Fermentation Technology Optimization of Rose Flower Enzyme Using Box-Behnken Design and Its Antioxidant Activity Determination
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摘要: 本研究以玫瑰干花瓣为主要原料，采用复合乳酸菌发酵，优化玫瑰花酵素发酵工艺技术。以发酵时间、初始pH、接种量、发酵温度为考察因素，以SOD（超氧化歧化酶）酶活力及总酚含量作为评价指标，采用响应面优化结合Box-Behnken设计试验获得最佳发酵工艺条件。此外，研究还利用DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2, 2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）和FRAP（铁离子还原法）法检测玫瑰花酵素液发酵前后的体外抗氧化活性，并测定了玫瑰花酵素液发酵前后的SOD酶活力、总酚含量、黄酮含量、花色苷含量、pH和可滴定酸等指标。结果表明，玫瑰花酵素液发酵最佳工艺条件为：发酵时间68 h，初始 pH 5.4，接种量1 g，发酵温度32 ℃。该条件下测得玫瑰花酵素液SOD酶活力为132.07 U/mL，总酚含量为6.28 mg/mL，总黄酮含量为3.48 mg/mL，花色苷含量为5.64 mg/100 mL，可滴定酸为2.82 g/100 g，较发酵之前均有较大的提高。当发酵前后玫瑰酵素液、8 mg/mL Vc体积分数为0.45%时，DPPH自由基清除率分别为73.32%、83.70%、35.05%，ABTS自由基清除率分别为82.18%、92.74%、52.82%，FRAP值分别为0.25、0.28、0.115。DPPH、ABTS、FRAP三种不同的抗氧化方法结果均表明玫瑰酵素液发酵后的抗氧化能力最强。Abstract: In this study, dried rose petals were used as the main raw material, and compound lactic acid bacteria were used for fermentation to optimize the fermentation technology of rose flower enzymes. Taking fermentation time, initial pH, inoculum amount, and fermentation temperature as investigation factors, SOD (superoxide dismutase) enzyme activity and total phenol content as evaluation indicators, response surface optimization combined with Box-Behnken design experiment to obtain the best fermentation process conditions. In addition, the research also used DPPH (1, 1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine), ABTS (2, 2'-diazo-bis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) and FRAP (ferric ion reduction method) method to detect the in vitro antioxidant activity of rose flower enzymes before and after fermentation, and to determine the SOD enzyme activity, total phenol content, flavonoids content, anthocyanin content, pH and titratable acid. The results showed that the optimal process conditions for the fermentation of rose flower enzyme liquid were: Fermentation time 68 h, initial pH5.4, inoculation amount 1 g, and fermentation temperature 32 ℃. Under these conditions, the SOD enzyme activity of the rose flower enzyme solution was 132.07 U/mL, the total phenol content was 6.28 mg/mL, the total flavonoid content was 3.48 mg/mL, the anthocyanin content was 5.64 mg/100 mL, and the titratable acid was 2.82 g/100 g, which was a greater improvement than before fermentation. When the rose enzyme liquid before and after fermentation and 8 mg/mL Vc volume fraction were 0.45%, the DPPH free radical scavenging rates were 73.32%, 83.70%, 35.05%, and the ABTS free radical scavenging rates were 82.18%, 92.74%, 52.82%, respectively. The FRAP values were 0.25, 0.28, and 0.115, respectively. The results of three different antioxidant methods, DPPH, ABTS, and FRAP, all showedthat rose enzyme liquid hadthe strongest antioxidant capacity after fermentation.
