Optimization of Extraction Technology of Polysaccharides from Meitan White Tea and Its Antibacterial Activity
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摘要: 本文以湄潭白茶为对象，研究其多糖的提取工艺条件及体外抑菌活性。考察提取温度、提取时间、料液比3个因素对多糖得率的影响，并通过正交试验确定其最佳提取参数：提取温度90 ℃、提取时间4 h、料液比1:20 g/mL，在此条件下湄潭白茶多糖得率为1.163%±0.011%。体外抑菌活性试验结果表明：湄潭白茶多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌均具有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制活性最强，其最低抑菌浓度MIC为3.125 mg/mL。研究成果将为湄潭白茶多糖的进一步研究及新产品开发提供理论指导。Abstract: In the study, the extraction conditions and antibacterial activities of polysaccharides from Meitan white tea were studied. The effects of extraction temperature, extraction time and solid-liquid ratio on the polysaccharide yield were investigated. The optimum extraction parameters were determined by orthogonal test, which the extraction temperature was 90 ℃ for 4 h, and solid-liquid ratio 1:20 g/mL. Under these conditions, the polysaccharide yield of Meitan white tea was 1.163%±0.011%. The antibacterial activity test showed that Meitan white tea polysaccharide had inhibitory effects on Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans, which the inhibitory activity was the strongest against Staphylococcus aureus, MIC was 3.125 mg/mL. The research results provide theoretical guidance for further research and new product development of Meitan white tea polysaccharide.
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Keywords:
- Meitan white tea /
- polysaccharides /
- extraction technology /
- antibacterial activity
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白茶（White tea）属于我国传统六大茶类之一，因其独特的制作工艺，具有外形自然、满披白毫、毫香清鲜、汤色清澈、滋味清淡回甘等品质特点[1]。白茶主要产自我国福建、云南、贵州等地，以其清甜鲜爽的口感及清热解毒、调节血脂等保健功效广受消费者认可[2-4]。因其自然的制作工艺，白茶除含有常见的茶多酚、氨基酸、咖啡碱等活性成分外，还含有多糖类活性物质[5]。多糖（polysaccharides）是由单糖连接形成的大分子物质，具有降血糖、降血脂、提高免疫力和抗肿瘤等功能[6-10]，是部分天然食品提高免疫力、发挥保健功能的物质基础之一[11-12]。Wang 、Chen等[13-14]对粗茶中多糖成分进行了提取分离，所得多糖具有抗氧化、清除自由基或保护人血管内皮细胞损伤的作用，说明茶多糖在调节人体机能方面具有重要药理活性，为研究茶叶成分的药理作用及茶多糖产品的开发提供了可能。
贵州省湄潭县因其具有海拔高、纬度低、云雾多、日照少等独特的地理条件，形成了集中种茶、专业制茶、统一交易及销售等一系列的茶产业科学发展路线，目前当地茶产品制作与加工已覆盖到六大茶类，具有较好的综合经济效益[15-16]。本研究以湄潭白茶为对象，探讨湄潭白茶提取工艺中料液比、提取时间、提取温度与多糖得率的关系，利用正交试验确定提取最优条件，并对湄潭白茶多糖抑菌活性进行了测定，以期为湄潭白茶的应用开发提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
白茶 购于贵州省湄潭县沁园春茶业；苯酚、浓硫酸、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇、无水葡萄糖（均为分析纯） 购自成都化学试剂厂；供试菌种：金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）CMCC26003、大肠杆菌（ Escherichia coli ）CMCC44102、铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa ）CMCC10104、白色念珠菌（ Candida Albicans ）CMCC98001 由遵义医科大学微生物与免疫学实验室保存。
