Adsorption Properties of Lactobacillus Peptidoglycan on Acrylamide
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摘要: 以4株乳酸菌肽聚糖（Peptidoglycan，PG）为生物吸附剂，探讨其对丙烯酰胺（acrylamide，AA）的吸附特性。利用高效液相色谱法考察不同因素（pH、温度、时间、PG浓度、AA浓度及钙离子浓度）以及模拟胃肠环境下PG对AA吸附特性的影响。结果表明，随pH、温度的增大，4株乳酸菌PG对AA的吸附率均呈先增加后减少的趋势。当pH为5、温度为37 ℃，4株乳酸菌PG对AA的吸附率均达到最大值，其中植物乳杆菌1.0665 PG的吸附率最大，为87.35%。在6 h以内，4株乳酸菌PG对AA的吸附率随时间的延长而显著增加（P<0.05），但6 h后无显著性变化。吸附率随AA浓度的升高而减小，且随着PG浓度、钙离子浓度的增加而增大。在模拟胃环境条件下，不同pH显著影响PG对AA的吸附效果（P<0.05），并且pH为3.5时，PG对AA的吸附率最高；不同的时间对PG吸附AA的能力无显著影响（P>0.05）。在模拟肠环境下，胆盐浓度和吸附时间均显著影响PG对AA的吸附效果（P<0.05），其中0.3%~0.4%胆盐浓度更有利于PG 对AA的吸附。综上，本研究为乳酸菌肽聚糖在生物吸附脱毒方面的应用及机制探讨奠定理论基础。Abstract: Four strains of lactic acid bacteria peptidoglycan (PG) are used as biosorbent to study the adsorption characteristics of acrylamide (AA). The effects of different factors ( pH value, temperature, time, PG concentration, AA concentration and calcium ion concentration) and simulated gastrointestinal environment on the adsorption characteristics of AA were investigated by HPLC. The results showed that with the increase of pH value and temperature, the adsorption rate of four lactic acid bacteria PG for AA increased first and then decreased. When the pH value was 5 and the temperature was 37 ℃, the adsorption rate of PG by four lactic acid bacteria reached the maximum value, among which the PG adsorption rate of Lactobacillus plantarum 1.0665 was 87.35%. Within 6 h, the adsorption rate of PG by four strains of lactic acid bacteria increased significantly with the extension of time (P<0.05), but there was no change after 6 h .The results showed that the adsorption rate decreased with the increase of AA concentration, and increased with the increase of PG concentration and calcium concentration. In the simulated gastric environment, different pH values significantly affected the adsorption effect of PG on AA (P<0.05), and the adsorption rate of PG to AA was the highest when pH was 3.5, and the different time had no significant effect on the adsorption capacity of PG for AA (P>0.05). In the simulated intestinal environment, bile salt concentration and the adsorption time significantly affected by efficiency of PG to AA (P<0.05), and 0.3%~0.4% bile salt concentration was more conducive to the adsorption of AA by PG. In conclusion, this study laid a theoretical foundation for the study of the adsorption mechanism of lactic acid bacteria.
