Research Progress on Regulation of Plant Flavonoids Biosynthesis
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摘要: 类黄酮化合物是植物次级代谢产物，具有多种重要的生物学功能，对人体健康具有潜在的有益作用，作为抗菌药物在植物与微生物的相互作用和防御反应中发挥重要作用。本文总结了类黄酮化合物的生物合成途径以及调控规律，重点综述了外界环境如光照、温度、水分、辐射、激素、矿物质和MYB、bHLH、WD40以及NAC等转录因子对类黄酮化合物合成的影响，加强这方面的研究，旨在为植物类黄酮功能性成分更好地开发和利用做出指导。Abstract: Flavonoids are secondary metabolites of plants, which have a variety of important biological functions and have potential beneficial effects on human health. As antibacterial agents, flavonoids play an important role in the interaction and defense reaction between plants and microorganisms. This article summarizes the biosynthetic pathways and regulation rules of flavonoids, focusing on the effects of external environment such as light, temperature, moisture, radiation, hormones, minerals and transcription factors such as MYB, bHLH, WD40 and NAC on the synthesis of flavonoids. Strengthen research in this area, aiming to provide guidance for the better development and utilization of plant flavonoid functional ingredients.
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Keywords:
- plant flavonoids /
- regulation /
- synthesis /
- metabolism /
- transcription factors
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类黄酮化合物是参与植物发育和防御的次生代谢产物，因其具有抗氧化、清除自由基、抑菌等多种功能而受到广泛关注，对人类健康有重要意义[1]。类黄酮具有结构和特征多样性，其化合物基本骨架为C6-C3-C6，两个苯环通过三个碳原子结合而成，如图1[2]，根据分子结构可分为6大类，包括黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮类、异类黄酮类、黄烷醇类、花色素类[3]等。类黄酮化合物普遍存在于植物体内的生物合成途径当中，并产生及其丰富的次生代谢产物[4]，是次生代谢产物中最大的类群之一，是植物色素的主要来源，在植物的各个部位都有积累。发育阶段的早晚和环境温度、湿度的强弱对类黄酮在植物中积累的影响有所不同，它是果蔬气味、颜色的重要组成部分。此外，类黄酮化合物还有助于提高植物产品的农艺、工业和营养价值。它会影响种子和果实的品质、植物产品的涩味和食品的保健价值[5]。目前，关于类黄酮的研究主要集中在提取、纯化、结构鉴定、生理功能等方面，随着分子生物学的快速发展，越来越多的人开始注重一些外界因素例如辐射、氮素、温度、酶基因等对于类黄酮化合物合成代谢途径的调控方面的研究，以期为食品营养以及功能食品和天然产物的开发提供参考[4]。
