Research Progress on Chemical and Biological Synthesis of Astaxanthin
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摘要: 虾青素是一种重要的次级类胡萝卜素，具有极强的抗氧化性能，在食品、化工、医疗、水产养殖等方面具有广泛应用。虾青素的合成方法有化学合成及生物合成，化学合成是目前商业化虾青素来源，但生物合成的虾青素更安全，在食品、保健品行业更受欢迎。研究发现生物体内虾青素的代谢合成与油脂代谢路径间存在着一定的联系。本文综述了虾青素的化学合成法和生物合成法，重点综述了微生物中参与虾青素生物合成的关键基因及其代谢调控网络。概述了利用随机诱变、代谢工程、酶工程等手段提高细菌、酵母、海洋真核微生物等虾青素合成积累的研究进展。本文可为虾青素的高效合成研究提供理论指导。Abstract: Astaxanthin is an important secondary carotenoid with extremely strong antioxidative properties and is widely used in food, chemicals, pharmaceuticals, aquacultures and so on. The synthetic methods of astaxanthin include chemical synthesis and biosynthesis. Chemical synthesis of astaxanthin is the source of commercial astaxanthin, while biosynthesis of astaxanthin is safer and more popular in food and health products industries. This review summaries chemical synthetic and biosynthetic pathway of astaxanthin, with emphasizing on the biosynthetic pathways of astaxanthin, key genes involved in biosynthetic and metabolic network of astaxnathin in microorganisms and plants. The research progress of using random mutagenesis, metabolic engineering, enzyme engineering and other methods to improve the synthesis and accumulation of astaxanthin in bacteria, yeast, and marine eukaryotic microorganisms is summarized. This article can provide theoretical guidance for the research on the efficient synthesis of astaxanthin.
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Keywords:
- astaxanthin /
- chemical synthesis /
- biosynthesis /
- metabolic pathway
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虾青素（C40H52O4）是一种酮式类胡萝卜素，化学名为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，化学结构如图1所示：四个异戊二烯通过共轭双键连接，两端连接两个异戊二烯组成的六元环。虾青素有三种旋光异构体，三种旋光异构体的区别在于全反式虾青素的立体异构体中，消旋虾青素的抗氧化活性最低，右旋虾青素清除自由基能力最强，而左旋虾青素对于脂质过氧化的抑制作用和免疫活性较强[1-2]。虾青素除了具有抗氧化活性外，还具有抗癌、抗炎、抗糖尿病等多种功效[3]。此外，虾青素是唯一可以穿透血脑和血视网膜屏障并对中枢神经系统和脑功能有积极作用的类胡萝卜素。因此，虾青素被广泛应用于食品、医疗保健、化妆品及饲料添加剂中[4]。
天然虾青素主要存在于海洋环境中，以游离态和酯化态等形式存在。游离态虾青素不稳定，易被氧化。虾青素由于末端环状结构中羟基的存在，易与脂肪酸结合形成虾青素酯而稳定存在。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）中约95%的虾青素分子被脂肪酸酯化并存储在富含三酰甘油的胞质脂质体中[5]。酯化态虾青素根据其结合的脂肪酸不同分为虾青素单酯和虾青素二酯。H. pluvialis可积累高达4%的虾青素（按干重计），HOLTIN等[6]发现在强光照胁迫下积累的虾青素的95%被脂肪酸酯化。虽然目前尚不清楚生物体内虾青素和脂肪酸的相互作用机理，但在H. pluvialis中观察到了虾青素和脂肪酸生物合成的化学计量关系。CHEN等[7]剖析了H. pluvialis中虾青素和脂肪酸两个生物合成途径之间协调机制，并揭示这种相互作用发生在代谢物水平，而不是转录水平，而且体内和体外实验表明虾青素的酯化作用促进了虾青素的形成和积累。