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丙烯酰胺（acrylamide，AA）是一种应用于合成聚丙烯酰胺及其水溶性聚合物的化学药品[1]。2002年，斯德哥尔摩大学专业人士和瑞典国家食品管理局（National Food Administration，NFA）研究人员首次发现经油炸、烘烤高温处理的淀粉类食品中存在AA[2]。进一步研究发现AA广泛存在于油炸薯类、早餐谷物、咖啡等食物[3-4]中。国家癌症组织已将AA划分为2A级致癌物，AA具有神经毒性[5-6]、生殖毒性[7]、遗传毒性[8]，会引起神经系统损伤，诱导动物生殖细胞染色体突变及遗传物质改变。鉴于此，通过热加工食品摄入体内的AA会对人体健康产生一定的安全隐患，因此减少食品中AA含量及其造成的危害成为食品安全领域非常值得关注的问题之一。
目前，去除AA的方法包括物理法、化学法以及生物法，其中生物法具有天然、安全、高效、低毒、廉价等优点。生物法中常见吸附剂包括壳聚糖、果皮、益生菌等，但壳聚糖、果皮在未经处理应用时，其自身吸附率很低，许多研究人员需要利用改性提高其吸附能力。而乳酸菌作为生物吸附剂直接使用时，其吸附率高、操作简单、易于提取且无二次污染。乳酸菌在黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、铅、汞、铬等危害物质的吸附脱毒方面有广泛应用[9-12]，但在AA吸附脱毒方面研究甚少。本课题组研究证实乳酸菌对AA具有良好的吸附能力，高压灭活菌株吸附效果优于未经灭活菌株，且吸附AA后形成的复合物在体外胃肠模拟实验中具有良好的稳定性，其中植物乳杆菌对AA的吸附能力优于干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌[13]。进一步探究乳酸菌吸附AA的分子机制，发现乳酸菌吸附AA主要部位是细胞壁而非胞外多糖和表面蛋白，吸附能力与细胞壁粗糙程度呈正相关，即细胞壁越粗糙，对AA的吸附率越高[14]，且已证实约占细胞壁质量90%的肽聚糖（Peptidoglycan，PG）是乳酸菌吸附AA的关键结构[15]。但有关乳酸菌PG吸附AA的影响因素及在胃肠环境下的吸附状况尚有待进一步研究。因此，本实验选择4株乳酸菌PG为研究对象，以吸附率为指标，探究不同影响因素（PG浓度、AA浓度、时间、pH、温度及离子浓度）及人工模拟胃肠环境下乳酸菌PG对AA吸附能力的影响，旨在了解不同乳酸菌PG对AA的吸附特性，为AA生物脱毒应用提供理论支撑，同时为AA的去除提供一条新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
植物乳杆菌1.0665（L.plantarum 1.0665）、干酪乳杆菌ATCC393（L. casei ATCC 393）、嗜酸乳杆菌KLDS 1.0307（L.acido Philus KLDS 1.0307）、嗜热链球菌 KLDS1.0316（Streptococcus thermophilus KLDS 1.0316） 均由东北农业大学食品学院菌种库保存；丙酮、乙腈 色谱纯，哈尔滨市志飞生物技术公司；MRS培养基、三氯乙酸（TCA）（分析纯） 北京奥博星生物技术有限公司；丙烯酰胺（acrylamide，AA）标准品（纯度≥99%） 美国Amresco公司；冰醋酸（分析纯）、胰蛋白酶（250 U/mg）、Tris-Hcl、中性蛋白酶（30000 U/mg） 哈尔滨市美莱生物科技有限公司。
LC-20A高效液相色谱系统 日本岛津公司；DL-360A超声破碎仪 北京东联哈尔仪器制造有限公司；DK-98-Ⅱ恒温水浴锅 常州荣冠实验分析仪器厂；GL-21M高速冷冻离心机 北京东联哈尔仪器制造有限公司；HVE-50高压灭菌锅 浙江德育制造有限公司；DHP-9272电热恒温培养箱 江苏中坤仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液配制
人工胃液：取质量分数为10%的盐酸加去离子水稀释调整至pH值分别为1.5、2.5、3.5，然后加入胃蛋白酶，充分溶解后，用0.22 μm滤膜除菌，4 ℃保存备用[16]。
胆盐溶液：分别用无菌去离子水配制0.1%、0.2%、0.3%、0.4%牛胆盐溶液，用0.22 μm的滤膜除菌，4 ℃保存备用[16]。
胰蛋白酶溶液：称取6.8 g KH2PO4，溶解于500 mL无菌去离子水中，调节pH至6.8，并定容至l000 mL，然后向溶液中添加胰蛋白酶，使溶液终浓度为1 g/100 mL，充分溶解后，用0.22 μm的滤膜除菌，4 ℃保存备用[16]。
1.2.2 PG的提取
将活化好的植物乳杆菌1.0665（Lactobacillus plantarum 1.0665）、干酪乳杆菌ATCC393（Lactobacillus casei ATCC 393）、嗜酸乳杆菌KLDS 1.0307（Lactobacillus acidophilus KLDS 1.0307）和嗜热链球菌 KLDS 1.0316（Streptococcus thermophilus KLDS 1.0316）四株菌以3%~4%的接种量接入到50 mL MRS培养基中于37 ℃培养24 h后离心（4 ℃，8000 r/min）5 min，收集菌体，用无菌去离子水离心洗涤两次。然后按1:10向菌体中加入10%三氯乙酸（TCA），摇匀后置100 ℃沸水中搅拌20 min，冷却后6000 r/min，4 ℃离心10 min，沉淀用无菌去离子水洗涤后，加入2倍体积氯仿：甲醇（1:2，V/V）振荡6 h，并于6000 r/min，4 ℃离心10 min，再次洗涤沉淀，并将其溶于含有3 mg/mL胰蛋白酶和10 mg/mL中性蛋白酶的0.1 mol/L pH7.6的Tris-HCl缓冲液中，37 ℃，150 r/min摇床振荡过夜，然后8000 r/min离心20 min收集沉淀并洗涤后，经冻干机冷冻干燥，得到粉末状PG提取物[17-20]。
