Rapid Detection of Adulteration in Camel Milk by Electronic Nose
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摘要: 为了迅速准确地鉴别掺假骆驼乳的气味特征，本研究以阿拉善双峰骆驼乳为研究对象，驼乳按照不同掺假浓度分为0.1%、1%、3%、5%、10%、15%、20%和100%的牛乳梯度进行制备。根据掺假驼乳的气味特征，通过电子鼻10个传感器和多变量结合分析更快速、准确的评价掺假驼乳。最后，对验证集中的掺假驼乳样品数据进行验证。结果表明：基于电子鼻对掺假乳样挥发性成分响应值的前两个主成分为85.1%、偏最小二乘判别模型的相关系数为R2X=0.842，R2Y=0.628，Q2=0.618；揭示电子鼻可有效区分驼乳或掺假驼乳样品，且检测驼乳中牛乳掺假的最低检测限为1%，影响驼乳气味识别的关键电子鼻传感器为W5S传感器。此外，验证集掺假乳样PLS-DA模型的相关系数为R2X=0.81，R2Y=0.659，Q2=0.641；结果进一步证实了电子鼻用于鉴别驼乳气味的有效性。综上，本研究采用电子鼻技术实现了对驼乳中牛乳掺假后气味特征的快速、准确鉴别，为后续掺假驼乳气味特征成分的研究提供理论依据，同时也为其它食品类的掺假检测提供一种参考价值。Abstract: In order to more quickly and accurately identify the odor characteristics of adulterated camel milk, this research takes ALaShan Bactrian camel milk as the object. The milk is prepared according to different adulteration concentrations into 0.1%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20% and 100% milk gradients.According to the odor characteristics of adulterated camel milk, the evaluation of adulterated camel milk can be made more quickly and accurately through 10 electronic nose sensors and multivariate analysis.Finally, the data analysis of adulterated camel milk samples in the validation set was verified. The results showed that based on the response value of the electronic nose to the volatile components of adulterated milk samples, the first two principal components are 85.1%, and the correlation coefficient of the partial least squares discriminant model was R2X=0.842, R2Y=0.628, Q2=0.618. It was revealed that the electronic nose could effectively distinguish camel milk or adulterated camel milk samples, and the minimum detection limit for detecting adulterated milk in camel milk was 1%. The key electronic nose sensor that affects camel milk odor recognition was the W5S sensor. In addition, the correlation coefficients of the PLS-DA model of adulterated milk samples in the validation set were R2X=0.81, R2Y=0.659, Q2=0.641. The results further confirmed the effectiveness of the electronic nose for identifying the smell of camel milk. In summary, electronic nose technology was used to achieve rapid and accurate identification of odor characteristics of camel milk mixed with cow milk in this study, which provides a theoretical basis for the subsequent research on the odor characteristics of camel milk adulteration, and also for adulteration of other foods.