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Keywords:
- fermented rose /
- fermentation /
- SOD enzyme activity /
- total phenols /
- total flavonoids /
- anthocyanin /
- antioxidant activity
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酵素是以动植物、菌类等为原料，利用现代发酵技术发酵得到的含有特定生物活性成分的产品，其主要成分为酶、菌催化类以及抗氧化活性物质。其具有抗氧化[1]、促进新陈代谢、解酒护肝、预防心血管疾病[2]、抗糖尿[3]、预防衰老以及神经退行疾病[4]等功能。酵素是一种很特殊的复杂性蛋白质，在人体内担任新陈代谢各种化学变化最重要的媒介体[5]。酵素存在于所有活细胞中，它启动了细胞的活力，使细胞展现出种种生命现象。但人体自身只能制造补充部分酵素，其余大部分需要依靠食物不断补充，近些年来，随着食用酵素产品被越来越多的被人们认知，各种食用酵素产品层出不穷。但目前关于酵素的研究以及在市场上出现的酵素产品，以果蔬为原料制作的为主，很少有关于花卉酵素的研究。
玫瑰，又被称为刺玫花、穿心玫瑰、徘徊花、赤蔷薇等，是世界名花之一，属蔷薇科植物[6]。我国是玫瑰花的故乡，玫瑰花在我国的发展历史悠久，广泛分布于北京、山东、甘肃、云南、四川等地，是我国重要特产经济植物[7-8]。玫瑰花中含有丰富的花色苷、黄酮、多酚、多糖等活性物质，具有排毒养颜、行气活血、抗氧化、抗菌、抗病毒、利胆解毒之功效[9]。目前，我国的玫瑰花主要应用于精油的提取[10-12]、玫瑰花酱的制作、玫瑰花饼干的制作、玫瑰花茶的制作等。在目前已有玫瑰花酵素的工艺研究中，大多以酵母菌复合其他菌种为发酵菌种，多以SOD酶活力为单一指标进行优化，且多以专利形式出现[13-14]。针对玫瑰花酵素科学性、系统性的研究以论文形式的鲜有报道。
本试验以玫瑰花为原材料，应用现代微生物发酵技术，选用乳酸菌对玫瑰花进行发酵，研制出玫瑰花酵素，促进玫瑰花深加工产品发展，丰富我国酵素的市场，为工业化生产提供一些数据支持和理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
玫瑰花（法国墨红） 云南丽江程玫生物技术有限公司；安琪牌果蔬酵素发酵剂（麦芽糊精、植物乳杆菌N13、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus）、肠膜明串珠菌膜亚种（L. mesenteroidessub sp.mesenteroides）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）） 湖北安琪酵母股份有限公司；白糖、乳糖 食品级市售；没食子酸标准品、抗坏血酸、2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ2,4,6-tris （2-pyridyl）-s-triazine）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical）、芦丁标准品 均为色谱纯，上海源叶生物科技有限公司；2, 2-联氮基-双- （3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二氨盐 （ABTS，2, 2’-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） 、福林酚、碳酸钠、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、邻苯三酚、盐酸、乙二胺四乙酸二钠、过硫酸钾 均为分析纯，购于阿拉丁。
HH-8型数显恒温水浴锅 常州市金坛华特实验仪器有限公司；UV 5800PC型紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；PH-030型干燥/培二用箱 上海齐欣科学仪器有限公司；THZ-82A型数显气浴恒温振荡器 常州普天仪器制造有限公司；UV1901型紫外可见分光光度计 四川亿科实验设备有限公司；台式离心机 上海安亭科学仪器厂；PHS-25型pH计 上海越平科学仪器制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 工艺流程
1.2.2 操作要点
1.2.2.1 玫瑰花预处理