BCM-1000A超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；HH·W21·600S恒温水浴锅 上海跃进医疗器械有限公司；TD5M-WS高速离心机 上海卢湘仪；101-2AB电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；HH-B11·600BY电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械有限公司；LGJ-10D真空冷冻干燥机 四环科仪（天津）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 湄潭白茶样品预处理及多糖提取
将茶叶在55 ℃下烘至恒重，粉碎过筛（40目），置于干燥器内保存。准确称取一定质量白茶粉末，在合适的料液比、温度、时间条件下提取，离心得到粗多糖提取液。向提取液中加入等体积Sevage试剂（氯仿:正丁醇=4:1，mL/mL），震荡混匀，静置20 min，收集上清液，即为脱蛋白的多糖提取液[17-18]。再向上述提取液中加入4倍体积的无水乙醇，4 ℃静置24 h。4000 r/min离心并收集醇沉物质，经真空冷冻干燥处理，得湄潭白茶多糖样品[19]。
1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 料液比对提取率的影响
称取1.0 g白茶粉（40目）于三角瓶中，加入蒸馏水（料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL），设置水浴温度80 ℃，提取时间3 h，考察料液比与湄潭白茶多糖得率的关系。
1.2.2.2 提取温度对提取率的影响
称取1.0 g白茶粉（40目）于三角瓶中，加入料液比1:20 g/mL蒸馏水，设置提取时间3 h，改变水浴温度为60、70、80、90、100 ℃，考察提取温度与湄潭白茶多糖得率的关系。
1.2.2.3 提取时间对提取率的影响
取1.0 g白茶粉（40目）于三角瓶中，固定80 ℃的提取温度，1:20 g/mL的料液比条件，分别提取1、2、3、4、5 h，考察提取时间与湄潭白茶多糖得率的关系。
1.2.3 正交优化试验设计
在单因素实验的基础上，以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）为影响因素，多糖提取率为指标进行正交试验[20-21]，确定最佳提取工艺参数，其因素水平表见表1。
表 1 湄潭白茶多糖正交试验因素水平设计Table 1. Levels and factors in orthogonal test of Meitan white tea polysaccharide水平 因素 A提取温度（℃） B提取时间（h） C 料液比（g/mL） 1 80 2 1:15 2 90 3 1:20 3 100 4 1:25 1.2.4 湄潭白茶多糖得率的计算
1.2.4.1 绘制标准曲线
采用苯酚-硫酸法测定[22]。标准物质为无水葡萄糖，配制成浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 mg/mL标准溶液，于490 nm测定吸光值。以吸光度（A）为纵坐标、葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为y=2.927x±0.052，R2=0.996，所得标准曲线具有统计学意义。
1.2.4.2 多糖得率的计算
将多糖样品加蒸馏水溶解，稀释100倍后参照标准曲线测定方法测定多糖吸光度，并根据公式(1)计算湄潭白茶多糖的得率：
W(%)=c×D×Vm×100 (1) 式中：W表示湄潭白茶多糖得率，%；c表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度，mg/mL；D表示溶液稀释倍数；V表示多糖溶液体积，mL；m表示白茶取样量，mg。
1.2.5 湄潭白茶多糖抑菌活性研究
1.2.5.1 多糖溶液及供试菌液制备
按最佳工艺方案提取湄潭白茶多糖，配制成浓度为100 mg/mL的多糖溶液，过滤除菌后保存备用。供试菌单菌落接种于营养肉汤培养基中，37 ℃培养12~18 h，调整细菌密度为106 cfu/mL。
1.2.5.2 茶多糖对供试菌株抑菌活性测定
取50 μL供试菌液均匀涂布于营养琼脂平板，将已高压灭菌的牛津杯放置其上，分别加入50 μL待检溶液。实验组：100 mg/mL多糖溶液；阳性对照组：10 μg/mL环丙沙星；阴性对照组：无菌蒸馏水。37 ℃培养18~24 h，观察并记录结果。
1.2.5.3 茶多糖对供试菌株最低抑菌浓度MIC及最低杀菌浓度MBC测定
将100 μL待检溶液与供试菌液等体积混合。实验组：不同浓度多糖溶液（100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195 mg/mL）；对照组：供试菌液；空白对照组：营养肉汤培养基。37 ℃培养18~24 h，观察并记录结果。以肉眼观察未见细菌生长的最低浓度为MIC；每孔取50 μL溶液均匀涂布于营养琼脂培养基，37 ℃培养箱中培养18~24 h后观察结果，以完全抑制细菌生长的最低浓度为MBC。
