是一个常数为2.71828；a、b、c表示模型参数。

Richards模型：

$\mathrm{l}\mathrm{g}({{\rm{N}}}_{{\rm{t}}}/{{\rm{N}}}_{0})={{\rm{a}}/\left\{\right[1+\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}\mathrm{ }({\rm{b}}-{\rm{c}}\times {\rm{t}})]}^{1/{\rm{d}}}\}$

(3)

式中：N₀表示0时的菌数量，即初始菌数量lg（cfu/g）；Nt表示t时的菌数量lg（cfu/g）；t表示生长时间（h）；exp表示返回e的n次方，e是一个常数为2.71828；a、b、c、d表示模型参数。

MMF模型：

$\mathrm{l}\mathrm{g}({{\rm{N}}}_{{\rm{t}}}/{{\rm{N}}}_{0})=({\rm{a}}\times {\rm{b}} + {\rm{c}}\times {{\rm{t}}}^{{\rm{d}}}) / ({\rm{b}} +{{\rm{t}}}^{{\rm{d}}})$

(4)

式中：N₀表示0时的菌数量，即初始菌数量lg（cfu/g）；Nt表示t时的菌数量lg（cfu/g）；t表示生长时间（h）；a、b、c、d表示模型参数。

根据一级模型所得模型参数可计算大肠杆菌在进口生鲜牛肉中最大比生长速率（μ_max）和延滞期（λ）：

${\mu }_{{\rm{max}}}=\frac{{\rm{a}}\times {\rm{c}}}{{\rm{e}}}$

(5)

$\lambda =\frac{{\rm{b}}-1}{{\rm{c}}}$

(6)

式中：μ_max表示细菌最大比生长速率（h⁻¹）；λ表示细菌生长迟滞期持续时间（h）；a、b、c表示模型参数。

1.2.5 二级模型的建立

根据一级模型得到的最大比生长速率（μ_max）和延滞期（λ）与温度的关系，选取Ratkowsky提出的经典的平方根方程^[19]建立二级模型，方程式如下：

$\sqrt{{\text{μ}}_{\text{max}}}=\text{b}\left(\text{T}-{\text{T}}_{\text{min}}\right)$

(7)

$\sqrt{\text{1/}\text{λ}}={\rm{b}}\left(\text{T}-{\text{T}}_{\text{min}}\right)$

(8)

式中：μ_max表示细菌最大比生长速率（h⁻¹）；λ表示细菌生长迟滞期持续时间（h）；T为实验设置的生长温度（℃）；T_min为假设大肠杆菌O157:H7生长速率为零时的温度（℃）；b为回归参数。

1.2.6 模型检验

本试验采用准确因子（Accuracy factor，A_f）、偏差因子（Bias factor，B_f）及均方根误差（RMSE）对所得模型的可靠性进行检验。

${\rm{RMSE}}=\sqrt{\frac{{\sum ({\mu }_{{\rm{obs}}}-{\mu }_{{\rm{pred}}})}^{2}}{{\rm{n}}}}$

(9)

${{\rm{B}}}_{{\rm{f}}}={10}^{\sum }\mathrm{lg}\left(\frac{{\mu }_{{\rm{pred}}}}{{\mu }_{{\rm{obs}}}}\right)/\mathrm{n}$

(10)

${{\rm{A}}}_{{\rm{f}}}={10}^{\sum }\left|\mathrm{lg}\left(\frac{{\mu }_{{\rm{pred}}}}{{\mu }_{{\rm{obs}}}}\right)\right|/\mathrm{n}$

(11)

式中：μ_obs表示根据细菌计数所得观测值；μ_pred表示根据模型计算所得预测值；n表示实验次数；均方根误差（RMSE）表示实验观测值和模型预测值之间的差距，RMSE越小，说明模型拟合效果越好；准确因子（A_f）表明预测值周围的分布情况，A_f越接近1，说明模型越准确；偏差因子（B_f）表明细菌生长预测值和观测值的相对平均偏差，B_f越接近1，说明模型越准确。