将玫瑰花用无菌水冲洗干净后，晾干水分，用沸水烫漂2 min后，取出晾干水分。
1.2.2.2 玫瑰花发酵基质制备及发酵
分别称取预处理过的玫瑰花14 g、白糖17.8 g、乳糖4 g、量取无菌水150 mL到灭菌发酵罐，采用食品级碳酸钙调整发酵基质pH 5.4，密封。发酵基质放入80 ℃水浴锅中，密封后巴氏杀菌30 min。在发酵基质温度降到33 ℃条件下接种1 g发酵剂到玫瑰花发酵基质中发酵72 h。待发酵结束后滤除玫瑰花花瓣，即得玫瑰花酵素液。
1.2.3 单因素实验
主要选择发酵温度、发酵时间、接种量、初始pH四个工艺参数进行单因素实验，具体方法如下：
1.2.3.1 发酵温度的确定
玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.80 g，无菌水150 mL，接种量为1 g，初始pH 4.4，分别在27、30、33、36、39 ℃条件下发酵72 h。研究其对玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影响。
1.2.3.2 发酵时间的确定
玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.80 g，无菌水150 mL，接种量为1 g，初始pH 4.4，发酵温度33 ℃，分别发酵24、48、72、96、120 h。研究其对玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影响。
1.2.3.3 接种量的确定
玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.8 g，无菌水150 mL，初始pH 4.4，发酵温度33 ℃，接种量分别为0.4、0.7、1、1.3、1.6 g发酵72 h。研究其对玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影响。
1.2.3.4 初始pH的确定
玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.80 g，无菌水150 mL，接种量为1 g，发酵温度33 ℃，分别在初始pH为2.4、3.4、4.4、5.4、6.4条件下发酵72 h。研究其对玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影响。
1.2.4 响应面优化
根据单因素实验结果，对玫瑰花酵素发酵时间、发酵温度、接种量、初始pH这4个因素进行四因素三水平Box-Benhnken Design试验，以玫瑰花酵素SOD酶活力以及多酚含量的综合评分（综合评分=（SOD酶活力+总酚含量分值）／2，其中SOD酶活力最大为100分，按线性分配相应分值；多酚含量最大值为100分，按线性分配相应分值）为响应值，以得到玫瑰花酵素的最佳发酵工艺，响应面试验各因素水平如表1所示。
表 1 Box-Behnken实验因素和水平设计Table 1. Factors and level of Box-Behnken experiment design水平 因素 A发酵温度/℃ B发酵时间/h C接种量/g D初始pH 1 30 24 0.4 3.4 2 33 48 0.7 4.4 3 36 72 1.0 5.4 1.2.5 指标测定
1.2.5.1 SOD酶活力的测定
参考国家标准GB/T 5009.171-2003。
1.2.5.2 总酚含量的测定
参照文献[15]的方法略作改动，测定总酚含量。准确移取25 μL样品于50 mL比色管中，加入25 mL蒸馏水和2.5 mL福林酚，摇匀静置3 min后加入饱和碳酸钠溶液10 mL，用蒸馏水定容，静置30 min。于765 nm波长处测定吸光度，以没食子酸质量浓度对吸光度作标准曲线。得到回归方程：Y=68.714X+0.011（X为没食子酸标准品浓度，单位为mg/mL；Y为吸光度，R2=0.9991）总酚含量以每毫升样品中总酚类化合物相当于没食子酸的质量表示 （mg/mL） 。
1.2.5.3 黄酮测定
采用亚硝酸钠法测定黄酮含量[16]。取样品50 μL于25 mL比色管中，加入1 mL 5% NaNO2溶液，混匀，在室温下静置6 min，加入1 mL 10%AlNO3溶液，摇匀静置6 min后加入8 mL 4%NaOH溶液，用60% 乙醇定容至刻度线，混匀，室温下反应15 min，在510 nm处测得吸光度值。根据芦丁浓度和吸光度值绘制标准曲线。标准曲线方程：y=11.012x−0.0021，（式中y为吸光度的大小，x为标准品芦丁溶液的浓度，单位为mg/mL，R2=0.999）总黄酮含量以每毫升样品中黄酮类化合物相当于芦丁的质量表示 （mg/mL） 。