1.3 数据处理
每组试验随机重复3次，结果以平均值±标准偏差表示，用Excel 2016 软件进行作图。
2. 结果与分析
2.1 湄潭白茶多糖提取单因素实验
2.1.1 料液比对湄潭白茶多糖提取率的影响
有效成分的提取与料液比有密切关系，充足的溶剂量可保证样品充分浸没和溶质的溶出。如图1所示，随着料液比的增加，多糖得率呈现上升趋势，并在1:25 g/mL时达到最大值。但当料液比超过1:25 g/mL时，多糖得率开始下降。分析原因：在热量一定情况下，固相与液相之间存在浓度差，溶剂量越多，细胞内外的多糖浓度梯度就越大，使多糖扩散到溶剂里的含量增加；但随着溶剂量继续增大，吸附作用增强而导致多糖提取率略有下降[23-24]。因此，湄潭白茶多糖提取料液比为1:25 g/mL比较适合。
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图 1 料液比对湄潭白茶多糖得率的影响Figure 1. Effect of extraction liquid-solid ratio on the Meitan white tea polysaccharide yield rate2.1.2 提取温度对湄潭白茶多糖提取率的影响
如图2所示，当提取温度在50~90 ℃之间，多糖得率呈现上升趋势，并在90 ℃时达最大值，但当温度超过90 ℃后，多糖得率逐渐下降。分析原因：随着温度的升高，溶剂的渗透能力和溶解能力随之提高，多糖分子运动加快，有利于多糖从细胞结构内部溶解析出；但温度过高，料液中多糖分子受到破坏，导致多糖分解，使多糖得率下降[25]。因此，初步确定湄潭白茶多糖提取温度在90 ℃比较适合。
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图 2 提取温度对湄潭白茶多糖得率的影响Figure 2. Effect of extraction temperature on the Meitan white tea polysaccharide yield rate2.1.3 提取时间对湄潭白茶多糖提取率的影响
有效成分的提取与时间有密切关系，充足的时间可保证有效成分充分溶解释放。如图3所示，随着提取时间的延长，多糖得率呈现平缓升高趋势，但提取时间超过4 h后，提取率逐步下降。分析原因：提取时间较短时，产物不能充分溶解；但时间过长，多糖稳定性下降，结构部分易被破坏，影响提取效果[26-27]。因此，初步确定湄潭白茶多糖提取时间在4 h比较适合。
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图 3 提取时间对湄潭白茶多糖得率的影响Figure 3. Effect of extraction time on the Meitan white tea polysaccharide yield rate2.2 正交试验结果
根据单因素实验结果，对提取温度、提取时间及液料比3个因素进行正交试验，以确定最佳提取工艺条件，正交试验安排及结果见表2。分析可知，影响多糖得率的因素中，影响程度依次为：B﹥A﹥C。提取的最佳工艺条件为A2B3C2，即提取温度为90 ℃，提取时间为4 h，料液比1:20 g/mL。
表 2 湄潭白茶多糖提取正交试验结果表Table 2. The orthogonal results of polysaccharide extraction from Meitan white tea试验号 A提取温度 B提取时间 C 料液比 提取率（%） 1 1 1 1 0.45 2 1 2 2 0.74 3 1 3 3 0.68 4 2 1 2 0.72 5 2 2 3 0.67 6 2 3 1 0.87 7 3 1 3 0.64 8 3 2 1 0.78 9 3 3 2 0.67 K1 1.87 1.81 2.1 K2 2.26 2.19 2.13 K3 2.09 2.22 1.99 R 0.39 0.41 0.14 2.3 验证试验
根据正交试验结果得到的最优提取条件（提取温度为90 ℃，提取时间为4 h，料液比1:20 g/mL）提取湄潭白茶多糖。试验重复三次，得到多糖平均得率为1.163%±0.011%。
2.4 湄潭白茶多糖的抑菌活性
2.4.1 湄潭白茶多糖对供试菌株抑菌活性测定
根据药理学实验方法[28]，判定供试菌株对湄潭白茶多糖的敏感性。如表3所示，湄潭白茶多糖对4种供试菌株的抑菌圈直径大小均在11~16 mm范围内，皆表现为中度敏感。其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果最为明显，抑菌圈直径达到15.47±0.12 mm。表明湄潭白茶多糖对革兰氏阳性菌抑制效果显著，而对大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌及真菌的抑制作用相对较弱。
表 3 湄潭白茶多糖抑菌圈直径Table 3. Diameter of inhibition zone of polysaccharides from Meitan white tea菌株 茶多糖抑菌圈直径（mm） 抗生素抑菌圈直径（mm） 无菌水抑菌圈直径（mm） 大肠杆菌 11.13±0.14 35.14±0.13 − 金黄色葡萄球菌 15.47±0.12 25.22±0.09 − 铜绿假单胞菌 11.85±0.13 25.46±0.12 − 白色念珠菌 12.73±0.08 24.33±0.12 − 注：−表示无抑菌圈。 2.4.2 湄潭白茶多糖对供试菌株最低抑菌浓度MIC及最低杀菌浓度MBC测定