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Keywords:
- camel milk /
- cow milk /
- electronic nose /
- adulteration /
- multivariate statistical analysis
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骆驼乳富含蛋白质、维生素和矿物质，尤其是B族维生素、维生素C和铁[1]，具有一定的降血糖作用[2-4]。驼乳具有丰富的营养价值和极高的药用价值，但其产量却很少，因此骆驼乳的价格已涨至牛乳的10倍。在中国，已经有一些非法供应商在驼乳中添加其它动物乳以提高骆驼乳的“产量”，并且价格高达90~120元/公斤，欺骗消费者[5-6]。这些乳掺假现象经常发生，导致对人体健康构成重大风险[7]。乳掺假通常涉及稀释或添加廉价、低质量、危险的产品，以增加乳的体积、掩盖劣质或替换乳中的天然物质，从而获得经济利益。最简单的情况是加水以增加体积或掺入其他动物乳。如今，有更复杂的欺诈行为，包括添加三聚氰胺以增加乳经水稀释后的含氮量[8]；其他物质，如甲醛、过氧化氢、次氯酸钠、重铬酸盐和水杨酸被添加以提高产品的保质期[9]；植物油和表面活性剂用于掺假脂肪含量[10-11],以及奶酪乳清和尿素用于增加蛋白质含量[12-13]。以上多种掺假手段更难辨别出乳制品是否掺假。
现如今，人们对骆驼乳需求不断增加，骆驼乳标签错误的高发率将越来越受到人们的关注。骆驼乳样品中是否存在掺假和掺假比例的定量检测方法是迫切需要解决的问题[14]。斯仁达来[15]利用低场核磁共振技术分别对阿拉善双峰驼和新疆双峰驼驼乳样品中掺入牛乳、羊乳、豆浆、尿素、水，进行了检测。Mabood等[16]采用新的近红外光谱结合多元分析法对驼乳与羊乳掺假进行了检测和定量分析。贾茹等[17]使用电子鼻和多元统计学方法结合对羊乳中的蛋白质掺假进行定性分析和定量分析研究。金嫘等[18]采用电子鼻技术检测羊乳中掺入不同比例牛乳的混合物中挥发性气味物质的响应值进行有效分析，结果发现对于生乳和巴氏杀菌乳，PCA分析和PLS-DA分析均可以较好地区分不同比例羊乳和牛乳的混合物。目前，还尚未报道基于电子鼻检测驼乳的掺假，因此，开发出对驼乳掺假进行有效鉴别的技术与方法对保障消费者的利益具有重要意义。
本研究围绕骆驼乳气味特征，对掺入不同浓度牛乳的驼乳进行电子鼻结合多元统计分析，探索基于电子鼻技术确定驼乳中牛乳掺假的最低检测限，这将有助于对市场上的乳及乳制品更有效地监管；同时也为其它食品类的掺假检测提供一种理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜骆驼乳和牛乳 均采自内蒙古自治区阿拉善盟所属的牧区，驼乳和牛乳采集后迅速放置于4 ℃冰箱保存；电子鼻（PEN3） 德国Arisense公司。
1.2 样品的制备
骆驼乳平分为9组，按照牛乳浓度分别为0%、0.1%、1%、3%、5%、10%、15%和20%以及100%的梯度进行配制，具体见表1。为了减小误差，掺假乳样的制备均为在室温下现做现配，超声10 min充分混匀[19]，以确保每个掺假样品的气味完全挥发，每组制备20个平行。本研究采用duplex方法，随机分成实验集和验证集[20]。使用这种方法分别将9组掺假乳样划分为135个实验集，45个验证集。
表 1 不同比例掺假样品的制备Table 1. Preparation of adulterated samples with different ratios组别 C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 比例（%） 0 0.1 1 3 5 10 15 20 100 驼乳（mL） 200 199.8 198 194 190 180 170 160 0 牛乳（mL） 0 0.2 2 6 10 20 30 40 200 1.3 电子鼻数据采集
取10 mL样品置于离心管中，并用封口膜进行密封，检测时采用手动顶空进样方式，零气针和电子鼻进样针同时插入密封的离心管中进行采样，并将挥发性气体吸入电子鼻的传感器系统中进行检测，电子鼻试验参数见表2。
表 2 电子鼻试验参数Table 2. Electronic nose test parameters项目 参数 零气 清洁空气，用木炭过滤器过滤的气体 样品瓶中的样品量 10 mL 样品瓶体积 50 mL 内部流量 400 mL/min 进样流量 400 mL/min 测试温度 25 ℃ 样品准备时间 5 s 样品测定时间 120 s 测量计数 1 s 自动调零时间 10 s 清洗时间 90 s 1.4 数据处理
电子鼻10个传感器的响应值采用Excel进行处理；多元统计分析采用SIMCA 14.1软件（Umetrics，瑞典）进行主成分分析（principal components analysis，PCA）、偏最小二乘法判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）。
2. 结果与分析
2.1 电子鼻对未掺假驼乳的响应
以未掺假驼乳样品为例，电子鼻的10个传感器的响应值如图1所示。G/G0代表对样品挥发性成分的响应强度。从图1中可以看出，105～109 s时间段内呈稳定状态，因此平均值作为输出值进行分析。W5S号传感器信号最强，响应物质范围广且灵敏度高，主要检测氮氧化合物；接下来是W2W传感器响应值，主要检测芳香族化合物；通过电子鼻响应值可以较好地筛选出电子鼻10个传感器对样品的贡献率。