1. 植物类黄酮化合物合成代谢途径
类黄酮是多酚类中最大的一类化合物，植物类黄酮合成的起始底物是来自苯丙烷代谢途径的香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A，如图2所示[2, 6]。首先苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用下生成肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸4-羟化酶（C4H）的作用下进一步发生羟基化反应，转化成香豆酸，然后在4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）的催化下形成香豆酰辅酶A，香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A（来自乙酰辅酶A）为前体，二者在查耳酮合成酶（CHS）（此酶催化生成所有类黄酮的查耳酮骨架）的催化下生成查耳酮，接着在查耳酮异构酶（CHI）的异构化作用下生成无色柚皮素，柚皮素作为主要的代谢产物进入其他类黄酮的合成途径。由于类黄酮化合物的合成途径在植物中是保守的，所以由于外界因素的不同，许多酶会改变类黄酮的基本骨架，从而生成不同种类的类黄酮化合物[3, 7]。
2. 植物类黄酮化合物合成代谢途径的调控
2.1 外界因素对类黄酮化合物合成的调控
外界环境因素对植物次生代谢起着重要的调控作用，可以引起次生代谢物含量的显著性改变，这些外界因素包括光照、温度、水分、辐射、激素、矿物质等。下面对上述因素进行综述，以期为植物类黄酮的调控提供参考[8]。
2.1.1 光照
光对类黄酮合成的影响体现在光照强度、光照时间和光质等方面，主要通过影响相关酶和基因的活性，从而提高类黄酮的积累量[9]。ZORATTI等[10]对野越桔和高丛蓝莓的花青素组成进行研究，发现季节、温度和光照可以通过影响类黄酮3',5'羟化酶（F3′5′H）基因来影响受测野越桔的花青素含量。ALBERT等[11]发现大多数植物花色苷的积累与光照强度成正相关，光照强度越强，越容易诱导花色苷合成的结构基因和调节基因的表达，矮牵牛花色素只有在高光照下生长才会出现强烈的着色现象，说明存在一种光诱导调控因子，负责激活花青素途径。鉴于Lc（一种来自玉米的bHLH调节因子）和An11（一种WD40的调节因子）均在矮牵牛中组成性表达，且MYB花青素调节剂Rosea1能够调节光照下矮牵牛花色素的合成，推测内源性调控因子可能是MYB蛋白[12]。GUAN等[13]指出在葡萄中遮光处理可以改变花色苷合成和转运相关基因的表达从而降低其含量，恢复光照后花色苷迅速积累，表明光照对葡萄花色苷的积累起正调控作用。这些调节与花青素生物合成途径的结构、调控基因表达的改变以及花青素转运基因的变化有关。XU等[14]通过对银杏的不同处理，发现不同的光照强度对银杏幼苗生物量的积累有显著影响，100%光照对银杏叶类黄酮的生物合成和积累起促进作用，PAL、CHS、F3H（黄酮-3-羟化酶）、FLS（黄酮醇合成酶）各种酶表达量也非常高，基因表达水平与类黄酮醇含量呈显著正相关。AZUMA等[15]利用离体葡萄浆果进行了体外环境实验，研究了温度和光照条件对类黄酮（花青素和黄酮醇）合成及相关基因表达水平的影响，发现低温（15 ℃）加光照处理下，葡萄果皮花青素积累量充足，而高温（35 ℃）或暗处理严重抑制花青素积累，验证了低温对花青素的积累起正调控作用，另外还发现许多类黄酮生物合成相关基因在低温和光照下均独立上调，说明低温和光对类黄酮合成途径内基因的表达具有协同作用。
2.1.2 温度