1.2.3 PG鉴定
称取一定质量的上述PG冻干粉末，加入浓度为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH为6.2）中，将其配制成浓度为1 mg/mL的溶液，再加入溶菌酶，将其浓度调整为300 µg/mL，同时以不加溶菌酶的PG作为对照组。于37 ℃振荡12 h，期间每间隔1 h进行一次取样，稀释5倍后在600 nm波长下测定其吸光度值，观察肽聚糖的溶解状况[17]。
1.2.4 PG纯度的测定
采用高效液相色谱法进行PG纯度的测定，检测条件：色谱柱：色谱柱为Alltima Inertsil ODSP-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），检测波长：225 nm，柱温：37 ℃，流动相：H2O，流速：0.6 mL/min，进样量：20 μL。样品处理：将肽聚糖样品溶于无菌去离子水配制成1 mg/mL的PG溶液。根据肽聚糖在色谱图上的峰面积比来鉴定肽聚糖的纯度。
1.2.5 各因素对PG吸附AA的影响
1.2.5.1 pH对PG吸附AA的影响
将PG冻干粉溶于去离子水制备5 mg/mL的PG溶液，且分别调节pH为3、5、7、9、11。取900 μL该PG溶液与6 μg/mL AA 100 μL混匀，于37 ℃作用6 h，然后离心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7测定PG对AA的吸附率，重复操作三次。
1.2.5.2 温度对PG吸附AA的影响
将PG冻干粉溶于去离子水制备5 mg/mL的PG溶液，调节溶液pH为5。取900 μL该PG溶液与6 μg/mL AA 100 μL混匀，分别在4、20、37、50 ℃下作用6 h，然后离心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7测定PG对AA的吸附率，重复操作三次。
1.2.5.3 时间对PG吸附AA的影响
将PG冻干粉溶于去离子水制备5 mg/mL的PG溶液，调节溶液pH为5。取900 μL该PG溶液与6 μg/mL AA 100 μL混匀，37 °C，分别与AA作用2、4、6、8、10 h，然后离心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7测定PG对AA的吸附率，重复操作三次。
1.2.5.4 PG浓度对PG吸附AA的影响
分别称取5、10、15、20、25 mg肽聚糖冻干粉于1 mL无菌去离子水中，分别制备5、10、15、20、25 mg/mL的PG溶液，调节溶液pH为5。取900 μL该PG溶液与6 μg/mL AA 100 μL混匀，于37 ℃作用6 h。然后离心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7测定PG 对AA的吸附率，重复操作三次。
1.2.5.5 AA浓度对PG吸附AA的影响
将PG冻干粉溶于去离子水制备5 mg/mL的PG溶液，调节溶液pH为5。取900 μL该PG溶液分别与不同浓度的AA（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL）100 μL混匀，于37 °C作用6 h。然后离心（4 °C，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7测定PG对AA的吸附率，重复操作三次。
1.2.5.6 钙离子浓度对PG吸附AA的影响
将PG冻干粉分别溶于浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L的钙离子溶液，使PG终浓度为5 mg/mL。取900 μL该PG溶液与6 μg/m AA 100 μL混匀，于37 ℃作用6 h。然后离心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7测定PG 对AA的吸附率，重复操作三次。
1.2.6 模拟胃肠环境条件下PG吸附AA的影响
1.2.6.1 模拟胃环境
将PG冻干粉分别溶于不同pH（1.5、2.5、3.5）的人工胃液制备5 mg/mL的PG溶液。取900 μL相应PG溶液与6 μg/mL AA 100 μL混匀，37 ℃，分别作用2、4、6、8 h。然后离心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7测定PG对AA的吸附率，重复操作三次。
1.2.6.2 模拟肠环境
a.胆盐浓度对PG吸附AA的影响：将PG冻干粉分别溶于不同浓度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）牛胆盐溶液，制备5 mg/mL的PG溶液。取900 μL相应PG溶液与6 μg/mL AA 100 μL混匀，37 ℃，分别作用2、4、6、8 h，然后离心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7测定PG对AA的吸附率，重复操作三次。
b.胰蛋白酶对PG吸附AA的影响：将PG冻干粉分别溶于胰蛋白酶溶液制备5 mg/mL的PG溶液。取900 μL相应PG溶液与6 μg/mL AA 100 μL混匀，37 ℃，分别作用2、4、6、8 h，然后离心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7测定PG对AA的吸附率，重复操作三次。