目前国内外制备虾青素的方法主要可以分为两类：化学合成法和生物合成法。化学合成的虾青素为三种结构的混合物[5,8]（左旋：消旋：右旋1：2：1），化学合成虾青素主要作为工业染料，但在食品、医药领域不被允许使用。生物合成的虾青素允许在食品、医药领域使用。自然界中某些微藻、真菌、细菌和特定种类的植物具有合成虾青素的能力。H. pluvialis被认为是自然界中最有前途的虾青素生产者之一。近些年研究发现，破囊壶菌属（Thraustochytrium）多个菌株也具备合成虾青素的能力[9]，合成的左旋虾青素占虾青素总量的90%以上。前期研究者综述了虾青素的化学合成方法及路径[10]，概述虾青素的天然生产者的生产水平现状[11]。本综述将从化学合成、生物合成两个方向切入，在综述化学合成路线的基础上，着重对虾青素的生物合成及不同生物体内虾青素的合成代谢路径进行总结。本文力求能够为读者搭建虾青素的生物合成宏观体系，帮助读者快速了解虾青素合成方法的研究进展。
1. 化学合成虾青素
化学合成虾青素分为全合成法和半合成法。虾青素全合成法以化工原料为原材料，通过化学合成反应来获得虾青素。半合成法是利用角黄质、叶黄素和玉米黄质等类胡萝卜素作为原料来制备虾青素的方法。
1.1 虾青素化学全合成法
国内外对于虾青素的化学全合成路线都展开了一系列的研究。国外霍夫曼罗氏公司与巴斯夫公司是化学合成虾青素的两家主要企业，两家公司利用化学合成法生产虾青素的合成路线相似，采用C9＋C6→C15，2C15＋C10→C40 路线。霍夫曼罗氏公司以6-氧代异佛尔酮为原料[12]，首先利用丙酮与甲醛在弱碱条件下发生羟醛缩合失水生成α-β不饱和丁烯酮，再与乙炔发生1,2-亲核加成生成六碳炔叔醇，并在硫酸作用下重排，保护产物的羟基使其与6-氧代异佛尔酮发生反应，最后在强碱作用下发生双边的Wittig反应合成虾青素。巴斯夫公司合成路线[13-14]中合成中间的体六碳炔叔醇并不先经过酸化重排，而是将羟基进行保护后与6-氧代异佛尔酮发生一系列转化，在转化的过程中进行重排，最终得到目标产物虾青素。国内皮士卿等[10]合成虾青素路线则与国外合成路线不同，采用C13＋C2→C15，2C15＋C10→C40 的合成路线来制备虾青素。他以α-紫罗兰酮为原料，经过间氯过氧苯甲酸处理，经过一系列的中间转化过程后，在氢溴酸作用下酸化重排，再与三苯基膦作用生成十五碳三苯基季鏻盐，最后进行双向Wittig反应生成虾青素。皮士卿等[10]合成路线的独特之处在于采用一种新的方法合成关键中间体C15化合物，该方法的起始原料易得、反应的选择性高、总收率高。
Witting反应是虾青素的全合成路线特征反应。此类合成路线具有工艺简单，成本低的优点。虽然霍夫曼罗氏公司与巴斯夫公司这两条路线工艺流程很复杂，生产过程较长、中间过程的控制难度较大、要求严格，但其合成成本低、价格便宜，且已经实现工业化生产，是市场上虾青素供应的最主要工业化来源（图2）。
1.2 虾青素化学半合成法
半合成法是利用角黄质、叶黄素和玉米黄质等类胡萝卜素作为原料来制备虾青素的方法[15]。经典的方法是以叶黄素为起始原料，叶黄素在碱的催化下发生异构化反应生成玉米黄质。以1，2-丙二醇为溶剂，氢氧化钾作为催化剂，在110 ℃下反应168 h，玉米黄质在碘和溴酸钠的作用下直接氧化为虾青素。
以角黄素为原料时则经过碱化、硅醚化、环氧化、水解4个过程合成虾青素，具有合成快捷、收率高（约产率60%）的特点。由于角黄素的成本高，且生产过程中有一定的危险性，目前难以达到大规模工业化生产。与全合成法相比，半合成法合成的虾青素生物活性高，但产率低，实现规模化生产困难（图3）。
2. 生物合成虾青素
2.1 虾青素合成代谢路径
虾青素是C40类胡萝卜素代谢的最终产物。生物体内类胡萝卜素的合成又可以分为三个阶段，第一阶段为中心碳代谢，第二阶段为类胡萝卜素前体物质异戊烯焦磷酸酯（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸酯（DAMPP）的合成，第三阶段为类胡萝卜素的合成。
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图 2 霍夫曼罗氏公司虾青素合成路线（a）和巴斯夫公司虾青素合成路线（b）Figure 2. Routes for chemical synthesis of astaxanthin by F. Hoffmann-La Rocha（a）and BASF（b）第一阶段为中心碳代谢循环。生物体利用葡萄糖、果糖等碳源通过糖酵解途径合成甘油三磷酸（G3P）、丙酮酸（Pyruvate）和乙酰辅酶（Acyl-CoA）等物质。甘油三磷酸、丙酮酸和乙酰辅酶作为IPP和DAMPP的前体物质流入下一阶段。同时，一部分乙酰辅酶进入三羧酸循环（TCA）。三酸酸循环是三大营养素（糖类、脂类、氨基酸）的最终代谢路径，也是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。三羧酸循环合成多种代谢产物，流向细胞代谢的各个方向，同时三羧酸循环还产生大量腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和还原型辅酶Ⅱ（NADPH），为后两个阶段中物质转化提供能量和还原力。
第二阶段为类胡萝卜素的前体物质IPP和DAMPP的合成。IPP和DAMPP的合成有两种天然合成途径：甲羟戊酸途径（MVA）和甲基赤四醇4-磷酸（MEP）途径。MVA途径主要存在于真核及古生菌中，是古细菌、酵母及部分革兰氏阳性细菌中形成IPP的唯一途径[16]。MEP途径则存在于植物、藻类和大多数细菌中。这些植物和藻类可以通过细胞质中的MVA途径和质体中的MEP途径产生IPP[17-18]。直到20世纪末，MVA仍被认为是包括类胡萝卜素在内的萜类合成的异戊二烯前体的唯一来源。在MVA途径中，Acyl-CoA在Acyl-CoA硫醇酶、β-合酶及β-还原酶的作用下生成三羟基-三甲基戊二酰辅酶（HMG-CoA），HMG-CoA在HMG-CoA还原酶的作用下形成甲羟戊酸盐，甲羟戊酸盐经过一系列的磷酸化反应合成IPP。在MEP途径中，甘油三磷酸和丙酮酸分子经过缩合及异构化反应形成MEP，MEP与三磷酸胞苷偶联后经过一系列的磷酸化反应形成IPP，IPP通过异构化反应生成同分异构体DAMPP。早期研究表明，MVA途径已在许多绿藻和红藻中丢失，MEP途径是雨生红球藻中IPP合成的唯一路径[19]。随着研究的不断深入，多重结果表明MEP途径是IPP合成的唯一路径这一现象在绿藻细胞中可能普遍存在[20]。而在Aurantiochytrium sp. SK4在转录组数据中却未发现MEP途径的大多数基因，而是甲羟戊酸（MVA）途径参与了Aurantiochytrium sp. SK4细胞内IPP的形成[21]。此外，Henry等[22]在植物中发现了由胞质中磷酸异戊基激酶催化的第三种途径。这种MVA途径与在某些古细菌和细菌的叶绿素门中发现的另一种MVA途径在形成MVAP过程路径相同，区别在于细菌中的MVAP通过磷酸甲戊二烯酸脱羧酶（MPD）转换为异戊烯基磷酸（IP），随后被异戊烯基单磷酸激酶（IPK）磷酸化为IPP。植物中虽然有MVA和MEP两条路径，但植物体内类胡萝卜素前体主要来源于MEP途径[23]。