1.3 数据处理

每组实验重复3次，取平均值。用Excel进行数据记录以及统计分析，利用Origin 2019b进行模型拟合。

2. 结果与分析

2.1 不同温度下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长变化

温度是影响环境中大肠杆菌存活和生长的重要因素，大肠杆菌可以在最佳生长条件36~40 ℃下快速生长^[20]，Whitman等^[21]的研究表明大肠杆菌可在4 ℃的密封塑料袋中储存的晒干藻垫中存活了6个月以上。由图1可知，4 ℃贮藏条件下，进口生鲜牛肉中大肠杆菌数量随着贮藏时间的延长而小幅度增加，大肠杆菌在4 ℃条件下能较好地存活，说明它是一种耐冷性细菌，在16~37 ℃贮藏条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长较好，随着温度逐渐升高到37 ℃，大肠杆菌生长速率逐渐增加达到稳定期和最大菌量时所用时间均减少。结果表明温度对大肠杆菌的生长具有较大影响，说明进口生鲜牛肉在屠宰加工环节、运输环节、营销环节对于温度严格控制十分重要。

图 1 不同温度下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长曲线

Figure 1. Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at different temperatures

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2.2 一级模型的建立

将大肠杆菌在不同恒定温度下的实验数据导入Origin 2019b软件，利用Modified Gompertz、Logistic、Richards、MMF 4种模型求得的预测结果，得到了在4、16、25、30、37 ℃条件下实测和拟合曲线可以看出大肠杆菌在不同温度下的生长趋势，如图2~图5所示，分别利用Modified Gompertz、Logistic、Richards、MMF 4种模型得到的拟合曲线与实测值曲线吻合程度较高，可以初步判断四种模型能较好的拟合进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长动态。

图 2 Modified Gompertz模型拟合的 4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线

Figure 2. Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4, 16, 25, 30 and 37 ℃ fitted by modified Gompertz model

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图 3 Logistic模型拟合的4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线

Figure 3. Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4, 16, 25, 30, 37 ℃ fitted by Logistic model

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图 4 MMF模型拟合的4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线

Figure 4. Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4, 16, 25, 30, 37 ℃ fitted by MMF model

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图 5 Richards模型拟合的4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线

Figure 5. Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4, 16, 25, 30, 37 ℃ fitted by Richards model

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使用4种方程对4、16、25、30、37 ℃进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长情况进行非线性拟合，并由此得到相应模型的拟合参数如表1所示。由表1可知，在上述4种方程拟合得到的决定系数R²均在0.97以上，表明4种方程均能较好地描述4~37 ℃温度储存条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长动态。通过比较4种模型方程R²和RMSE可知，Modified Gompertz模型的决定系数R²均较高，分别为0.98、0.99、0.99、0.99和0.98，RMSE相对较小，分别为0.04、0.30、0.18、0.22和0.28，方程拟合性最好，说明Modified Gompertz模型最适合用来拟合进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长情况，拟合得到的最适一级生长动力学模型见表2。

表 1 大肠杆菌在不同温度条件下进口生鲜牛肉中进行4种模型拟合的决定系数（R²）和均方根误差（RMSE）

Table 1. Determination coefficient (R²) and Root-mean-square error (RMSE) of four model fitting methods for E. coli imported raw beef at different temperatures

模型名称	参数	培养温度（℃）
模型名称	参数	4	16	25	30	37
Modified Gompertz	R²	0.98	0.99	0.99	0.99	0.98
Modified Gompertz	RMSE	0.04	0.30	0.18	0.22	0.28
Logistic	R²	0.98	0.97	1.00	0.99	0.98
Logistic	RMSE	0.05	0.42	0.13	0.24	0.32
Richards	R²	0.98	0.98	1.00	0.99	0.98
Richards	RMSE	0.05	0.32	0.14	0.22	0.30
MMF	R²	0.97	1.00	0.99	0.99	0.98
MMF	RMSE	0.05	0.17	0.19	0.23	0.30

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表 2 进口生鲜牛肉中大肠杆菌的最适一级生长动力学模型

Table 2. Optimal first-order growth kinetics model of E. coli in imported raw beef