1.2.7 PG对AA的吸附率的测定
采用高效液相色谱法，检测条件：色谱柱为Alltima Inertsil ODSP-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为5%甲醇溶液，流速为1 mL/min，进样体积为20 μL，紫外检测波长为205 nm。PG与AA反应离心后，测定所回收上清液中AA的含量，并按式（1）计算PG对AA的吸附率。以不加PG溶液的AA工作液为空白对照（AA含量的测定方法如上）。
吸附率(%)=(C0−Ce)C0×100 (1) 式中：C0：空白样液中AA的含量，μg；Ce：加入AA的菌悬液经离心收集的上清液中AA的含量，μg。
1.3 数据处理
每组实验重复三次，所有结果表示为
¯x ±s。数据采用SPSS 23.0进行统计分析，采用Origin 2017进行作图分析。2. 结果与分析
2.1 鉴定结果
溶菌酶是一种能够水解致病菌中粘性多糖的碱性酶，它主要作用于细菌细胞壁的肽聚糖，溶菌酶能够破坏N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸这两种结构之间的β-1,4糖苷键，从而水解肽聚糖。研究表明，溶菌酶能够识别细菌肽聚糖，常用于鉴定肽聚糖[21]。本研究的溶菌酶实验结果如图1所示。从图1中可以看出，随着溶菌酶试验的不断进行，四种溶液的吸光度均逐渐降低，最终趋于平衡，其中，植物乳杆菌1.0665的PG溶液、干酪乳杆菌ATCC 393的PG溶液和嗜酸乳杆菌KLDS 1.0307的PG溶液的吸光度均在8 h左右趋于平衡，而嗜热链球菌KLDS 1.0316的PG溶液的吸光度在10 h左右趋于平衡。以上说明提取物能够被溶菌酶完全水解，所提取的物质是肽聚糖。
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图 1 四株乳酸菌PG溶菌酶实验结果注：A：代表植物乳杆菌1.0665的肽聚糖；B：代表干酪乳杆菌ATCC 393的肽聚糖；C：代表嗜酸乳杆菌KLDS 1.0307的肽聚糖；D：代表嗜热乳链球菌KLDS 1.0316的肽聚糖。Figure 1. Lysozyme assay observed from peptidoglycans from four lactic acid bacteria2.2 PG纯度测定结果
PG纯度鉴定结果如图2所示，从图2可知，所提取的四株菌的肽聚糖样品峰面积百分比为98%~99%，证明所提取的肽聚糖样品纯度高。
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图 2 四种PG的高效液相色谱图注：A：代表植物乳杆菌1.0665的肽聚糖；B：代表干酪乳杆菌ATCC 393的肽聚糖；C：代表嗜酸乳杆菌KLDS 1.0307的肽聚糖；D：代表嗜热乳链球菌KLDS 1.0316的肽聚糖。Figure 2. High performance liquid chromatography of four PG2.3 各因素对PG吸附AA的影响
2.3.1 pH对PG吸附AA的影响
由图3可知，同一菌株PG在不同pH下对AA的吸附性存在显著差异（P<0.05）。随着pH的增大，4株乳酸菌PG对AA的吸附率呈先增大后减小的趋势，当pH为5时，4株乳酸菌PG对AA的吸附率均达到最大值，其中植物乳杆菌1.0665的PG吸附率最大，可达87.35%。当pH>5后，4株乳酸菌PG对AA的吸附率逐渐降低，在pH为11时，PG对AA吸附率最低，其范围为18.59%~51.25%。这说明酸性条件有助于PG对AA的吸附。宁妍[22]研究表明pH对PG分子某些结构的水解产生一定的影响，具体体现在一部分肽键发生水解，游离的羧基和氨基发生变化，另外水解为临近多肽链的结合作用提供了更多的空间，使其结合更易发生。且PG肽链上的第三位氨基酸是内消旋二氨基庚二酸型，且含有丙氨酸、谷氨酸等氨基酸。其中，二氨基庚二酸、谷氨酸及丙氨酸中的部分羧基可发生电离[23]。因此，pH影响了PG结构的变化，影响着基团的解离，进一步影响了PG表面结合位点的暴露，引起吸附率明显变化。
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2.3.2 温度对PG吸附AA的影响
由图4可知，同一菌株的PG在不同的温度下对AA的吸附率存在显著差异（P<0.05）。随着温度增高，4株乳酸菌的PG对AA的吸附率呈先上升后下降的趋势，当温度为37 ℃时，4株菌的PG对AA的吸附率均达到最大，其中植物乳杆菌1.0665 的PG对AA吸附率达87.35%，显著高于其它3株菌PG（P<0.05）。PG是由乙酰氨基葡萄糖、乙酰胞壁酸与4~5个氨基酸短肽聚合而成的多层网状大分子结构。PG对温度敏感，因此温度会影响PG结构变化，使PG的交联度发生变化，结合位点暴露发生变化，进而其对AA吸附效果发生明显变化。
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图 4 不同温度对PG吸附AA的影响Figure 4. Effects of different temperatures on acrylamide bound by the peptidoglycans2.3.3 时间对PG吸附AA的影响