1.2.5.4 花色苷含量测定
采用消光系数法[17]对玫瑰花酵素中花色苷进行测定。将发酵得到的玫瑰花酵素用紫外分光光度计在400~800 nm波长范围内扫描，以蒸馏水为参比，确定玫瑰花酵素花色苷的最大吸收波长。根据式（1）计算玫瑰花酵素中花色苷含量：
(1) 式中：C（mg/100 mL）：玫瑰花酵素花色苷含量；A:最大吸收波长处的吸光度值；V1：定容体积（mL）×稀释倍数；V2：样品体积（mL）；98.2：花色苷平均消光系数。
1.2.5.5 可滴定酸测定（以乳酸计）
参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》。
1.2.5.6 pH测定
采用pH计测定。
1.2.6 抗氧化活性测定
1.2.6.1 对DPPH自由基清除作用的测定
参照文献[18-19]方法略作改动。加入3.2 mL 0.10 mmol·L−1的DPPH工作液于试管中，加入蒸馏水稀释的玫瑰花酵素溶液0.8 mL，玫瑰花酵素体积分数分别为：0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%，混匀后，于25 ℃避光反应30 min，在517 nm波长下测定其吸光度。按式（2）计算DPPH自由基清除率（%）。
(2) 式中：A0：DPPH溶液的吸光度；A1：玫瑰花酵素+DPPH溶液的吸光度。
1.2.6.2 对ABTS自由基清除作用的测定
参照文献[20-21]方法略作改动。取3 mL ABTS+·工作液于试管中，加入蒸馏水稀释的玫瑰花酵素溶液0.3 mL，玫瑰花酵素体积分数分别为：0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%，将其充分混匀后，在25 ℃下避光反应10 min，在732 nm波长处测定样品的吸光度。按式（3）计算ABTS自由基清除率（%）。
(3) 式中：A2：空白（蒸馏水）+ABTS溶液的吸光度；A3：玫瑰花酵素+ABTS溶液的吸光度。
1.2.6.3 总抗氧化的测定
参照方敏[22]李加兴[23]等的方法略作改动。取蒸馏水稀释的玫瑰花酵素溶液0.1 mL于25 mL比色管中，玫瑰花酵素体积分数分别为：0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%，与6 mL FRAP 溶液混合，在37 ℃水浴30 min，然后在593 nm处测定吸光度值。
1.3 数据处理
每次试验均进行3次重复操作，试验数据处理、统计分析和图标绘制采用Excel、Design-Expert 8.06、SPSS 20和Origin软件。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 发酵温度对SOD酶活力及总酚含量的影响
如图1所示，随着发酵温度的不断上升，SOD酶活力以及总酚含量呈先上升后下降的趋势，在33 ℃均达到最高，SOD酶活力为90.87 U/mL，总酚含量为5.97 mg/mL。当温度>33 ℃时，SOD酶活力与总酚含量均呈现大幅下降趋势。这可能是由于发酵温度较低时，代谢物SOD酶及总酚含量较低，发酵速度慢；随着发酵温度继续增加，乳酸菌内酶的活性受到高温的抑制，因此减缓其新陈代谢[24]，使SOD酶活力及总酚合成率下降。发酵温度对玫瑰花酵素SOD酶活力以及总酚含量的影响具有显著性（P<0.05）。因此，选择33 ℃为最佳的发酵温度。
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2.1.2 发酵时间对SOD酶活力和总酚含量的影响
如图2所示，在一定时间范围内随着发酵时间的增加，SOD酶活力与总酚含量增加，在48 h时SOD酶活力最高，且总酚含量最大。之后再延长时间，SOD酶活力与总酚含量均呈下降趋势。SOD酶活力下降的原因可能是在48 h内乳酸菌处于生长代谢旺盛期，48 h后随着乳酸菌的密度增高和衰老转而消耗营养产物，使得次级代谢产物减少，SOD酶活力降低[25]。延长发酵时间可能加速了总酚的氧化分解，导致48 h后总酚含量的下降。发酵时间对玫瑰花酵素SOD酶活力以及总酚含量的影响是显著的（P<0.05）。因此，选择48 h为最佳发酵时间。
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图 2 发酵时间对玫瑰花酵素SOD酶活力以及总酚含量的影响Figure 2. Effect of fermentation time on the activity of fermented rose SOD and total phenol content2.1.3 接种量对SOD酶活力与总酚含量的影响