温度（℃）	最适一级生长模型
4	lg(N_t/N₀)=0.83 exp(−exp(1.50−0.03 t))
16	lg(N_t/N₀)=6.47 exp(−exp(1.30−0.08 t))
25	lg(N_t/N₀)=5.66 exp(−exp(1.65−0.34 t))
30	lg(N_t/N₀)=6.73 exp(−exp(1.51−0.36 t))
37	lg(N_t/N₀)=6.10 exp(−exp(1.46−0.48 t))

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Modified Gompertz模型拟合本实验中4、16、25、30和37 ℃进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长情况，并由此得到相应模型的拟合参数如表3所示。由表3可知，当储存温度为4、16、25、30、37 ℃时，进口生鲜牛肉中的大肠杆菌的迟滞期分别为16.53、3.75、1.91、1.41、0.95 h，最大比生长速率分别达到0.01、0.19、0.71、0.90、1.08 h⁻¹。结果表明，随着温度的增加，大肠杆菌在进口生鲜牛肉中的μ_max值呈上升趋势，λ值呈下降趋势，说明温度对进口生鲜牛肉中大肠杆菌的λ和μ_max影响均较大。

表 3 进口生鲜牛肉中大肠杆菌Modified Gompertz模型的拟合参数

Table 3. Fitting parameters of Modified Gompertz model of Escherichia coli in imported raw beef

温度（℃）	a	b	c	μ_max（h⁻¹）	λ（h）
4	0.83	1.50	0.03	0.01	16.53
16	6.47	1.30	0.08	0.19	3.75
25	5.66	1.65	0.34	0.71	1.91
30	6.73	1.51	0.36	0.90	1.42
37	6.10	1.46	0.48	1.08	0.95

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2.3 二级模型的建立

二级模型可描述温度变化对微生物生长动力学参数的影响，因此选用Ratkowsky平方根模型作为二级模型，根据Modified Gompertz模型拟合得到的μ_max和λ，应用Origin2019b软件分别对温度与μ_max和λ之间的关系进行拟合，拟合结果如图6、图7所示。由图6、图7知，平方根模型拟合的温度与 $\sqrt{{\mu }_{\text{max}}}$ 和 $\sqrt{\text{1/}\text{λ}}$ 均呈现良好的线性关系，说明该模型能够很好地描述进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长参数与温度之间的关系。

图 6 平方根模型拟合的进口生鲜牛肉中大肠杆菌最大比生长速率与生长温度的关系曲线

Figure 6. Relation curve between the maximum specific growth rate of E. coli and the growth temperature in imported fresh beef fitted by the square root model

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图 7 平方根模型拟合的进口生鲜牛肉中大肠杆菌迟滞期与生长温度的关系曲线

Figure 7. Relationship curve between the hysteresis period and growth temperature of E. coli in imported fresh beef fitted by the square root model

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2.4 二级模型的可靠性评价

本文主要是对数学模型参数进行评价，采用决定系数（R²）、均方根误差（RMSE）、偏差因子（B_f）、准确因子（A_f）四种参数对所建立的平方根模型的可靠性进行评价，结果见表4。根据对偏差因子（B_f）和准确因子（A_f）的划分标准，若B_f值在0.90~1.05之间，A_f值在1.01~1.15之间，表明模型可以被接受。B_f和A_f值越接近于1，模型可靠性越高；R²越接近于1，模型的拟合度越优；均方根误差（RMSE）越小，所建模型越可靠。

表 4 二级模型的评价

Table 4. Evaluation of the secondary model

生长参数	方程	R²	RMSE	B_f	A_f
μ_max	$\sqrt{ {\mu }_{{\rm{max}}} }=0.03（T-0.32）$	0.97	0.08	0.99	1.14
λ	$\sqrt{1/\lambda }=0.02(T+6.8)$	0.99	0.01	0.99	1.03

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由表4可知，平方根模型的R²分别为0.97、0.99，均较高，预测值和观察值的均方根误差（RMSE）分别为0.08、0.01，误差均较小，在对进口生鲜牛肉中大肠杆菌温度与最大比生长速率（μ_max）之间的关系进行平方根模型的拟合时B_f为0.99，A_f为1.14，在拟合温度与入之间的关系曲线中，大肠杆菌进行平方根模型拟合的B_f为0.99，A_f为1.03，平方根模型的B_f和A_f值均接近于1。可见选用的平方根模型对温度与 $\sqrt{{\mu }_{\text{max}}}$ 和 $\sqrt{\lambda }$ 之间的拟合度较高，拟合得到的二级模型可靠性高，因此上述温度条件下建立的二级模型能够被接受。