第三阶段为类胡萝卜素类物质的合成。DAMPP和IPP以1:3的比例在焦磷酸合成酶（CrtE）的作用下合成法尼基二磷酸（FPP），FPP在焦磷酸合成酶的作用下生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）。GGPP在八氢番茄红素合成酶（CrtB）和植物烯去饱和酶（CrtI）作用下缩合形成番茄红素，番茄红素在番茄红素环化酶（CrtY）作用下合成β-胡萝卜素。第三阶段虾青素的合成在不同生物体内合成路径有所不同，但主要都是通过β-胡萝卜素羟基化和酮基化合成。在红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）中，虾青素由玉米黄质在细胞色素P450酶作用下催化合成[24]；在细菌和藻类中，主要通过β-胡萝卜素羟化酶（CrtZ）和β-胡萝卜素酮醇酶（CrtW或BKT）催化合成。玉米黄质是由β-隐黄质经专一性酶β-胡萝卜素羟化酶作用转化而成，β-胡萝卜素中的烯酮和4-酮体玉米黄质在β-胡萝卜素酮醇酶作用下合成角黄素，角黄素经由磷黄嘌呤（角磷酰胺）形成虾青素。在不同物种中，β-胡萝卜素羟化酶和β-胡萝卜素酮醇酶将β-胡萝卜素催化生成虾青素的过程中作用的先后顺序不一样。LIU等[25]在集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）中使用异源表达的雨生红球藻的β-胡萝卜素酮醇酶发现，集胞藻细胞中首次合成虾青素，且含量达到（4.81±0.06） mg/g细胞干重（DCW）。体外试验[26-27]也进一步证实，在雨生红球藻中虾青素合成的最佳路径是酮醇酶的催化反应在前，其次是羟化酶的羟基化反应（图4）。
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图 4 虾青素生物合成代谢路径图注：a：MVA途径，多存在于真核生物及古生菌。b：MVA途径，在植物中发现。c：MEP途径常存在于植物及大多数细菌中。d：为人工途径，利用异戊烯醇合成IPP。e：类胡萝卜素合成路径。f：为虾青素合成路径。Dxs，1-脱氧-d -木糖5-磷酸合成酶；Dxr，1-脱氧-d -木糖5-磷酸还原异构酶；IspD，2- c -甲基- d -赤藓糖醇4-磷酸胞苷转移酶；IspE，4-二磷脂酰-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶；IspF，4-二磷脂酰-2-C甲基-D-赤藓糖醇激酶；IspG，4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶；IspH，4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶；CK，胆碱激酶。Figure 4. Biosynthetic pathway of astaxanthin2.2 细菌合成虾青素
虾青素已在革兰氏阳性细菌短波单胞菌（Brevundimonas sp.）和革兰氏阴性细菌鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）、海云衫副球菌（Paracoccus haeundaensis）、甲基单胞菌属（Methylomonas sp.）和石垣嗜热链球菌（Altererythrobacter ishigakiensis）等几类细菌中被发现（表1）。
表 1 合成虾青素的细菌Table 1. Bacteria for the synthesis of astaxanthin类型 菌株 虾青素含量 实验策略 发酵条件 参考文献 天然菌株 海云杉副球菌
Paracoccus sp. N-81106480 mg/L 随机诱变，虾青素合成基因过表达 25 ℃，OEG培养基，分批发酵 [28] 天然菌株 鞘氨醇单胞菌
S. astaxanthinifaciens sp. CC-AMO-30BT40 mg/g（DCW） — 使用MA或海洋肉汤在30 ℃下培养菌株48 h [29] 天然菌株 石垣曲霉
A. ishigakiensis sp. JPCCMB0017T定性检测 — 肉汤培养基 [30] 天然菌株 短波单胞菌.N-5
Brevundimonas sp.strain N-54.6 μg/g虾青素（3S-3'S）异构体
约占总类胡萝卜素的60.6%— 中等通气的NB肉汤培养基 [31] 工程菌株 谷氨酸棒杆菌MB001
C. glutamicum MB001摇瓶0.4 mg/L/h 干重100 g/L 表达（F. pelagi）的番茄红素环化酶基因crtY，β-胡萝卜素酮醇酶基因crtW，和羟化酶基因crtZ 30 ℃，在500 mL烧瓶中以50 mL的体积进行的，两个挡板以120 r/min摇动。 [32] 工程菌株 大肠杆菌BW-ASTA
E. coli BW-ASTA48 h虾青素作为唯一类胡萝卜素（>95%），浓度为（1.41±0.1）mg/g DCW） 利用λ-Red重组技术重组crtW和crtZ，基因分别来自N. punctiforme和P. ananatis 含葡萄糖和IPTG的培养基 [33] 工程菌株 甲基单胞菌16a