湄潭白茶多糖对各供试菌株均有一定的抑制作用，因此，采用适当的多糖稀释浓度对各供试菌株进行敏感实验。如表4所示，湄潭白茶多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌，与抑菌活性结果一致。其中对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度MIC为3.125 mg/mL，最低杀菌浓度MBC为6.25 mg/mL。
表 4 湄潭白茶多糖MIC及MBC测定结果Table 4. MIC and MBC of polysaccharides from Meitan white teaMIC（mg/mL） MBC（mg/mL） 大肠杆菌 25 50 金黄色葡萄球菌 3.125 6.25 铜绿假单胞菌 25 50 白色念珠菌 50 100 3. 结论
通过正交实验优化湄潭白茶多糖提取工艺，研究表明：在提取温度为90 ℃，提取时间为4 h，料液比1:20 g/mL条件下，湄潭白茶多糖最高得率为1.163%±0.011%。抑菌活性试验中，分别探索了湄潭白茶多糖对属于革兰氏阴性菌的大肠杆菌、铜绿假单胞菌，属于革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌和属于真菌的白色念珠菌的抑制作用，确定了其对4种供试菌株的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，说明湄潭白茶多糖具有较好的抑菌能力。本研究为湄潭白茶多糖的综合利用和资源开发提供相关理论支持，对促进湄潭白茶多糖在功能性食品中的应用具有重大意义。
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图 1 料液比对湄潭白茶多糖得率的影响
Figure 1. Effect of extraction liquid-solid ratio on the Meitan white tea polysaccharide yield rate
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图 2 提取温度对湄潭白茶多糖得率的影响
Figure 2. Effect of extraction temperature on the Meitan white tea polysaccharide yield rate
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图 3 提取时间对湄潭白茶多糖得率的影响
Figure 3. Effect of extraction time on the Meitan white tea polysaccharide yield rate
表 1 湄潭白茶多糖正交试验因素水平设计
Table 1 Levels and factors in orthogonal test of Meitan white tea polysaccharide
水平 因素 A提取温度（℃） B提取时间（h） C 料液比（g/mL） 1 80 2 1:15 2 90 3 1:20 3 100 4 1:25 
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表 2 湄潭白茶多糖提取正交试验结果表
Table 2 The orthogonal results of polysaccharide extraction from Meitan white tea
试验号 A提取温度 B提取时间 C 料液比 提取率（%） 1 1 1 1 0.45 2 1 2 2 0.74 3 1 3 3 0.68 4 2 1 2 0.72 5 2 2 3 0.67 6 2 3 1 0.87 7 3 1 3 0.64 8 3 2 1 0.78 9 3 3 2 0.67 K1 1.87 1.81 2.1 K2 2.26 2.19 2.13 K3 2.09 2.22 1.99 R 0.39 0.41 0.14
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表 3 湄潭白茶多糖抑菌圈直径
Table 3 Diameter of inhibition zone of polysaccharides from Meitan white tea
菌株 茶多糖抑菌圈直径（mm） 抗生素抑菌圈直径（mm） 无菌水抑菌圈直径（mm） 大肠杆菌 11.13±0.14 35.14±0.13 − 金黄色葡萄球菌 15.47±0.12 25.22±0.09 − 铜绿假单胞菌 11.85±0.13 25.46±0.12 − 白色念珠菌 12.73±0.08 24.33±0.12 − 注：−表示无抑菌圈。
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表 4 湄潭白茶多糖MIC及MBC测定结果
Table 4 MIC and MBC of polysaccharides from Meitan white tea
MIC（mg/mL） MBC（mg/mL） 大肠杆菌 25 50 金黄色葡萄球菌 3.125 6.25 铜绿假单胞菌 25 50 白色念珠菌 50 100
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