由图5可知，在2~6 h内，4株乳酸菌的PG对AA的吸附率均随着培养时间的延长而增大，并且存在显著性差异（P<0.05），其中，植物乳杆菌1.0665的PG对AA的吸附率增长最快，共升高了37.58%。当反应继续进行时，4株菌的PG对AA的吸附率随时间的增长变得平缓，且差异不显著（P>0.05）。这与Jin等、Wang等[24-25]利用生物吸附法去除重金属发现的时间对吸附作用的影响规律相似，分析原因可能是前期PG表面存在大量的吸附位点，吸附速率较快，随着时间的逐渐延长，表面吸附结合位点达到饱和，从而吸附过程逐渐平缓，因此本实验中AA吸附最适宜时间为6 h。
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图 5 不同时间对PG吸附AA的影响Figure 5. Effects of different time on acrylamide bound by the peptidoglycans2.3.4 PG浓度对PG吸附AA的影响
如图6所示，同一菌株的PG对AA的吸附率均随着PG浓度的升高而增加，但差异不显著（P>0.05）。当PG浓度相同时，4株乳酸菌的PG对AA吸附率有显著性差异（P<0.05）。Zhang等[15]发现PG吸附AA前后，其C-O、C=O和N-H这三种官能团的波数发生了明显改变，说明四株乳酸菌PG中的这三种官能团参与了其对AA的吸附。因此，推测当PG浓度为5 mg/mL时，PG上的结合位点已经开始饱和，随着PG浓度的增加，对AA的吸附效果影响不明显。
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图 6 不同PG浓度对PG吸附AA的影响Figure 6. Effects of different peptidoglycan concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans2.3.5 AA浓度对PG吸附AA的影响
由图7可知，同一种菌株的PG在不同AA浓度条件下对AA吸附率具有显著性差异（P<0.05）。AA浓度在0.2~1 μg/mL范围内，4株乳酸菌的PG对AA的吸附率随着AA浓度的增大而降低。当AA浓度达1 μg/mL时，4株乳酸菌PG对AA的吸附率均最低。这与Gungal等[26]研究溶液中重金属吸附特性基本一致，Gungal认为这与吸附位点的饱和有关。因此推测AA浓度为0.2 μg/mL时，PG表面吸附位点开始饱和，由此之后随着AA浓度的增加，吸附率逐渐减小。
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图 7 AA浓度对PG吸附AA的影响Figure 7. Effects of acrylamide concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans2.3.6 钙离子浓度对PG吸附AA的影响
由图8可见，在 0~0.6 mol/L钙离子浓度范围内，4株菌的PG对AA的吸附率均随着钙离子浓度的增加而显著增大（P<0.05），当钙离子浓度为0.6 mol/L时，4株菌的PG对AA的吸附率达到最大，其中植物乳杆菌1.0665的PG对AA的吸附率最高，约为87.18%。当钙离子浓度继续增大至1 mol/L时，PG对AA的吸附率变化不显著（P>0.05）。
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图 8 不同钙离子浓度对PG吸附AA的影响Figure 8. Effects of Ca2+ concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans2.4 人工模拟胃环境对PG吸附AA的影响
由表1可知，在不同pH的人工胃液中，4株乳酸菌的PG对AA吸附率呈显著差异（P<0.05），但相同pH、不同作用时间条件下，4株乳酸菌的PG对AA的吸附能力基本上没有呈现显著性差异（P>0.05），这表明4株乳酸菌的PG对AA的吸附特性受pH影响很大，但与反应时间关系不大。在同一吸附时间下，4株乳酸菌的PG均在pH为3.5时对AA的吸附率最高。Zhang等[27]研究发现，胃液中乳脂链球菌的细胞对致突变物质的吸附能力受pH的显著影响。本实验也发现PG的AA的吸附率在模拟胃环境实验中受pH影响显著。Zhao等[28]发现pH显著影响植物乳杆菌对伏马菌素的结合作用，其原因是pH影响PG之间糖苷键水解，进而影响其结构变化。因此，推测pH通过影响PG结构发生变化，使其表面基团暴露，结合位点数量发生改变，从而影响吸附效果。
表 1 人工胃环境对4种PG吸附AA的影响Table 1. Effects of artificial gastric juice on acrylamide bound by the four peptidoglycansPG AA吸附率(%) 时间(h) pH 1.5 2.5 3.5 干酪乳杆菌ATCC393的PG 2 65.38±0.55Aa 61.63±0.60Ab 76.67±0.60Ac 4 60.88±0.71Ba 74.50±0.60Bb 76.57±0.51Ab 6 63.71±0.63Aa 71.44±0.49Bb 72.97±0.72Ab 8 62.75±0.67Aa 72.28±0.64Bb 75.40±0.56Ab 嗜酸乳杆菌KLDS1.0307的PG 2 50.71±0.62Aa 53.17±0.69Aa 63.79±0.60Ab 4 53.46±0.47Aa 54.78±0.62Aa 64.71±0.56Ab 6 52.78±0.65Aa 55.50±0.47Aa 65.12±0.77Ab 8 51.12±0.79Aa 50.56±0.55ABa 62.77±0.63Ab 植物乳杆菌1.0665的PG 2 70.64±0.56Aa 75.31±0.58Aa 85.56±0.55Ab 4 71.19±0.70Aa 