Methylomonas sp. strain 16a占总类胡萝卜素的90% β-类胡萝卜素酮醇酶基因crtW（Paracoccus sp.）和crtE idi crtYIB的基因的不同组合 分批发酵，875 mL/min的输送（26.3%的甲烷，53.1%的氮气和20.6%的氧气）压力为0.25 Psi，297~648 r/min，30 ℃ [34] 工程菌株 甲基单胞菌 16a
Methylomonas sp. strain 16a虾青素占总类胡萝卜素的90% 血红蛋白基因（Methylomonas sp.16a）与crtW，crtZ（S. astaxanthinifaciens sp.）在Methylomonas sp.中的共表达 550 mL装有甲烷（25%在空气中）作为唯一碳和能源的瓶子中的10 mL培养基中在30 ℃、250 r/min的速度振荡2~3 d。 [35] 一些细菌中虾青素合成代谢的前体物质的存在，以及虾青素合成途径中多种关键基因的确定，为构建虾青素高产工程菌株提供了可能。研究发现，通过将海洋细菌海云衫副球菌来源的类胡萝卜素基因 crtW、 crtZ、 crtY、crtI、crtB和crtE转入E.coli，成功地构建出产虾青素的大肠杆菌工程菌株，且产量高达400 μg/g DCW[36]。在E.coli中，两种主要限速酶DXP合酶（DXP）和IPP异构酶（IDI）过表达增加IPP和DMAPP的供应。通过增加异戊二烯前体的代谢通量，可以使番茄红素或β-胡萝卜素等类胡萝卜素的产量显著增加。然而，对于大肠杆菌中虾青素的异源生物合成而言，将β-胡萝卜素转化为虾青素是实现虾青素高效生物合成的最关键步骤。利用λ-Red重组技术构建出不含质粒的E.coli，将菠萝泛菌（Pantoea ananatis）和念珠藻的叶黄素生物合成基因整合到E.coli BW-CARO的染色体上得到工程菌株E.coli BW-ASTA，该菌株异源表达后得到虾青素产量为1.4 mg/g DCW。在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中表达Fulvimarina pelagi来源番茄红素环化酶CrtY，β-胡萝卜素酮醇酶CrtW和β-胡萝卜素羟化酶CrtZ的编码基因后，C. glutamicum成功合成虾青素，产量可以达到0.4 mg/L/h[32]。虽然细菌自身合成虾青素的水平与藻类差距较大，但细菌中虾青素的合成具有重要意义，为后续工程菌株的构建提供了相应的基因序列。
2.3 酵母合成虾青素
目前，红发夫酵母是天然虾青素的主要酵母来源，已经应用于水产饲料行业。对红发夫酵母合成虾青素的研究主要集中在菌株分离、诱变以及基因工程获得虾青素高产菌株方向。红发夫酵母是一种担子菌真菌，属于兼性嗜冷的低温型酵母，其合成的虾青素为右旋结构，是红发夫酵母次级代谢合成的主要类胡萝卜素。野生型红发夫酵母合成虾青素的浓度约为200~400 μg/g DCW，菌株突变能够获得高产虾青素的突变体菌株。通过抗霉素、亚硝基胍（NTG）、甲基硝基亚硝基胍等化学试剂、紫外及低能流子束技术对野生红发夫酵母菌株进行诱变，通过筛选获得虾青素高产菌株（诱变菌株的总结见表2），Phaffia rhodozyma ZJB00010经低能离子束注入诱导获得的E5042菌株中产量可达到2512 µg/g[37]。红发夫酵母能利用多种碳源、发酵周期短、能够在发酵罐中实现高密度培养、生产速度快的优势，使其已成为工业化生产虾青素的优良菌种。
表 2 合成虾青素的酵母Table 2. Yeast for the synthesis of astaxanthin类型 突变菌株 虾青素含量 实验策略 发酵条件 参考文献 野生菌株 P. rhodozyma Y1654 7 7 µg/g 利用不同碳源发酵 20 °C，180 r/min，7 d [38] 诱变菌株 P. rhodozyma E5042 2512 µg/g 低能离子束注入 [37] 诱变菌株 P. rhodozyma YZUXHONG686 2.24 mg/g NTG&UV [39] 工程菌株 Y. lipolytica ST7403 3.5 mg/g 引入基因crtZ（P. ananatis）和crtW（Paracoccus sp. N81106）的多个整合 （YP+8%葡萄糖）的酵母提取蛋白培养基；30 ℃ [40] 工程菌株 Y. lipolytica ST7976 6 mg/g（DCW）
占总类胡萝卜素的47%bkt和crtZ/crtZ基因组合转化；
基因来自H. pluvialis20 g/L酵母提取物，40 g/L蛋白胨，低流速低加葡萄糖保持浓度低于5 g/L（1L反应器）30 ℃，7 d [41] 工程菌株 S. cerevisiae YastD-03 8.10 mg/g（DCW）3S-3'S crtE、crtI、crtYB（P. rhodozyma）; trHMG1、bkt和 crtZ（H. pluvialis） 50 mL的YPD 培养基中加入 0.52 mmol/L Fe2+；20 g/L D-半乳糖，20 g/L 蛋白胨，10 g/L酵母提取物；30 ℃，220 r/min，摇瓶 [42] 工程菌株 S. cerevisiae YPP9 4.7 mg/g（DCW） 引入bkt和crtZ 基因（H. pluvialis） 50 mL的YPD 培养基中加入 0.52 mmol/L of Fe2+；20 g/L D-半乳糖，20 g/L 蛋白胨，
10 g/L 酵母提取物；30 ℃，220 r/min，摇瓶[43] 此外，酵母工程菌株在虾青素生产方面有很好的应用前景（表2）。解酯耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）具有较高的IPP和DMAPP产量，研究发现CrtZ是催化β-胡萝卜素转化为虾青素的关键酶，在解酯耶氏酵母基因组中引入来源于念珠藻（Pantoea ananatis）的β-胡萝卜素羟化酶CrtZ编码基因和来源于Paracoccus sp.