次生代谢物的形成和积累与温度密切相关，高温和低温都会影响植物次生代谢产物酶的活性，低温更有利于植物类黄酮的生成[4]。KIM等[16]发现高温通过E3泛素连接酶COP1和拟南芥花青素生物合成的正调控因子（HY5）抑制了拟南芥花青素生物合成，HY5是花青素合成的正调控因子，但高温条件下诱导了它的降解，从而抑制了MYBL2基因的表达，因此引起高温对花青素生物合成的抑制。环境温度的升高降低了拟南芥花青素生物合成途径早期和晚期所需基因的表达，于是他认为高环境温度通过COP1-HY5信号模块抑制花青素的合成，低温更有利于类黄酮化合物的合成。WANG等[17]的研究成果也支持了该观点，通过研究温度对银杏叶黄酮量的影响，发现温度对类黄酮化合物含量、C4H和4CL的活性及可溶性糖含量的影响很大，在较低温度和土壤水分条件下，可溶性糖和酶活性（PAL、C4H和4CL）的增加正向促进类黄酮的积累。同时BROSSA等[18]研究了圣栎在夏季和冬季时的类黄酮含量，建立了测定圣栎叶中黄酮类化合物含量和相对丰度的高效液相色谱-质谱联用方法，发现冬季圣栎中的类黄酮成分显著高于夏季，表明低温更有助于类黄酮化合物的生成与积累，也得出了与前者相同的结论。YU等[19]为探讨光照和温度对猕猴桃花青素积累的影响，在36个与花青素相关的AccR2R3-MYB转录因子中，AcMYB10在红肉猕猴桃果皮中表达量最高。AcMYB10的表达与成熟过程中自然着色果实的花青素积累以及光/温度诱导的愈伤组织着色高度相关。BHATIA等[20]报道了低温增强黄酮醇生物合成对光照的严格要求，通过基因敲除、过表达等研究发现，与野生型（WT）相比，在低温环境下拟南芥HY5和转录因子MYB11、MYB111、MYB12突变体与类黄酮生物合成相关基因的表达下降并且黄酮醇合成受到抑制，在HY5突变体中过表达AtHY5恢复了在低温下黄酮醇的合成，AtMYB12的过表达有利于低温和光照条件下黄酮醇的积累。总之，低温诱导黄酮醇合成需要HY5和黄酮醇特异性MYB调控因子的帮助。WANG等[21]发现参与原花青素合成的MYB转录因子可分为TT2型和PA1型,并从红肉苹果中鉴定了一个PA1型MYB转录因子MdMYBPA1，通过在苹果愈伤组织中过表达和敲除表达该转录因子的方式鉴定了其在类黄酮合成中的作用，还探索了TT2和PA1型MYB转录因子之间的关系，发现MdMYB9/11/12可以结合MdMYBPA1启动子。此外，MdMYBPA1通过正向调控类黄酮的生物合成途径过程中原花青素生成花青素的过程来响应低温。在结合分析中，MdbHLH33直接结合MdMYBPA1启动子的低温响应（LTR）顺式元件并促进其表达。此外，表达MdMYBPA1和MdbHLH33的愈伤组织在低温下形成复合物，诱导产生更多花青素。常丽等[22]研究发现低温能增强C4H酶的活性，同一土壤含水量条件下，低温环境比高温条件下更加促进了槲皮素、山柰酚、异鼠李素的合成，表明低温（15 ℃）更有利于银杏叶类黄酮化合物的生成和积累，而高温（35 ℃）对银杏叶类黄酮化合物的生成起到抑制作用。
2.1.3 水分
水分作为构成植物的必要成分，是其赖以生存的必不可少的因子之一。大部分研究表明，适度干旱、土壤含水量偏低反而会促进植物类黄酮化合物的合成。类黄酮的抗氧化性在植物抗旱胁迫适应中发挥了重要作用，已经有许多研究表明干旱胁迫过程中植物体内类黄酮成分含量显著增加，适度的水分干旱有利于类黄酮化合物的积累[4, 23]。CUI等[24]采用高效液相色谱法（HPLC）测定葡萄花青素的种类和含量，并应用逆转录定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析花青素合成相关酶基因的表达，通过提高基因UFGT（类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶）和MYBA1的表达水平，研究了干旱胁迫和病毒GLRaV3侵染对花青素积累的影响，通过方差分析和相关性分析发现GLRaV3侵染是增加花青素积累的决定因素,而干旱胁迫可以进一步增强感染GLRaV3的葡萄叶片中花青素的积累。LI等[25]研究发现UGT79B2和UGT79B3的过表达显著增强了植物对低温和干旱、盐胁迫的耐受性，而RNAi（RNA干扰）和CRISPR-Cas9产生的UGT79B2/B3双突变体更容易受到不利条件的影响。另外还鉴定了UGT79B2/B3在添加原花青素UDP-鼠李糖苷和3-O-葡萄糖苷时的酶活性，UGT79B2/B3的过表达显著增加了花青素的积累，增强了抗氧化活性，而UGT79B2/B3双突变体花青素水平降低。