如图3所示，随着接种量的增加，SOD酶活力先增加后减少，总酚含量呈逐渐减少的趋势。当接种量为0.7 g时，SOD酶活力达到最大值，为93.91 U/mL，总酚含量为5.31 mg/mL。当接种量>0.7 g时，SOD酶活力逐渐降低。这可能是由于接种量过大，菌体正常代谢消耗的营养物质过多，导致发酵产物减少[26]。接种量对玫瑰花酵素SOD酶活力与总酚含量的影响具有显著性（P<0.05）。综合考虑，选择接种量0.4~1 g进行下一步试验。
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图 3 接种量对玫瑰花酵素SOD酶活力与总酚含量的影响Figure 3. Effect of inoculum on the activity of fermented rose SOD and total phenol content2.1.4 初始pH对SOD酶活力以及总酚含量的影响
如图4所示，随着初始pH的增加，SOD酶活力与总酚含量呈先上升后下降的趋势，当初始pH为4.4时，SOD酶活力与总酚含量均达到最大值，此时总酚含量为5.97 mg/mL，SOD酶活力为90.87 U/mL。当初始pH大于4.4时，随着pH的增加，总酚含量和SOD酶活力都呈现出逐渐下降的趋势。这可能是由于初始pH逐渐增加，抑制乳酸菌的生长代谢，活菌数逐渐减少，导致产酶能力降低[27]。初始pH对玫瑰花酵素SOD酶活力以及总酚含量的影响是显著的（P<0.05）。因此，选择pH4.4为最佳发酵初始pH进行后续试验。
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图 4 初始pH对酵素SOD酶活力及总酚含量的影响Figure 4. The effect of initial pH on enzyme SOD activity and total phenol content2.2 响应面试验结果
2.2.1 响应面试验设计与结果
根据单因素结果，进行响应面设计，试验设计与结果如表2。
表 2 响应面试验设计与结果Table 2. Box-Behnken design and results序号 A：发酵
温度(℃)B：发酵
时间(h)C：接种量
(g)D：初始pH Y：综合
评分1 36 48 0.4 4.4 63.02 2 33 48 0.7 4.4 74.92 3 33 48 0.7 4.4 67.05 4 36 48 0.7 5.4 80.07 5 33 48 1 5.4 93.52 6 33 72 0.7 3.4 62.57 7 30 48 0.4 4.4 66.92 8 33 24 0.7 3.4 52.92 9 36 48 0.7 3.4 58.29 10 36 48 1 4.4 66.74 11 30 48 1 4.4 84.50 12 33 24 0.4 4.4 55.15 13 30 72 0.7 4.4 62.93 14 33 48 0.4 3.4 74.92 15 36 24 0.7 4.4 50.95 16 33 48 0.7 4.4 74.20 17 33 72 0.4 4.4 54.11 18 30 48 0.7 5.4 70.30 19 33 72 1 4.4 79.98 20 33 48 0.7 4.4 74.20 21 33 24 0.7 5.4 51.62 22 33 48 1 3.4 70.62 23 36 72 0.7 4.4 58.91 24 33 72 0.7 5.4 69.20 25 33 48 0.7 4.4 74.20 26 30 48 0.7 3.4 69.57 27 33 24 1 4.4 50.18 28 33 48 0.4 5.4 68.46 29 30 24 0.7 4.4 40.33 注：Y（综合得分）=（SOD酶活力+总酚酚含量分值）／2，其中SOD酶活力最大为100分，按线性分配相应分值；多酚含量最大值为100分，按线性分配相应分值。 利用Design expert软件对试验数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型方程:
Y=+72.91−1.38A+7.21B+5.25C+3.69D−3.66AB−3.47AC+5.26AD+7.71BC+1.98BD+7.34CD−4.71A2−15.17B2+2.23 C2+1.48 D2