3. 讨论与结论

近些年随着食源性疾病爆发率逐渐增高，美国愈发重视国家食品安全，并且逐渐加强对于药品生产质量管理规范（Good Manufacturing Practices，GMP）以及最终检测制度的管理，至1996年，美国农业部发起所有肉类和畜禽产品在生产加工过程中实施危害分析关键控制点（Hazard Analysis Critical Control Point，HACCP）体系来定量风险评估确保产品安全的建议；并从2000年起强调，所有的屠宰与加工厂都必须强制实施HACCP食品安全规划^[22]，表明建立快速监测食品中食源性微生物生长繁殖规律的方法十分重要。

进口生鲜牛肉在运输、储藏和销售过程中要经历更长的时间、更多的温度波动变化，许多研究表明，大肠杆菌是引起牛肉腐败的重要食源性微生物，进口牛肉在运输过程中稍有不慎就可能变质滋生腐败菌，从而导致食源性疾病。如今国民对于进口生鲜牛肉的需求量越来越高，目前对进口生鲜牛肉上大肠杆菌的生长预测模型研究报道较少。本实验选取实际中可能出现的温度变化范围4~37 ℃，此温度范围内建立的大肠杆菌在进口生鲜牛肉中的生长预测模型具有实际意义，故研究大肠杆菌在进口生鲜牛肉上的生长规律并用不同模型模拟其生长情况，建立大肠杆菌在进口生鲜牛肉上的生长模型，不仅能对掌握大肠杆菌在进口生鲜牛肉的生长繁殖规律以及为进口生鲜牛肉的贮藏保鲜提供科学依据，对于保护人类生命健康安全也至关重要。日后对于波动温度变化下进口生牛肉的生长动态变化值得进一步研究。

近年国内外对牛肉中预测微生物方面的研究范围很广，研究对象大多是致使食品腐败变质的腐败菌或者危害人体健康的的致病菌。Yu等^[23]建立了各种包装下生牛肉中金黄色葡萄球菌的预测模型，Li等^[24]研究了真空包装的生牛肉中乳酸菌的生长，Juneja等^[25]建立不同环境条件下生碎牛肉中沙门氏菌的生长模型。这些实验结果与本实验相同均表明腐败菌能在牛肉中很好地生长。国内外对大肠杆菌生长预测模型的研究主要针对猪肉、蛋类和乳制品，金鑫等^[26]建立了猪背最长肌上大肠杆菌和假单胞菌的预测模型，赵格等^[27]在不同温度下以Modified Gompertz模型拟合致病性大肠杆菌等三种菌在蛋内的生长曲线，以上实验结果与本文均相同，表明Modified Gompertz模型能很好地模拟不同温度下致病菌的生长情况，说明建立的生长预测模型能很好地反映食品中食源性微生物的生长动态变化情况。大肠杆菌的生长动力学模型至今很多文献已有报道^[28-31]，许多研究选用Modified Gompertz模型建立一级模型，求得模型参数计算出最大比生长速率（μ_max）和迟滞期（λ），再利用平方根模型建立二级模型。因此，本实验对于4种模型的各项相关系数进行对比，选择拟合效果最好的Modified Gompertz模型作为一级模型，利用Ratkowsy平方根方程作为二级模型。应用Modified Gompertz模型建立了4~37 ℃不同贮藏温度条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长预测模型，求得决定系数R²均大于0.97，RMSE均较小，表明该方程能很好地描述不同温度下大肠杆菌在进口生鲜牛肉中的生长动态，温度对最大比生长速率（μ_max）和迟滞期（λ）的影响采用平方根模型进行描述，其R²分别为0.97和0.99，呈现良好的线性关系，且对模型进行验证得出偏差因子（B_f）为0.99和0.99，准确因子（A_f）为1.14和1.03，说明该模型能有效预测进口生鲜牛肉中大肠杆菌在4~37 ℃范围内的生长情况。