当UGT79B2/B3在不能合成花青素的突变体tt18上过度表达时，这两个基因都不能提高植物对逆境的适应能力，表明UGT79B2和UGT79B3通过调节花青素的积累赋予非生物胁迫耐性。谢岳等[26]对葡萄施以不同程度的水分胁迫，通过HPLC测定葡萄果皮中花色苷含量以及结合qRT-PCR实验发现适度的水分胁迫上调花色苷合成相关结构基因PAL、CHS1、DFR（二氢黄酮醇还原酶基因）、F3′H、F3′5′H、UFGT和转录因子MYBA1的表达，从而提高类黄酮化合物的积累，而过度的干旱则会抑制其含量的积累，这一结论也验证了适度的水分对类黄酮物质的合成起到正向调控作用。
2.1.4 UV辐射
类黄酮化合物的生物合成和积累在植物发育和环境中受到控制，UV-B辐射是一种类黄酮合成的外界调控因素。适当剂量的UV-B辐射作为启动子对类黄酮化合物的积累是很重要的，高剂量反而会抑制类黄酮化合物的合成[7]。莫运才等[27]为探讨环境中太阳紫外线（UV-B）辐射对铁皮石斛幼苗生理代谢的影响，对铁皮石斛分别进行5.1 μW/cm2和15.6 μW/cm2强度的UV-B辐射实验，结果发现在UV-B辐射处理期间，5.1 μW/cm2辐射的类胡萝卜素含量、类黄酮含量和 PAL酶活性均高于对照组（未经辐射处理）；而15.6 μW/cm2的UV-B辐射的类胡萝卜素含量、类黄酮含量和PAL酶活性在第8 d达最大值后迅速降低，表明高强度UV-B辐射下铁皮石斛可以合成较多的类黄酮，UV-B辐射的增强诱导苯丙氨酸解氨酶活性增强，苯丙氨酸解氨酶作为植物类黄酮合成代谢的起始酶，促进了类黄酮的合成。HENRY-KIRK等[28]为了了解紫外线对类黄酮化合物合成的影响，将苹果在光谱滤光器下生长，滤光器可以改变太阳紫外线的透射率。果实分析表明，在一个季节的发育过程中，紫外线诱导了生理、代谢和基因表达水平的变化。花青素调节因子MYB10激活MYB22的启动子，MYB22的存在增强了HY5激活FLS启动子的过程，从而诱导类黄酮化合物的生成，而降低紫外照射的强度会下调FLS、HY5、MYB10和MYB22这些调节因子的转录水平，从而降低花青素和黄酮醇的积累。YANG等[29]分析了采前UV-B/-C辐射和采后UV-A/-B/-C辐射对蓝莓发育过程中黄酮醇、原花青素和花青素的基因表达和代谢谱，发现采前和采后紫外光照射均显著增加了果实发育早期黄酮醇积累量和果实发育后期花青素和原花青素含量，基因表达的变化与紫外照射后黄酮含量的变化平行，VcMYBPA1转录因子在采前和采后紫外线照射下与VcLAR（无色花青素还原酶）和VcANR（无色花青素合成酶）密切相关，因此猜测该转录因子可能与花青素的生物合成有关。
2.1.5 激素
类黄酮的生物合成受激素的调控，采用外源激素可用于调控植物类黄酮的生物合成[4]。近年来，关于激素调控类黄酮代谢途径的研究已成为热点。沈欣杰[30]对转色期前樱桃外源施用脱落酸（ABA）,使用超高效液相色谱对花色苷含量进行测定，发现ABA处理相对于对照组可以显著促进樱桃果实花色苷的合成，ABA生物合成抑制剂NDGA处理则显著抑制了果实花色苷的合成，除了花色苷物质积累方面，在分子水平上，ABA处理的果实中六个花色苷合成路径关键酶基因的表达水平显著高于对照组。李栋栋[31]用不同浓度ABA处理开花两周后的草莓果实，并进行转录组测序分析发现外源ABA处理能增强PAL、TAL、4CL、DFR（二氢黄酮醇还原酶）等与草莓中类黄酮化合物合成相关的酶的活性，进而诱导花青素合成积累。有研究认为MYB基因的表达是由许多植物激素诱导的，包括脂基激素茉莉酸酯（MeJA）。MeJA是一种内源植物生长调节剂，可调控类黄酮化合物等次生代谢物的合成，刘生财等[32]为了解MeJA对苋菜细胞中类黄酮合成的影响，以苋菜悬浮细胞为材料，结合qRT-PCR技术，检测不同浓度MeJA和添加时间处理对类黄酮积累的影响，结果显示，在悬浮细胞培养的第4 d添加200 μmol/L时类黄酮含量达到最大；与对照（MeJA 0 μmol/L）相比，不同浓度MeJA处理下，PAL、F3H、CHI、CHS基因表达量均极显著上调，与类黄酮含量具有正相关性。