N81106的β-胡萝卜素酮醇酶CrtW的编码基因，得到的工程菌株ST7403中虾青素产量高达3.5 mg/g DCW（54.6 mg/L）[40]。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中通过基因工程导入雨生红球藻的crtZ和bkt基因能够提升β-胡萝卜素向虾青素的转化效率，实现细胞内虾青素的积累。在GGPP合酶的阳性突变体中过表达tHMG1，CrtI CrtY和CrtB三种限速酶的编码基因，优化后的二倍体菌株中过表达CrtZ、BKT的编码基因，虾青素累积量可达到了8.10 mg/g DCW[42]，值得注意的是合成的虾青素为左旋结构。 2.4 微藻合成虾青素
微藻通常是指含有叶绿素a并能进行光合作用的微生物的总称。多数微藻不仅能够合成多不饱和脂肪酸、微藻多糖等多种生物活性成分，还能够积累大量类胡萝卜素。部分微藻自身具有完整的虾青素合成路径。其中，雨生红球藻、小球藻等淡水单细胞微藻是虾青素生物合成的主要资源。此外，衣藻（Halamidomonas）、裸藻（Euglena）、伞藻（Acetabularin）中也含有虾青素。
在受到环境些胁迫时，微藻细胞会从绿色营养形态向红色囊肿形态转化，这是由于微藻细胞内合成了大量虾青素来抵抗对自身生长不利的环境。在小球藻中发现虾青素的生物合成始于指数早期。细胞通常在最佳条件下生长，细胞为绿色营养形态；应激条件下诱导虾青素积累，细胞呈现红色的囊状形态。与构成光合作用结构和功能成分的初级类胡萝卜素（如β-胡萝卜素、玉米黄质和叶黄素）不同，虾青素能够在强光，高盐度和营养缺乏等压力条件下大量积累。在低营养、强光等环境应激条件下，包囊开始形成，积累大量虾青素。光照、温度、盐度、化学试剂均在分子水平上对虾青素合成产生影响。在高温条件下细胞内产生的过量的低活性氧使得类胡萝卜素代谢减弱，高光照[44]及乙酸盐[45]、茉莉酸甲酯[46]、赤霉素[46]等均具有促进类胡萝卜素生物合成途径相关的关键基因表达的功能。乙酸盐、茉莉酸甲酯、赤霉素通过增强crtZ基因的表达并抑制lcyE基因的表达进一步促进虾青素的生物合成。与乙酸盐等诱导条件相比，高光照影响pds，crtISO，lcyB，lut1，lut5和zep基因表达，更大程度促进了类胡萝卜素生物合成，是类胡萝卜素合成相关基因表达变化的主要驱动力。研究表明，在高光照条件下，卡尔文循环和三羧酸循环为其他代谢提供了更多的前体，β-胡萝卜素羟化酶、六氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶均被上调，从而使得细胞内虾青素积累增加。
从雨生红球藻中提取虾青素的生产大约在20世纪90年代后期开始大规模工业化。雨生红球藻作为一类单细胞光合生物，野生型细胞内虾青素的含量可高达细胞干重的4%，且具有光能利用率高、生长速度快的特点，已被我国认定为安全生产菌株。但是，雨生红球藻的工业化中需要利用光反应器以保证其光合作用，使得其生产成本大幅增加。因此开发新资源、新技术以降低生产成本成为当下的重点研究方向。
2.5 海洋真核微生物合成虾青素
破囊壶属是一类类似于微藻但缺乏叶绿体而不进行光合作用的真核微生物，细胞内可以积累大量对人体有利的活性物质，如：油脂、色素、角鲨烯等。此外，破囊壶菌（Thraustochytrium）、裂殖壶菌（Schizochytrium）、Aurantiochytrium中也可以积累β-胡萝卜素、虾青素等类胡萝卜素。研究发现，Thraustochytrium、Schizochytrium、Aurantiochytrium在不同碳源的条件下代谢产物存在一定差异。目前相关代谢研究尚在进行中（表3）。破囊壶菌以甘油作为碳源发酵的过程中，甘油主要通过增强糖酵解活性和产生NADPH来促进破囊壶菌中次级代谢产物的生物合成。利用酿酒副产物及废糖浆做Thraustochytriidae sp.、Aurantiochytrium sp.碳源，在成功提升虾青素产量的同时降低生产成本，为实现破囊壶菌内虾青素生物合成商业化进一步提升可能性。
表 3 合成虾青素的海洋真核微生物Table 3. Marine eukaryotic microorganisms for the synthesis of astaxanthin菌株 虾青素含量 实验策略 发酵条件 参考文献 S. limacinum B4D1 总虾青素产量107.74 µg/g
反式虾青素和顺式虾青素丁醇诱导 10 mL（v/v）接种量50 mL发酵培养基在250 mL烧瓶中于25 ℃分批培养，180 r/min孵育；24 h；添加各种浓度的丁醇（0~8 g/L）葡萄糖耗尽停止发酵 [47] S. limacinum B4D1 3S-3’S虾青素占总虾青素的90%以上总虾青素含量约3300 µg/g 甲醇诱导 10%（体积/体积）接种量；（50 mL于250 mL的烧瓶）；添加六种不同浓度的甲醇（0%、1.6%、3.2%、4.8%、5.6%和6.4%）；葡萄糖被完全消耗时终止发酵 [48] Thraustochytrium ATCC 20888S31 29.7 µg/g 甘油做碳源 5% v/v接种量95 mL生产培养基，摇瓶25 ℃、150 r/min培养7 d；不同浓度的甘油和葡萄糖0.5%、1%、2%、4%、6%、8%及10% [49] S. limacinum BR2.1.2 积累量8.9 µg/mL