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图 1 电子鼻10个传感器对驼乳的响应曲线Figure 1. Response curve of 10 sensors of electronic nose to camel milk2.2 电子鼻对不同比例掺假驼乳响应的多元统计分析
电子鼻对驼乳不同浓度掺假，C0、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C8（0%、0.1%、1%、3%、5%、10%、15%、20%以及100%）的响应值差异如图2所示。首先对135个实验集数据进行主成分分析（PCA）。主成分分析是将多个指标转换为少数几个综合指标的统计方法，即数据降维的一种方法[21]。如图2A所示，第一主成分（PC1）为69.2%，第二主成分（PC2）为15.9%，前2个主成分代表了样本中85.1%的信息，前2个主成分大于85%，可以综合反映电子鼻数据，可进行下一步分析。C0（驼乳组）与C1（0.1%牛乳组）接近，较难辨别。但其他不同浓度掺假组在PCA得分图上的区分较为明显，C2（1%牛乳组）与C0、C1可以较好地区分开。上述结果表明，采用电子鼻检测驼乳中掺入牛乳的最低检测限为1%，并且可以客观地反映不同的掺假浓度。因此，即使电子鼻是模拟人体嗅觉而制成，但是分析所识别的掺假浓度比人体嗅觉更精确。
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图 2 实验集不同浓度掺假驼乳电子鼻响应值的PCA得分图（A）、PLS-DA得分图（B）和置换检验图（C）Figure 2. PCA score chart (A), PLS-DA score chart (B) and displacement test chart (C) of the response value of the electronic nose of adulterated camel milk in experimental set为了探讨是否可以使用电子鼻检测来判别不同浓度的掺假驼乳，以电子鼻10个传感器响应值为X变量，以不同掺假浓度分组（0%、0.1%、1%、3%、5%、10%、15%、20%以及100%）为Y变量做偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。偏最小二乘判别分析是一种模式识别的监督方法，通常比PCA分析可获得更好的分类结果[22]。如图2B所示，不同浓度掺假的聚类结果类似于主成分分析的结果（R2X=0.842，R2Y=0.628，Q2=0.618）。R2X、R2Y、Q2为偏最小二乘法建立模型的相关系数，模型中R2X和R2Y越接近于1，说明模型的预测性能越好[23]；Q2大于0.5，表明模型具有良好的预测能力[24]。在PLS-DA模型中过度拟合是一个普遍出现的问题[25]，为了进一步验证PLS-DA模型的可靠性，执行了置换检验以验证模型（图2C）。对建立模型时的Y矩阵的变量100次置换检验，得到随机的不同相应Q2值作为衡量模型的过拟合标准[26-27]，得出R2=0.00242，Q2=−0.116，Q2负值表明模型稳定可靠，未出现过拟合现象[28]。因此对不同浓度掺假驼乳的判别是有效的。
2.3 筛选对掺假驼乳识别的关键传感器
电子鼻的每个传感器对多种物质都有交互的嗅觉敏感性，但是敏感性不同。为了进一步探讨电子鼻传感器对掺假浓度分组的贡献，筛选出影响掺假驼乳识别的关键传感器，采用上述PLS-DA模型进行因子载荷分析。因子载荷图是可以反应每个变量在得分图上的贡献[29]，如图3所示，电子鼻传感器中对掺假驼乳识别影响较大的可能是W5S传感器，其结合的载荷系数w×c值为0.51，10个传感器中W5S载荷系数w×c为最大。因此，推测为W5S传感器对掺假驼乳特征的挥发性物质灵敏度较高，贡献为最大；其次是W2W传感器，w×c值为0.47。进一步采用投影重要的变量VIP值（variable important for the projection，VIP）筛选关键传感器的差异，如图4所示。结果表明，VIP值大于1.0的变量包括W5S和W2W，其中以W5S的VIP值为最高，从上述结果可知W5S传感器是识别不同浓度掺假奶样的关键因子。
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图 4 实验集不同浓度掺假驼乳的电子鼻综合响应PLS-DA的VIP图Figure 4. VIP plot of the comprehensive response PLS-DA of the electronic nose with different concentrations of adulterated camel milk2.4 电子鼻用于检测不同浓度掺假驼乳的进一步验证