本研究表明MeJA浓度和添加时间对苋菜悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜合成起着重要调控作用。LI等[33]将MeJA加入到甘草细胞悬液中，通过RNA测序技术分析来识别差异表达的基因，结果显示MeJA对MYB转录因子GlMYB4和GlMYB88具有显著的诱导作用，亚细胞定位发现GlMYB4和GlMYB88蛋白定位于细胞核，通过表达分析发现GlMYB4和GlMYB88可以正向调节甘草细胞中黄酮类化合物的合成。GONZALEZ等[34]为研究ABA是否参与了酚类化合物的积累，特别是花青素苷的生物合成，以干旱胁迫下的智利浆果为研究对象，施用氟立酮（ABA生物合成抑制剂），并在24、48和72 h的干旱胁迫条件下在幼苗和完全展开的叶片上施用ABA，收获植株后，分别采集叶片，检测生化状态。观察到，氟立酮处理显著降低了受胁迫植物的ABA浓度和总花青素浓度，使此浓度达到了对照组植物的水平。施用ABA可恢复胁迫植株在48 h内的ABA水平和总花青素浓度。qRT-PCR结果显示，经氟立酮处理的植株叶片中，AcUFGT基因表达降低，而随后施用ABA则增加了AcUFGT的表达。综上所述，ABA参与调控干旱胁迫下花青素苷的生物合成。YANG等[35]为了探索ABA是否参与多酚生物合成，通过高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱，从葡萄提取物中鉴定出16个多酚类物质，外源褪黑激素和ABA处理均显著促进了黄酮醇和黄烷醇各组分的生物合成，尤其是儿茶素在褪黑激素200 μmol/L处理时几乎增加了一倍，参与类黄酮生物合成的4CL、CHS、F3H、FLS（类黄酮醇合成酶）、UFGT等基因的表达也明显上调。JIA等[36]利用一种新建立的烟草病毒诱导草莓果实基因沉默技术，下调ABA生物合成关键酶基因FaNCED1的表达，导致草莓果实中ABA含量显著下降，果实着色明显减少。另外在转基因RNA干扰（RNAi）果实中也观察到类似的无色表型，病毒诱导的基因沉默下调了ABA受体基因FaCHLH/ABAR的表达。更重要的是，外源ABA可以恢复但不能逆转基因FaCHLH下调引起的RNAi果实的无色表型，此外还观察到FaCHLH/ABAR基因的表达水平下调不仅改变了ABA水平和糖含量，还改变了一组ABA和糖响应基因，外源糖可以显著促进果实成熟，同时刺激ABA积累。这些数据表明ABA是促进草莓成熟的信号分子，ABA受体FaCHLH/ABAR是草莓成熟过程中响应ABA的正调节因子，可以影响草莓类黄酮化合物的生物合成。
2.1.6 矿物质
土壤中的营养物质对植物生长以及次生代谢物的合成有重要作用，钾含量降低会导致C4H和PAL酶的表达下调，降低许多中草药中类黄酮化合物的含量，有研究学者认为这可能是由于缺钾对类胡萝卜素合成途径的影响导致的[37]。LEA等[38]通过将拟南芥种子置于不同含氮量的培养基上播种来研究氮对类黄酮化合物合成的影响，研究发现氮元素缺乏反而会增强MYB及bHLH转录因子的表达最终促进拟南芥类黄酮合成。同样DONG等[39]对龙井茶进行不同水平氮处理，使用超高效液相色谱串联质谱和气相色谱串联质谱定量分析以及PCR分析显示，正常的氮水平通过基因调控和底物碳水化合物的积累促进了龙井茶黄酮醇糖苷的生物合成，而异常的氮尤其是过量的氮对类黄酮的合成有抑制作用。YU等[40]为深入了解钙诱导花青素积累的分子机制，在全株喷钙后一周对葡萄皮进行转录组测序，钙处理共影响了1894个差异表达基因（DEGs），其中上调基因1266个，下调基因628个，此外还发现钙触发了大量与钙转运和信号转导、花青素的生物合成和转运调控以及植物激素的生物合成和信号转导相关的DEGs。通过分析上调、下调的DEGs，明确了外源钙可能通过以下四个途径改善葡萄浆果颜色：钙通过激活与花青素生物合成相关的转录因子促进花青素积累；钙通过刺激钙和UFGT的相互作用促进花青素的积累；钙调素可能调节与花青素相关的转录因子，进而刺激花青素生物合成途径中的基因；钙信号刺激茉莉酸和乙烯的生物合成，通过增加内源糖含量或直接激活与花青素生物合成相关的转录因子，提高花青素含量。