总色素含量13.1 µg/mLNTG诱导20 min 180 r/min，25 ℃发酵6 d；GYP：3% 葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，50%天然海水 [50] Schizochytrium sp. SHG104 3.685 mg/L γ射线诱导野生型Schizochytrium sp.SH104 50 g/L葡萄糖，10 g/L酵母提取物，5 g/L人工海水，9 g/L KH2PO4；4 d 165 r/min，LED光照（420~680 nm） [51] Schizochytrium sp. KH105 6.1 mg/L（占总类胡萝卜素的28%） 优化碳源、氮源浓度 0.5%酵母提取物，1.5%聚蛋白胨，10%葡萄糖，人工海水（1/2 ASW），28 °C，4 d [9] Thraustochytriidae sp. AS4-A1 （230±15）mg/L 酿酒副产品（RB）培养基； 酿酒副产品做25 ℃；摇瓶；7 d [52] Aurantiochytrium sp. KH105 3.5 mg/L 响应面优化培养基；活性炭处理废糖浆 50 mL含有3%~50% 废糖浆培养基于挡板烧瓶（200 mL）中接种1 mL预培养物，废糖浆经过木炭处理28 ℃，300 r/min下培养96 h [53] Aurantiochytrium sp. SK4 游离态 131.09 μg/g 表达透明颤菌（V. stercoraria）的血红蛋白基因（vhb） 30 g/L葡萄糖，1 g/L酵母提取物，1 g/L蛋白胨，15‰人工海水（v/v）pH5.5；摇瓶，25 ℃，转速200 r/min，培养9 d [54] Aurantiochytrium sp. RH-7 9.48 mg/L/d NTG诱变诱变株：Aurantiochytrium sp. RH-7A-7 GPY培养基（3%的葡萄糖，0.6%的高聚蛋白胨，0.2%的酵母提取物，2%的海盐）或FPY培养基（3%的果糖，0.6%的高聚蛋白胨，0.2%的酵母提取物，2%的海盐）在28 ℃下，摇瓶，转速为160 r/min，5 d。为提高虾青素产量，添加100 μmol/L FeSO4·7H2O [55] 此外，通过环境胁迫、诱变、基因工程等手段可以进一步提升细胞中虾青素的产量。虾青素具有极强的抗氧化能力，当细胞处于胁迫环境中，细胞中类胡萝卜素代谢增强，使得虾青素产量大幅增加，从而帮助细胞抵抗不利环境。研究发现一定浓度的丁醇、甲醇对于Schizochytrium limacinum B4D1具有诱导虾青素合成的作用。在培养基中加入5.6%的甲醇时，总虾青素含量提升至约3300 μg/g，且合成的虾青素主要为3S-3’S结构[47]。随着代谢路径的明确，通过基因工程技术，在Aurantiochytrium中也获得了虾青素高产菌株。在Aurantiochytrium sp. SK4菌株中过表达透明颤菌（Vitreoscilla stercoraria）血红蛋白的（vhb）基因，虾青素产量增长9倍达到131.09 μg/g[21]。此外，通过γ射线、NTG化学试剂等方法对野生菌株进行诱变可以获得虾青素高产菌株。使用γ射线获得的高产菌株Schizochytrium SH104中虾青素的产量为原始菌株的3倍，产量达到3.689 mg/L[51]。裂殖壶菌在作为DHA生产安全菌株的基础上还具有不需光照的特点，使其成为虾青素生产工业化的潜在菌株。
2.6 植物合成虾青素
少数金盏花物种是唯一能产生虾青素的陆地植物[56]，金盏花（Adonis）属中的Adonis aestivalis和Adonis annua的花瓣中由于虾青素的积累呈现明亮的血红色。然而，由于金盏花花朵较小，使得其在虾青素的工业化生产中受到限制，但它却是高级植物中虾青素合成途径的良好载体，为开发虾青素生物反应器提供了参考。虾青素是类胡萝卜素代谢的最终产物，虽然许多植物中不具有积累虾青素的能力，但却含有较高含量的类胡萝卜素。这些植物细胞中缺少从β-胡萝卜素到虾青素代谢路径的相关基因，使得代谢中断在β-胡萝卜素合成阶段。研究人员通过基因工程获得高产虾青素的工程植物菌株。在番茄中共表达莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的β-胡萝卜素酮醇酶和雨生红球藻的β-胡萝卜素羟化酶，使得番茄中大多数原有的类胡萝卜素基因上调，有效地将碳通量引导到类胡萝卜素中，大量游离虾青素在叶片中大量积累。在烟草中表达Brevundimonas sp. SD212的编码crtW和crtZ的基因，在烟叶中产生了0.5% DCW的虾青素（占总胡萝卜素的70%以上）[57]。
3. 结语与展望
虾青素具有极强的抗氧化性能，随着市场对虾青素关注与需求的提升，虾青素在食品营养强化剂、医疗保健、饲料等方面具有很大的应用价值和发展空间。化学合成、生物合成的虾青素在不同领域具有不同的应用空间。化学合成虾青素成本低、价格便宜，已经实现了工业化生产，是市场上虾青素供应的最主要的工业化来源。随着生物合成虾青素的兴起，各国对化学合成的虾青素管理愈来愈严格，美国食品与药物管理局（FDA）禁止化学合成的虾青素进入食品、保健品等市场。生物合成的天然虾青素具有更高的生物活性，且来源更安全，满足市场需要，尤其是供人类消费的天然色素，成为研究热点。这一市场需求也使得生物合成虾青素的关注度日益增加。但是当前的天然虾青素的产量低导致价格高，不能满足普遍的市场需求。针对市场对虾青素需求的日益增长的问题，通过合成生物学、代谢工程、发酵工程等手段精确调控植物或微生物虾青素的生物合成，是来实现天然虾青素的大规模工业生产的有效途径。已知的具有从头合成虾青素能力的生物仅限于几类细菌、酵母、微藻和植物[19]，因此获得虾青素高产微生物菌株是虾青素规模化生产的重要研究方向。