79.51±0.46Ab 85.13±0.74Ac 6 77.26±0.64Ba 73.79±0.69ABa 83.64±0.60Ab 8 73.41±0.56ABa 77.75±0.67Aa 85.68±0.72Ab 嗜热链球菌KLDS1.0316的PG 2 35.48±0.47Aa 32.19±0.72Aa 45.81±0.61Ab 4 31.82±0.61Aa 45.30±0.57Bb 47.16±0.75Ab 6 33.55±0.56Aa 42.46±0.64Bb 43.68±0.59Ab 8 32.25±0.80Aa 43.29±0.73Bb 45.42±0.68Ab 注：表中数值均为平均值±标准差，所用试验均重复3次；同列（或行）数据中标注不同字母表示存在显著性差异（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）；表2、表3同。A、B表示四株菌株PG在相同pH条件下不同吸附时间的差异，a、b、c表示同一吸附时间条件下不同pH之间的差异。 2.5 人工模拟肠环境
2.5.1 胆盐浓度对PG吸附丙烯酰胺的影响
研究发现[29-30]，胆盐对于细菌的蛋白质和磷脂具有破坏作用。胆盐的这种破坏作用有可能会影响肽聚糖的蛋白及其氨基酸的结构，从而影响肽聚糖对丙烯酰胺的吸附作用。而本实验也发现，乳酸菌的PG对AA吸附率受胆盐影响较大。由表2看出，相同时间下，同一PG在不同浓度胆盐处理后，其对AA的吸附率存在差异，其中，嗜酸乳杆菌KLDS1.0307及嗜热链球菌KLDS1.0316的PG对AA的吸附率的最高值均出现在0.3%胆盐浓度条件下，而植物乳杆菌1.0665和干酪乳杆菌ATCC393的PG对AA的吸附率最大值出现在0.4%胆盐浓度条件下，这说明0.3%~0.4%胆盐浓度条件下更有利于乳酸菌的PG对AA的吸附；此外，在胆盐浓度相同时，不同吸附时间下，4株乳酸菌PG对AA的吸附率也存在差异，这说明作用时间对4株乳酸菌的PG吸附AA的能力也产生了较大影响，其中植物乳杆菌1.0665 PG对AA的吸附率在0.4%胆盐浓度条件下，处理4 h后达到最高，为84.67%。
表 2 胆盐浓度对4种PG吸附丙烯酰胺的影响Table 2. Effects of bile salt concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycansPG AA吸附率（%） 时间(h) 胆盐(%) 0.1 0.2 0.3 0.4 干酪乳杆菌ATCC393的PG 2 52.78±0.66Aa 49.48±0.49Ab 55.25±0.70Ac 51.41±0.60Aabc 4 61.44±0.65Ba 64.49±0.58Ba 61.49±0.68Ba 69.65±0.59Bb 6 62.33±0.61Ba 67.34±0.60Bb 64.64±0.57Bab 71.70±0.64Bc 8 55.36±0.56Aa 60.55±0.44CBb 62.73±0.34Bb 60.34±0.58Cb 嗜酸乳杆菌KLDS1.0307的PG 2 39.46±0.45Aa 55.32±0.59Ab 44.74±0.57Ac 36.79±0.61Aa 4 53.46±0.63Ba 51.23±1.22Aa 57.68±0.56Bab 49.32±0.60Babc 6 44.19±0.66Ca 45.45±0.50Ba 43.49±0.68Aa 43.65±0.58Ca 8 52.58±0.47Ba 48.07±0.73ABa 46.52±0.41Aab 49.34±0.57Bab 植物乳杆菌1.0665的PG 2 62.77±0.61Aa 66.28±0.63Aa 82.30±0.65Ab 72.64±0.60Ac 4 76.45±0.63Ba 79.51±0.50Ba 77.69±0.65Ba 84.67±0.55Bb 6 67.69±0.59Ca 71.71±0.69Ca 73.45±0.94Bab 70.66±0.56Aab 8 72.49±0.73Ba 81.51±0.46Db 75.60±0.61Ba 75.39±0.55Aa 嗜热链球菌KLDS1.0316的PG 2 28.32±0.60Aa 44.45±0.63Ab 33.77±0.50Ac 25.73±0.64Aa 4 42.43±0.53Ba 40.21±0.76Aa 46.51±0.48Bb 38.59±0.61Ba 6 33.51±0.59Ca 34.86±0.81Ba 32.30±0.51Aa 32.32±0.59Ca 8 41.59±0.67Ba 37.28±0.63Ba 35.70±0.63Aab 38.25±0.65Ba 注：A、B、C、D表示四株菌株肽聚糖在相同胆盐浓度条件下不同吸附时间的差异，a、b、c表示同一吸附时间条件下不同胆盐浓度间的差异。 2.5.2 胰蛋白酶作用时间对PG吸附AA的影响
由表3可知，经胰蛋白酶处理时，同一种菌株的PG对AA的吸附率并没有随时间变化而显著改变，说明胰蛋白酶对4株乳酸菌的PG吸附AA的能力没有显著影响（P>0.05）。而漆叶琼[16]在探究乳酸菌吸附苯并芘过程中，证明了PG是乳酸菌吸附苯并芘的关键结构，并发现经胰蛋白酶处理时，随处理时间不同，有些菌株的吸附率呈极显著差异，而有些菌株吸附率并未受到影响。进一步证实胰蛋白酶对乳酸菌吸附能力的影响具有菌株特异性。