XU等[41]为探讨钙处理对果实花色苷和酚类化合物含量的影响以及钙处理对类黄酮合成途径基因表达的影响，用不同浓度（10、20、50 mmol/L）的CaCl2溶液喷洒整个植株，比较了红果和黄果两种草莓品种的总酚类物质和花色苷含量，以及花色苷结构基因在草莓果实和其它组织中的表达谱。通过高效液相色谱和qRT-PCR等技术进行分析，发现钙处理提高了红果果实中黄酮3-羟化酶（F3H1）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR2）、花青素合成酶（ANS1）和UDP-葡萄糖基转移酶（UGT1）等花青素关键结构基因的表达水平，使总酚和花青素含量提高了20%以上。JIA[42]等分析了缺磷胁迫下烟草植株营养生长期的生理和分子变化，qRT-PCR分析显示，在缺磷叶片中，参与黄酮醇生物合成的基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF30H和NtFLS的转录水平升高。相比之下，花青素生物合成的关键基因NtDFR的转录水平在磷缺乏状态下没有升高，结果表明，在磷缺乏的情况下，烟草植株会积累黄酮醇，而不是花青素，此外还检测到NtDFR上游调控基因NtAN2的转录上调，因此猜测缺乏磷的烟草叶片花青素合成失活的原因之一可能是NtAN2需要其他转录因子的激活。周锈连[43]采用蛋白质组学分析方法比较了磷充足和磷缺乏培养基上生长了7 d的拟南芥幼苗的蛋白质谱，利用液相色谱-二级质谱联用（LC-MS-MS）法结合蛋白质组学定量分析差异表达蛋白，分析发现磷缺乏有利于增强花青素的积累。
2.2 基因（转录因子）对黄酮化合物合成的调控
植物类黄酮的生物合成途径由一系列结构基因和调节基因协同完成[44]，其合成结构基因编码催化合成途径中的酶，这些关键结构酶包括PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、DFR等，并受转录因子MYB、bHLH、WD40和NAC以及其他转录因子的调控[45]，下面重点对这几类转录因子在不同类型植物中的调控机制进行归纳总结[46]。
2.2.1 MYB转录因子
MYB转录因子对不同植物结构基因和类黄酮合成影响不同，MYB蛋白在调控类黄酮生物合成途径中起着关键作用[47]。ZHAI等[48]在梨果实中克隆了3个候选MYB转录因子，分别为PbMYB10b、PbMYB9和PbMYB3，并通过过表达和RNAi瞬时检测进行功能验证，结果表明PbMYB10b作为花青素通路和原花青素通路的激活剂，但其功能可被其他MYB转录因子补充，阐明了在梨果实中类黄酮合成与MYB转录因子表达模式的关系。PbMYB9是原花青素、花青素和黄酮醇途径的激活剂，其作用是梨果实类黄酮生物合成所必需的。PbMYB3是PbMYB10的潜在调节因子。同时，PbMYB3的同源基因MdMYB3过表达可以激活果实中CHS、CHI、UFGT、FLS几个类黄酮途径基因的表达[49]，因此认为这几种MYB转录因子可能是梨果中类黄酮生物合成的调控因子[48]。ANWAR等[50]从中国水仙中鉴定了一个R2R3 MYB转录因子NtMYB2，并对其进行了功能表征。通过瞬时表达分析发现NtMYB2转录因子参与了花青素生物合成途径的调控，并可能通过下调中国水仙关键酶基因的转录来抑制花青素生物合成。ZHU等[51]从菊花中分离出编码R2R3-MYB转录因子的CmMYB8基因并对其进行了功能表征，发现CmMYB8是菊花R2R3-MYB转录因子，对木质素和类黄酮化合物的合成起到负调控作用。LI等[52]对鸢尾科单子叶开花植物小苍兰的R2R3-MYB的基因FhMYB5的功能进行了鉴定，相关分析表明，FhMYB5基因的表达与小苍兰体内花青素和原花青素的积累具有很好的一致性，FhMYB5单独作用时，轻微上调晚期类黄酮合成基因DFR和无色花色素双加氧酶基因（LDOX），而当FhMYB5与bHLH转录因子基因FhTT8L和FhGL3L共同发挥作用时，早期和晚期类黄酮合成基因均被明显激活，FhMYB5在烟草和拟南芥中的过表达也可明显上调参与总黄酮途径的基因表达，表明FhMYB5在小苍兰总类黄酮途径中发挥调控作用。