收集45个样品作为验证集，再对上述实验集的结果进行验证鉴别，如图5所示，C0、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C8（0%、0.1%、1%、3%、5%、10%、15%、20%以及100%）不同掺假浓度样品在电子鼻响应值的PCA得分图如图5A所示，PC1=65%，PC2=16.7%。PLS-DA模型R2X=0.81，R2Y=0.659，Q2=0.641，表明PLS-DA模型在验证集样本中具有较好的预测能力（图5B）。验证集的100个随机置换测试的结果表明：R2=0.0533，Q2=−0.2127，说明模型尚未存在过拟合（图5C）。因子载荷图显示W5S传感器载荷系数w×c最大，进而得出识别不同浓度掺假组贡献率最大的关键因子为W5S传感器（图5D）。验证集的多元统计分析结果与实验集得出的结论一致，又一次证明了电子鼻可用于不同浓度掺假气味特征的快速检测和识别，这为广大消费者及各乳品企业提供了良好的依据。
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图 5 验证集不同浓度掺假驼乳电子鼻响应值的PCA得分图（A）、PLS-DA得分图（B）、置换检验图（C）和PLS-DA因子载荷图（D）Figure 5. PCA score chart (A), PLS-DA score chart (B), displacement test chart (C) and PLS-DA factor loading chart (D) of the response value of the electronic nose of adulterated camel milk in the validation set3. 结论
根据骆驼乳的独特气味，开展电子鼻对掺假驼乳进行了研究。结果表明，利用电子鼻的10个传感器结合多元统计学方法分析，可实现对掺假驼乳的客观、有效判别；电子鼻中的W5S传感器是判别驼乳中牛乳掺假的关键因子。基于主成分分析和偏最小二乘判别分析最终确定驼乳中牛乳掺假的最低检测限为1%。因此，这项研究为基于电子鼻对骆驼乳独特气味特征的识别提供了一种快速，准确的方法。这将有助于对市场上的乳及乳制品更有效地监管；同时也为其它食品类的掺假检测提供一种参考价值。
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图 1 电子鼻10个传感器对驼乳的响应曲线
Figure 1. Response curve of 10 sensors of electronic nose to camel milk
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图 2 实验集不同浓度掺假驼乳电子鼻响应值的PCA得分图（A）、PLS-DA得分图（B）和置换检验图（C）
Figure 2. PCA score chart (A), PLS-DA score chart (B) and displacement test chart (C) of the response value of the electronic nose of adulterated camel milk in experimental set
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图 4 实验集不同浓度掺假驼乳的电子鼻综合响应PLS-DA的VIP图
Figure 4. VIP plot of the comprehensive response PLS-DA of the electronic nose with different concentrations of adulterated camel milk
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图 5 验证集不同浓度掺假驼乳电子鼻响应值的PCA得分图（A）、PLS-DA得分图（B）、置换检验图（C）和PLS-DA因子载荷图（D）
Figure 5. PCA score chart (A), PLS-DA score chart (B), displacement test chart (C) and PLS-DA factor loading chart (D) of the response value of the electronic nose of adulterated camel milk in the validation set
表 1 不同比例掺假样品的制备
Table 1 Preparation of adulterated samples with different ratios
组别 C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 比例（%） 0 0.1 1 3 5 10 15 20 100 驼乳（mL） 200 199.8 198 194 190 180 170 160 0 牛乳（mL） 0 0.2 2 6 10 20 30 40 200 
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表 2 电子鼻试验参数
Table 2 Electronic nose test parameters
项目 参数 零气 清洁空气，用木炭过滤器过滤的气体 样品瓶中的样品量 10 mL 样品瓶体积 50 mL 内部流量 400 mL/min 进样流量 400 mL/min 测试温度 25 ℃ 样品准备时间 5 s 样品测定时间 120 s 测量计数 1 s 自动调零时间 10 s 清洗时间 90 s
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