表 3 胰蛋白酶作用时间对4种PG吸附AA的影响Table 3. Effect of trypsin action time on the adsorption of AA by 4 PGPG AA吸附率（%） 2 h 4 h 6 h 8 h 干酪乳杆菌ATCC393的PG 72.43±0.55Aa 74.50±0.64Aa 73.46±0.76Aa 74.55±0.68Aa 嗜酸乳杆菌KLDS1.0307的PG 52.54±0.51Ba 51.44±0.54Ba 52.55±0.60Ba 53.29±0.57Ba 植物乳杆菌1.0665的PG 81.74±0.64Ca 82.74±0.62Ca 81.22±0.72Ca 83.53±0.47Ca 嗜热链球菌KLDS1.0316的PG 31.52±0.69Da 33.61±0.52Da 32.56±0.53Da 33.69±0.58Da 注：A、B、C、D表示四株菌株肽聚糖间的差异，a表示同一菌株的肽聚糖处于不同时间处理间的差异。 3. 结论
因AA广泛存在于人们常用的食品中，其对人体健康又存在安全隐患，因此对AA进行生物脱毒的研究是必要的，而在生物脱毒的过程中，一些因素对脱毒效果产生的影响是不可忽视的。本实验发现4株乳酸菌的PG对AA均具有良好的吸附效果，其中植物乳杆菌1.0665的PG吸附效果最好。6种影响因素（pH、温度、时间、PG浓度、AA浓度及钙离子浓度）均对PG吸附AA具有一定的影响。其中pH、温度以及AA浓度对PG吸附AA具有明显影响，吸附率随着pH及温度的升高呈先增大后减小的趋势，且随着AA浓度的升高而减少。在6 h以内，4株乳酸菌PG对AA的吸附率随时间的延长而显著增加（P<0.05），但6 h后无显著性变化。在0.6 mol/L以内，吸附率随着钙离子浓度的增大而显著增加（P<0.05)。而PG浓度对同一菌株PG吸附AA不具有显著性。模拟胃环境下，不同pH明显影响着PG对AA的吸附效果，反应时间没有明显影响。模拟肠环境下，胆盐浓度和反应时间均显著影响PG对AA的吸附效果，而胰蛋白酶对PG吸附AA的能力没有显著影响。以上结果为AA的生物脱毒奠定了基础并提供理论支撑。
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图 1 四株乳酸菌PG溶菌酶实验结果
注：A：代表植物乳杆菌1.0665的肽聚糖；B：代表干酪乳杆菌ATCC 393的肽聚糖；C：代表嗜酸乳杆菌KLDS 1.0307的肽聚糖；D：代表嗜热乳链球菌KLDS 1.0316的肽聚糖。
Figure 1. Lysozyme assay observed from peptidoglycans from four lactic acid bacteria
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图 2 四种PG的高效液相色谱图
注：A：代表植物乳杆菌1.0665的肽聚糖；B：代表干酪乳杆菌ATCC 393的肽聚糖；C：代表嗜酸乳杆菌KLDS 1.0307的肽聚糖；D：代表嗜热乳链球菌KLDS 1.0316的肽聚糖。
Figure 2. High performance liquid chromatography of four PG
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图 4 不同温度对PG吸附AA的影响
Figure 4. Effects of different temperatures on acrylamide bound by the peptidoglycans
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图 5 不同时间对PG吸附AA的影响
Figure 5. Effects of different time on acrylamide bound by the peptidoglycans
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图 6 不同PG浓度对PG吸附AA的影响
Figure 6. Effects of different peptidoglycan concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans
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图 7 AA浓度对PG吸附AA的影响
Figure 7. Effects of acrylamide concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans
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图 8 不同钙离子浓度对PG吸附AA的影响
Figure 8. Effects of Ca2+ concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans
表 1 人工胃环境对4种PG吸附AA的影响
Table 1 Effects of artificial gastric juice on acrylamide bound by the four peptidoglycans