TIAN等[53]对协同调控原花青素和花青素生物合成的海棠的两种R2R3-MYB转录因子McMYB12a和McMYB12b进行了功能表征，结果发现McMYB12a主要通过与花青素生物合成基因启动子的结合来上调花青素生物合成基因的表达，而对原花青素生物合成基因的调控作用仅为次要，而McMYB12b则优先结合原花青素生物合成基因的启动子。烟草中过表达McMYB12a和McMYB12b改变了类黄酮生物合成基因的表达，促进了烟草花瓣中原花青素和花青素的积累，而利用保守的基因区域瞬时沉默会导致原花青素和花青素产量减少。同时，这两个基因在海棠果实中过表达和烟草中过表达具有相似的作用，在海棠中沉默McMYB12转录因子与在烟草中沉默该转录因子也具有相似的作用，揭示了海棠叶片依赖于McMYB12a和McMYB12b表达的自调节平衡来调控花青素积累。
2.2.2 bHLH转录因子
bHLH转录因子是转录因子最大的家族之一，在类黄酮化合物等多种次生代谢产物的调控中发挥着重要作用。ZHAO等[54]在羊草中发现了bHLH型转录因子LcbHLH92，在拟南芥中表达该转录因子发现其表达水平与种子颜色、花青素合成酶（ANS）和花青素还原酶（ANR）转录水平呈负相关，过表达LcbHLH92会导致叶片和种子中花青素和原花青素的积累减少。ZHAO等[55]克隆并鉴定了bHLH家族蛋白PabHHL1的功能，PabHLH1与参与类黄酮生物合成的IIIf亚家族bHLH转录因子相关，瞬时表达实验表明，PabHLH1存在于细胞核和细胞质中，酵母单杂交实验表明其具有交互活性，当PabHLH1在附子草中表达时，双苄基和黄酮类化合物的含量与这些化合物生物合成途径中相应基因的转录水平呈正相关，当PabHLH1在拟南芥中异源表达时，激活了黄酮类化合物和花青素的合成，参与了黄酮类化合物合成早期和晚期结构基因的上调。在矢车菊中，DENG等[56]筛选出4个R2R3-CcMYB转录因子分类为4或6亚群，1个CcbHLH1转录因子分类为IIIf亚群，进一步分离出黄酮3-羟化酶（CcF3H）和二氢黄酮醇4-还原酶（CcDFR）启动子，发现CcMYB6-1显著上调上述两个启动子的活性，刺激花青素积累，与CcbHLH1共同浸染后，其活性明显增强。此外，酵母双杂交和双分子荧光互补试验均显示了这两种激活剂之间的相互作用，因此表明转录因子CcMYB6-1和CcbHLH1分别是R2R3MYB和IIIfbHLH的同源物，它们协同参与调控花青素的生物合成。葡萄中，WANG等[57]化学合成了密码子优化的葡萄VvbHLH1基因，VvbHLH1的过表达上调了参与类黄酮合成、ABA信号通路、脯氨酸合成和活性氧清除系统的基因，因此认为葡萄bHLH转录因子基因VvbHLH1可能被用于增加类黄酮化合物含量以及提高类黄酮和其他植物对非生物胁迫的耐受性。在苹果花青素代谢的分子机制研究中，XU等[58]利用酵母双杂交、蛋白质体外结合和双分子荧光互补试验表明，MdMYB16与MdbHLH33形成同源二聚体并相互作用，而LBSMdMYB16不与MdbHLH33相互作用，在过表达MdMYB16的愈伤组织中过表达MdbHLH33，发现它减弱了MdMYB16对花青素合成的抑制作用，这些结果表明MdMYB16和MdbHLH33可能是控制花青素合成途径的重要调控网络的一部分。
2.2.3 WD40转录因子
WD40是一个基因家族，编码一类WD40蛋白，该蛋白是植物体内调节类黄酮的三大转录因子之一，它主要通过结构域与其他蛋白发生互作，以此来行使它的调控功能[59]。WD40蛋白又称WD40结构域蛋白，是真核生物中的一个大基因家族。LIU等[60]鉴定了178个马铃薯WD40（StWD40）基因，并对其染色体分布、基因结构和保守基元进行了评估。结果发现，与一种WD40蛋白TTG1相互作用的蛋白有112对，其中27对在色素组织中差异表达，表明马铃薯WD40蛋白可能与花青素的生物合成和非生物胁迫反应有关。此外，有研究表明苹果花青素和原花青素的积累受到MYB、bHLH和WD40蛋白这三类调节因子的严格调控。AN等[61]鉴定了一种促进花青素积累的苹果WD40蛋白（MdTTG1），当MdTTG1基因在拟南芥中过度表达时，类黄酮途径下游所需的生物合成基因上调，酵母双杂交实验和双分子荧光互补试验表明，苹果MdTTG1基因通过与bHLH蛋白相互作用调节花青素的合成与积累。