响应面二次多项回归方程的方差分析结果如表3所示，该模型的F=19.25，P<0.0001，表明该模型极显著；回归系数R2=0.9506，表明建立的该模型可以较好地拟合试验的真实情况，自变量与响应值之间关系显著，该二次方程模型可以用来分析和预测玫瑰花酵素的最佳发酵工艺。由ABCD的F值可知，各因素对玫瑰花酵素综合品质影响的程度为：B>C>D>A，即发酵时间>接种量>初始pH>发酵温度。
表 3 回归模型方差分析Table 3. Analysis of variance of regression model方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 Model 3646.9 14 260.49 19.25 < 0.0001 ** A-发酵温度 22.88 1 22.88 1.69 0.2144 B-发酵时间 624.24 1 624.24 46.14 < 0.0001 ** C-接种量 330.33 1 330.33 24.42 0.0002 ** D-初始pH 163.39 1 163.39 12.08 0.0037 ** AB 53.58 1 53.58 3.96 0.0665 AC 48.02 1 48.02 3.55 0.0805 AD 110.78 1 110.78 8.19 0.0126 * BC 237.78 1 237.78 17.58 0.0009 ** BD 15.72 1 15.72 1.16 0.2993 CD 215.5 1 215.5 15.93 0.0013 ** A2 144.2 1 144.2 10.66 0.0056 ** B2 1493.7 1 1493.7 110.41 < 0.0001 ** C2 32.37 1 32.37 2.39 0.1442 D2 14.14 1 14.14 1.04 0.324 残差 189.41 14 13.53 失拟项 146.04 10 14.6 1.35 0.4156 纯误差 43.37 4 10.84 总离差 3836.31 28 R2=0.9506 RAdj2=0.9013 注：**为差异极显著（P<0.01 ）；*为差异显著（P<0.05） 2.2.2 响应面交互分析
为直观反映各因素及其交互作用对SOD酶活力和总酚含量综合评分的影响结果，对回归方程绘制三维响应面图及其等高线，见图5。
由图5可知，发酵温度与初始pH,发酵时间和接种量，接种量和初始pH之间的交互作用对响应值的影响显著或极显著，其他因素两两交互作用对响应值的影响不显著。由图5a可知，等高线接近圆形，因此确定发酵时间和发酵温度交互作用不显著。由图5b可知，随着发酵温度的增加，综合评分逐渐增加。当发酵温度超过33 ℃时，综合评分开始下降。但随着发酵温度和接种量的改变，综合评分的波动相对较为平稳，由此可知，发酵温度与接种量之间的交互作用不显著。由图5c可知，3D图像呈是向上凸曲面。初始pH一定时，随着发酵温度的升高，综合评分呈先上升后下降的趋势；发酵温度一定时，随着初始pH的增加，综合评分先增加，且增大趋势越来越不明显，而后减小，从等高线疏密度可知，发酵温度对综合评分的影响大于初始pH对综合评分的影响。两者之间交互作用显著。由图5d可知，发酵时间和接种量之间交互作用显著，综合评分在发酵时间32~72 h、接种量在0.4~1 g之间有最大值。由图5e可知，发酵时间和初始pH之间的交互作用不显著。由图5f可知，接种量和初始pH交互作用极显著。
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图 5 各因素交互作用对SOD酶活力和总酚含量的综合评分影响的响应面和等高线图Figure 5. Response surface and contour map of the influence of the interaction of various factors on the comprehensive score of SOD enzyme activity and total phenol content2.2.3 最佳发酵工艺条件的验证
由响应面软件优化玫瑰花酵素发酵工艺条件为：发酵时间67.81 h，初始pH 5.32，接种量1 g，发酵温度31.27 ℃，该条件下综合评分为94.88。综合考虑，调整发酵工艺参数为：发酵时间68 h，初始pH 5.4，接种量1 g，发酵温度32 ℃。采取该最佳条件进行发酵所得的酵素综合评分为93.20，即SOD酶活力为（132.07±2.31）U/mL，多酚含量为（6.28±0.29）mg/mL，与理论值无显著差异（P>0.05），表明可利用此模型对玫瑰花酵素发酵工艺条件进行响应面优化。