综上所述，本研究所建立的大肠杆菌生长动力学模型可以快速可靠地实时预测大肠杆菌在牛肉中的生长动态，可以为进口生鲜牛肉中大肠杆菌污染时的预测和监控提供有效的工具，以提高产品的安全性。

图 1 不同温度下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长曲线

Figure 1. Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at different temperatures

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图 2 Modified Gompertz模型拟合的 4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线

Figure 2. Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4, 16, 25, 30 and 37 ℃ fitted by modified Gompertz model

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图 3 Logistic模型拟合的4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线

Figure 3. Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4, 16, 25, 30, 37 ℃ fitted by Logistic model

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图 4 MMF模型拟合的4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线

Figure 4. Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4, 16, 25, 30, 37 ℃ fitted by MMF model

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图 5 Richards模型拟合的4、16、25、30、37 ℃下进口生鲜牛肉中大肠杆菌的生长曲线

Figure 5. Growth curve of Escherichia coli in imported fresh beef at 4, 16, 25, 30, 37 ℃ fitted by Richards model

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图 6 平方根模型拟合的进口生鲜牛肉中大肠杆菌最大比生长速率与生长温度的关系曲线

Figure 6. Relation curve between the maximum specific growth rate of E. coli and the growth temperature in imported fresh beef fitted by the square root model

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图 7 平方根模型拟合的进口生鲜牛肉中大肠杆菌迟滞期与生长温度的关系曲线

Figure 7. Relationship curve between the hysteresis period and growth temperature of E. coli in imported fresh beef fitted by the square root model

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表 1 大肠杆菌在不同温度条件下进口生鲜牛肉中进行4种模型拟合的决定系数（R²）和均方根误差（RMSE）

Table 1 Determination coefficient (R²) and Root-mean-square error (RMSE) of four model fitting methods for E. coli imported raw beef at different temperatures

模型名称	参数	培养温度（℃）
模型名称	参数	4	16	25	30	37
Modified Gompertz	R²	0.98	0.99	0.99	0.99	0.98
Modified Gompertz	RMSE	0.04	0.30	0.18	0.22	0.28
Logistic	R²	0.98	0.97	1.00	0.99	0.98
Logistic	RMSE	0.05	0.42	0.13	0.24	0.32
Richards	R²	0.98	0.98	1.00	0.99	0.98
Richards	RMSE	0.05	0.32	0.14	0.22	0.30
MMF	R²	0.97	1.00	0.99	0.99	0.98
MMF	RMSE	0.05	0.17	0.19	0.23	0.30

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表 2 进口生鲜牛肉中大肠杆菌的最适一级生长动力学模型

Table 2 Optimal first-order growth kinetics model of E. coli in imported raw beef

温度（℃）	最适一级生长模型
4	lg(N_t/N₀)=0.83 exp(−exp(1.50−0.03 t))
16	lg(N_t/N₀)=6.47 exp(−exp(1.30−0.08 t))
25	lg(N_t/N₀)=5.66 exp(−exp(1.65−0.34 t))
30	lg(N_t/N₀)=6.73 exp(−exp(1.51−0.36 t))
37	lg(N_t/N₀)=6.10 exp(−exp(1.46−0.48 t))

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表 3 进口生鲜牛肉中大肠杆菌Modified Gompertz模型的拟合参数

Table 3 Fitting parameters of Modified Gompertz model of Escherichia coli in imported raw beef

温度（℃）	a	b	c	μ_max（h⁻¹）	λ（h）
4	0.83	1.50	0.03	0.01	16.53
16	6.47	1.30	0.08	0.19	3.75
25	5.66	1.65	0.34	0.71	1.91
30	6.73	1.51	0.36	0.90	1.42
37	6.10	1.46	0.48	1.08	0.95

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表 4 二级模型的评价

Table 4 Evaluation of the secondary model

生长参数	方程	R²	RMSE	B_f	A_f
μ_max	$\sqrt{ {\mu }_{{\rm{max}}} }=0.03（T-0.32）$	0.97	0.08	0.99	1.14
λ	$\sqrt{1/\lambda }=0.02(T+6.8)$	0.99	0.01	0.99	1.03

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