PG AA吸附率(%) 时间(h) pH 1.5 2.5 3.5 干酪乳杆菌ATCC393的PG 2 65.38±0.55Aa 61.63±0.60Ab 76.67±0.60Ac 4 60.88±0.71Ba 74.50±0.60Bb 76.57±0.51Ab 6 63.71±0.63Aa 71.44±0.49Bb 72.97±0.72Ab 8 62.75±0.67Aa 72.28±0.64Bb 75.40±0.56Ab 嗜酸乳杆菌KLDS1.0307的PG 2 50.71±0.62Aa 53.17±0.69Aa 63.79±0.60Ab 4 53.46±0.47Aa 54.78±0.62Aa 64.71±0.56Ab 6 52.78±0.65Aa 55.50±0.47Aa 65.12±0.77Ab 8 51.12±0.79Aa 50.56±0.55ABa 62.77±0.63Ab 植物乳杆菌1.0665的PG 2 70.64±0.56Aa 75.31±0.58Aa 85.56±0.55Ab 4 71.19±0.70Aa 79.51±0.46Ab 85.13±0.74Ac 6 77.26±0.64Ba 73.79±0.69ABa 83.64±0.60Ab 8 73.41±0.56ABa 77.75±0.67Aa 85.68±0.72Ab 嗜热链球菌KLDS1.0316的PG 2 35.48±0.47Aa 32.19±0.72Aa 45.81±0.61Ab 4 31.82±0.61Aa 45.30±0.57Bb 47.16±0.75Ab 6 33.55±0.56Aa 42.46±0.64Bb 43.68±0.59Ab 8 32.25±0.80Aa 43.29±0.73Bb 45.42±0.68Ab 注：表中数值均为平均值±标准差，所用试验均重复3次；同列（或行）数据中标注不同字母表示存在显著性差异（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）；表2、表3同。A、B表示四株菌株PG在相同pH条件下不同吸附时间的差异，a、b、c表示同一吸附时间条件下不同pH之间的差异。 
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表 2 胆盐浓度对4种PG吸附丙烯酰胺的影响
Table 2 Effects of bile salt concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans
PG AA吸附率（%） 时间(h) 胆盐(%) 0.1 0.2 0.3 0.4 干酪乳杆菌ATCC393的PG 2 52.78±0.66Aa 49.48±0.49Ab 55.25±0.70Ac 51.41±0.60Aabc 4 61.44±0.65Ba 64.49±0.58Ba 61.49±0.68Ba 69.65±0.59Bb 6 62.33±0.61Ba 67.34±0.60Bb 64.64±0.57Bab 71.70±0.64Bc 8 55.36±0.56Aa 60.55±0.44CBb 62.73±0.34Bb 60.34±0.58Cb 嗜酸乳杆菌KLDS1.0307的PG 2 39.46±0.45Aa 55.32±0.59Ab 44.74±0.57Ac 36.79±0.61Aa 4 53.46±0.63Ba 51.23±1.22Aa 57.68±0.56Bab 49.32±0.60Babc 6 44.19±0.66Ca 45.45±0.50Ba 43.49±0.68Aa 43.65±0.58Ca 8 52.58±0.47Ba 48.07±0.73ABa 46.52±0.41Aab 49.34±0.57Bab 植物乳杆菌1.0665的PG 2 62.77±0.61Aa 66.28±0.63Aa 82.30±0.65Ab 72.64±0.60Ac 4 76.45±0.63Ba 79.51±0.50Ba 77.69±0.65Ba 84.67±0.55Bb 6 67.69±0.59Ca 71.71±0.69Ca 73.45±0.94Bab 70.66±0.56Aab 8 72.49±0.73Ba 81.51±0.46Db 75.60±0.61Ba 75.39±0.55Aa 嗜热链球菌KLDS1.0316的PG 2 28.32±0.60Aa 44.45±0.63Ab 33.77±0.50Ac 25.73±0.64Aa 4 42.43±0.53Ba 40.21±0.76Aa 46.51±0.48Bb 38.59±0.61Ba 6 33.51±0.59Ca 34.86±0.81Ba 32.30±0.51Aa 32.32±0.59Ca 8 41.59±0.67Ba 37.28±0.63Ba 35.70±0.63Aab 38.25±0.65Ba 注：A、B、C、D表示四株菌株肽聚糖在相同胆盐浓度条件下不同吸附时间的差异，a、b、c表示同一吸附时间条件下不同胆盐浓度间的差异。
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表 3 胰蛋白酶作用时间对4种PG吸附AA的影响
Table 3 Effect of trypsin action time on the adsorption of AA by 4 PG
PG AA吸附率（%） 2 h 4 h 6 h 8 h 干酪乳杆菌ATCC393的PG 72.43±0.55Aa 74.50±0.64Aa 73.46±0.76Aa 74.55±0.68Aa 嗜酸乳杆菌KLDS1.0307的PG 52.54±0.51Ba 51.44±0.54Ba 52.55±0.60Ba 53.29±0.57Ba 植物乳杆菌1.0665的PG 81.74±0.64Ca 82.74±0.62Ca 81.22±0.72Ca 83.53±0.47Ca 嗜热链球菌KLDS1.0316的PG 31.52±0.69Da 33.61±0.52Da 32.56±0.53Da 33.69±0.58Da 注：A、B、C、D表示四株菌株肽聚糖间的差异，a表示同一菌株的肽聚糖处于不同时间处理间的差异。
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