2.2.4 其它
NAC转录因子家族是植物类特有的一种转录因子超家族，该转录因子由一个保守的N端结构域和高度可变的C端转录激活域组成，NAC 转录因子在植物生长发育过程中起着重要作用[62]。SUN等[63]鉴定了一种NAC转录因子MdNAC52，其基因转录水平在苹果着色过程中升高，苹果愈伤组织MdNAC52过表达积累了花青素。通过酵母单杂交、电泳迁移、染色质免疫沉淀和荧光素酶报告基因检测表明，MdNAC52可与MdMYB9和MdMYB11的启动子相互作用，参与花青素合成的调控。MdNAC52还可与LAR启动子结合，调控其表达，促进花青素合成。这些发现证实了MdNAC52结合MdMYB9和MdMYB11的启动子促进花青素的生物合成。JIANG等[64]在荔枝果实中，通过电泳迁移和瞬时表达分析发现LcNAC13转录因子直接与花青素生物合成相关基因（LcCHS1/2、LcCHI、LcF3H、LcF3H、LcDFR、LcMYB1）启动子结合，抑制其转录，而LcR1MYB1与LcNAC13发生物理作用，逆转LcNAC13的负作用，因此推测LcNAC13和LcR1MYB1可能在荔枝果实成熟过程中协同调控花青素生物合成，这为花青素生物合成调控网络的研究提供了新的思路。另外还有HD-Zip I转录因子，此前研究表明HD-Zip I亚家族基因参与了环境胁迫反应、果实成熟等，但对其在花青素积累中的作用研究较少。HD-Zip蛋白由同源框结构域（HD）和同源框结构域相关亮氨酸拉链（Zip）组成，JIANG等[64]报道了HD-Zip I转录因子MdHB1也参与了花青素积累的调控。MdHB1沉默导致苹果果肉中花青素的积累，而其过表达降低了红肉苹果果肉中花青素的含量。此外，过表达MdHB1的转基因烟草花的着色明显减少，瞬时启动子激活试验和酵母单杂交结果表明，MdHB1间接抑制花青素生物合成基因DFR和UFGT的表达。酵母双杂交和双分子荧光互补证实MdHB1能与细胞质中的MYB、bHLH和WD40相互作用，分析表明MdHB1可以抑制MdMYB10、MdbHLH3、MdTTG1进入细胞质，进而间接抑制MdDFR、MdUFGT的转录。当MdHB1被沉默时，这些转录因子被释放，激活MdDFR和MdUFGT的表达和花青素的生物合成[65]。另外还有一种锌指转录因子，通过调控下游基因的表达在植株应答非生物逆境的过程中扮演重要角色。SHI等[66]发现拟南芥锌指转录因子（ZAT6）水平被H2O2诱导激活，调节AtZAT6的表达对花青素和总黄酮的浓度均有正向影响。AtZAT6通过与CHI、F3H、DFR、MYB12和MYB111基因的启动子结合，直接激活了这些基因的表达，MYB12和MYB111的激活上调了CHS和F3H酶基因的表达，表明AtZAT6通过直接与几个参与花青素合成的基因启动子结合，在H2O2激活的花青素合成中发挥重要作用。
3. 结论
类黄酮化合物作为植物中广泛分布的一种次级代谢产物，对植物的生长发育具有重要意义。越来越多的研究表明，类黄酮化合物对人类健康有重要意义。随着分子生物学技术的发展，类黄酮化合物的合成途径和调控机制已逐步阐明，不论是外界环境因素还是生物因子的研究都已逐步深入，本文综述了近年来对类黄酮化合物生物合成途径的调控，包括外界环境因素和生物因子两方面的研究成果。近年来，基因组信息和各种组学技术的发展为我们的深入研究提供了工具，由于类黄酮化合物的各种功能对人体健康的益处，在实际生活中有很重要的现实意义。目前的研究水平大多是通过调控积累产物的量和在基因水平对相关转录因子进行过表达或抑制，通过基因或酶表达水平上调或下调来观察产物的量，而与类黄酮合成相关的酶基因和启动子的结构与功能、调控基因的作用机理还有环境条件对植物蛋白质组差异表达的影响、基因转录组数据分析以及类黄酮化合物分解代谢等方向还有待于进一步研究，以期为植物类黄酮化合物的开发和利用提供更具体深入的理论依据[4, 47]。
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