此外，生物合成的下游加工也存在巨大挑战，尤其是虾青素的高效提取和纯化等技术。生物合成虾青素的生产潜力巨大，有待克服的主要挑战仍然需要更好的工程设计和创新，以使过程更具成本竞争力。总之，生物合成虾青素是一个有吸引力的领域，并且可能会迅速发展。期待借助生物技术手段为生物源虾青素的工业化生产打开新的格局。
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图 2 霍夫曼罗氏公司虾青素合成路线（a）和巴斯夫公司虾青素合成路线（b）
Figure 2. Routes for chemical synthesis of astaxanthin by F. Hoffmann-La Rocha（a）and BASF（b）
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图 4 虾青素生物合成代谢路径图
注：a：MVA途径，多存在于真核生物及古生菌。b：MVA途径，在植物中发现。c：MEP途径常存在于植物及大多数细菌中。d：为人工途径，利用异戊烯醇合成IPP。e：类胡萝卜素合成路径。f：为虾青素合成路径。Dxs，1-脱氧-d -木糖5-磷酸合成酶；Dxr，1-脱氧-d -木糖5-磷酸还原异构酶；IspD，2- c -甲基- d -赤藓糖醇4-磷酸胞苷转移酶；IspE，4-二磷脂酰-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶；IspF，4-二磷脂酰-2-C甲基-D-赤藓糖醇激酶；IspG，4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶；IspH，4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶；CK，胆碱激酶。
Figure 4. Biosynthetic pathway of astaxanthin
表 1 合成虾青素的细菌
Table 1 Bacteria for the synthesis of astaxanthin
类型 菌株 虾青素含量 实验策略 发酵条件 参考文献 天然菌株 海云杉副球菌
Paracoccus sp. N-81106480 mg/L 随机诱变，虾青素合成基因过表达 25 ℃，OEG培养基，分批发酵 [28] 天然菌株 鞘氨醇单胞菌
S. astaxanthinifaciens sp. CC-AMO-30BT40 mg/g（DCW） — 使用MA或海洋肉汤在30 ℃下培养菌株48 h [29] 天然菌株 石垣曲霉
A. ishigakiensis sp. JPCCMB0017T定性检测 — 肉汤培养基 [30] 天然菌株 短波单胞菌.N-5
Brevundimonas sp.strain N-54.6 μg/g虾青素（3S-3'S）异构体
约占总类胡萝卜素的60.6%— 中等通气的NB肉汤培养基 [31] 工程菌株 谷氨酸棒杆菌MB001
C. glutamicum MB001摇瓶0.4 mg/L/h 干重100 g/L 表达（F. pelagi）的番茄红素环化酶基因crtY，β-胡萝卜素酮醇酶基因crtW，和羟化酶基因crtZ 30 ℃，在500 mL烧瓶中以50 mL的体积进行的，两个挡板以120 r/min摇动。 [32] 工程菌株 大肠杆菌BW-ASTA
E. coli BW-ASTA48 h虾青素作为唯一类胡萝卜素（>95%），浓度为（1.41±0.1）mg/g DCW） 利用λ-Red重组技术重组crtW和crtZ，基因分别来自N. punctiforme和P. ananatis 含葡萄糖和IPTG的培养基 [33] 工程菌株 甲基单胞菌16a
Methylomonas sp. strain 16a占总类胡萝卜素的90% β-类胡萝卜素酮醇酶基因crtW（Paracoccus sp.）和crtE idi crtYIB的基因的不同组合 分批发酵，875 mL/min的输送（26.3%的甲烷，53.1%的氮气和20.6%的氧气）压力为0.25 Psi，297~648 r/min，30 ℃ [34] 工程菌株 甲基单胞菌 16a
Methylomonas sp. strain 16a虾青素占总类胡萝卜素的90% 血红蛋白基因（Methylomonas sp.16a）与crtW，crtZ（S. astaxanthinifaciens sp.）在Methylomonas sp.中的共表达 550 mL装有甲烷（25%在空气中）作为唯一碳和能源的瓶子中的10 mL培养基中在30 ℃、250 r/min的速度振荡2~3 d。 [35] 
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表 2 合成虾青素的酵母
Table 2 Yeast for the synthesis of astaxanthin
类型 突变菌株 虾青素含量 实验策略 发酵条件 参考文献 野生菌株 P. rhodozyma Y1654 7 7 µg/g 利用不同碳源发酵 20 °C，180 r/min，7 d [38] 诱变菌株 P. rhodozyma E5042 2512 µg/g 低能离子束注入 [37] 诱变菌株 P. rhodozyma YZUXHONG686 2.24 mg/g NTG&UV [39] 工程菌株 Y. lipolytica ST7403 3.5 mg/g 引入基因crtZ（P. ananatis）和crtW（Paracoccus sp. N81106）的多个整合 （YP+8%葡萄糖）的酵母提取蛋白培养基；30 ℃ [40] 工程菌株 Y. lipolytica ST7976 6 mg/g（DCW）
占总类胡萝卜素的47%bkt和crtZ/crtZ基因组合转化；
基因来自H. pluvialis20 g/L酵母提取物，40 g/L蛋白胨，低流速低加葡萄糖保持浓度低于5 g/L（1L反应器）30 ℃，7 d [41] 工程菌株 S. cerevisiae YastD-03 8.10 mg/g（DCW）3S-3'S crtE、crtI、crtYB（P. rhodozyma）; trHMG1、bkt和 crtZ（H. pluvialis） 50 mL的YPD 培养基中加入 0.52 mmol/L Fe2+；20 g/L D-半乳糖，20 g/L 蛋白胨，10 g/L酵母提取物；30 ℃，220 r/min，摇瓶 [42] 工程菌株 S. cerevisiae YPP9 4.7 mg/g（DCW） 引入bkt和crtZ 基因（H. pluvialis） 50 mL的YPD 培养基中加入 0.52 mmol/L of Fe2+；20 g/L D-半乳糖，20 g/L 蛋白胨，
10 g/L 酵母提取物；30 ℃，220 r/min，摇瓶[43]
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表 3 合成虾青素的海洋真核微生物
Table 3 Marine eukaryotic microorganisms for the synthesis of astaxanthin
菌株 虾青素含量 实验策略 发酵条件 参考文献 S. limacinum B4D1 总虾青素产量107.74 µg/g
反式虾青素和顺式虾青素丁醇诱导 10 mL（v/v）接种量50 mL发酵培养基在250 mL烧瓶中于25 ℃分批培养，180 r/min孵育；24 h；添加各种浓度的丁醇（0~8 g/L）葡萄糖耗尽停止发酵 [47] S. limacinum B4D1 3S-3’S虾青素占总虾青素的90%以上总虾青素含量约3300 µg/g 甲醇诱导 10%（体积/体积）接种量；（50 mL于250 mL的烧瓶）；添加六种不同浓度的甲醇（0%、1.6%、3.2%、4.8%、5.6%和6.4%）；葡萄糖被完全消耗时终止发酵 [48] Thraustochytrium ATCC 20888S31 29.7 µg/g 甘油做碳源 5% v/v接种量95 mL生产培养基，摇瓶25 ℃、150 r/min培养7 d；不同浓度的甘油和葡萄糖0.5%、1%、2%、4%、6%、8%及10% [49] S. limacinum BR2.1.2 积累量8.9 µg/mL
总色素含量13.1 µg/mLNTG诱导20 min 180 r/min，25 ℃发酵6 d；GYP：3% 葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，50%天然海水 [50] Schizochytrium sp. SHG104 3.685 mg/L γ射线诱导野生型Schizochytrium sp.SH104 50 g/L葡萄糖，10 g/L酵母提取物，5 g/L人工海水，9 g/L KH2PO4；4 d 165 r/min，LED光照（420~680 nm） [51] Schizochytrium sp. KH105 6.1 mg/L（占总类胡萝卜素的28%） 优化碳源、氮源浓度 0.5%酵母提取物，1.5%聚蛋白胨，10%葡萄糖，人工海水（1/2 ASW），28 °C，4 d [9] Thraustochytriidae sp. AS4-A1 （230±15）mg/L 酿酒副产品（RB）培养基； 酿酒副产品做25 ℃；摇瓶；7 d [52] Aurantiochytrium sp. KH105 3.5 mg/L 响应面优化培养基；活性炭处理废糖浆 50 mL含有3%~50% 废糖浆培养基于挡板烧瓶（200 mL）中接种1 mL预培养物，废糖浆经过木炭处理28 ℃，300 r/min下培养96 h [53] Aurantiochytrium sp. SK4 游离态 131.09 μg/g 表达透明颤菌（V. stercoraria）的血红蛋白基因（vhb） 30 g/L葡萄糖，1 g/L酵母提取物，1 g/L蛋白胨，15‰人工海水（v/v）pH5.5；摇瓶，25 ℃，转速200 r/min，培养9 d [54] Aurantiochytrium sp. RH-7 9.48 mg/L/d NTG诱变诱变株：Aurantiochytrium sp. RH-7A-7 GPY培养基（3%的葡萄糖，0.6%的高聚蛋白胨，0.2%的酵母提取物，2%的海盐）或FPY培养基（3%的果糖，0.6%的高聚蛋白胨，0.2%的酵母提取物，2%的海盐）在28 ℃下，摇瓶，转速为160 r/min，5 d。为提高虾青素产量，添加100 μmol/L FeSO4·7H2O [55]
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