2.3 发酵前后理化指标对比
对SOD酶活力、总酚含量、黄酮含量的检测结果如表4所示。玫瑰花酵素发酵结束时SOD酶活力达到132.07 U/mL，比发酵前的SOD酶活力提升了4.40倍。玫瑰花中本身含有黄酮类多酚类物质，是天然的抗氧化活性物质[28]，玫瑰花中的单聚体酚类物质经益生菌的转化与利用，含量均有所提升。经过发酵，玫瑰花酵素中总酚含量达到6.28 mg/mL，与发酵之前相比，总酚含量提升了45.71%，黄酮含量提升了25.45%。且随着发酵时间的延长，微生物发酵产生乳酸、有机酸等代谢产物，使反应体系走向成熟，pH从5.40下降至4.19。
表 4 发酵前后理化指标对比Table 4. Comparison of physical and chemical indexes before and after fermentation样品 SOD酶活力/（U/mL） 总酚/（mg/mL） 黄酮/（mg/mL） 花色苷/（mg/100mL） pH 可滴定酸/（g/100g） 发酵前 30.00± 5.30 4.31± 0.00 2.59 ±0.00 2.39±0.05 5.4 1.21±0.29 发酵后 132.07±2.31 6.28±0.29 3.48±0.10 5.64±0.12 4.19 2.82±0.27 2.4 玫瑰花酵素抗氧化活性
2.4.1 DPPH自由基清除能力
DPPH法以氮为中心，是一种灵敏、快速、简便的评价物质抗氧化活性的方法[29]。由图6可知，玫瑰花酵素原液在发酵前后具有较强的DPPH自由基清除能力，且随着体积分数的增加，DPPH自由基清除率逐渐增加。在相同体积分数下，发酵后的DPPH自由基清除率>发酵前>8 mg/mLVc。这表明，通过发酵，玫瑰花酵素DPPH自由基清除能力得到显著提升。这可能是与发酵后，玫瑰花酵素总酚、黄酮等活性物质提升有关[30]。发酵前后玫瑰酵素液以及8 mg/mLVc对DPPH自由基清除的半抑制体积分数分别为0.70%、0.30%、1.50%。
2.4.2 ABTS自由基清除能力
ABTS经活性氧氧化后会生成一种稳定的蓝绿色阳离子自由基—ABTS+·，自由基产生过多或清除过慢，会对生物体产生损害，加速机体的衰老以及诱发各种疾病[31]。抗氧化物的存在会抑制ABTS+·的产生，颜色会随之变浅，在最大波长734 nm处吸光度值如果减小，表明 ABTS+·被清除。如图7所示，随着体积分数的增加，玫瑰花酵素液在发酵前后同Vc一样对ABTS+·清除率逐渐增强。且在相同体积分数下对ABTS+·的清除率表现为发酵后的玫瑰酵素液最强，其次是发酵前的玫瑰酵素液，最弱的是8 mg/mLVc。发酵前后玫瑰酵素液以及8 mg/mLVc对ABTS自由基清除的半抑制体积分数分别为0.40%、0.20%、6.80%。
2.4.3 总抗氧化能力
FRAP法即铁离子抗氧化能力法。在酸性条件下，抗氧化物还原Fe3+-TPTZ产生蓝紫色的复合物—Fe2+-TPTZ，通过测定此复合物在最大波长593 nm处的吸光度，可对抗氧化能力进行评价。吸光度越大，则表明抗氧化能力越强[32]。由图8可知，在相同体积分数下，玫瑰花酵素发酵前和发酵后的总抗氧化能力远高于8 mg/mLVc。且玫瑰花酵素液发酵后的总抗氧化能力大于发酵前的玫瑰花酵素液。
3. 结论
本文采用响应面法对玫瑰花酵素的发酵工艺进行优化，同时探究玫瑰花酵素的抗氧化活性。优化得到玫瑰花酵素的最佳发酵条件为：发酵温度32 ℃、发酵时间68 h，接种量1 g，初始pH5.4。在该条件下得到的玫瑰花酵素SOD酶活力达到132.07 U/mL，比发酵前的SOD酶活力提升了4.40倍，总酚含量达6.28 mg/mL，与发酵之前相比提升了45.71%，黄酮含量为3.48 mg/mL，提升了25.45%。此外，该酵素的ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率以及总抗氧化能力较高，且玫瑰花酵素发酵后的抗氧化能力明显优于发酵前。说明通过益生菌发酵，可以制备总酚含量与SOD酶活力较高且具有较好抗氧化活性的玫瑰花酵素产品。玫瑰花酵素的研究丰富了以果蔬为主要原料的酵素市场，为玫瑰花资源利用开辟了新途径。今后的研究中，还可以利用不同的益生菌进行发酵，深入探索玫瑰花酵素的发酵过程酶活性、抗氧化活性以及活性成分的变化，为工业化提供理论依据。
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图 2 发酵时间对玫瑰花酵素SOD酶活力以及总酚含量的影响
Figure 2. Effect of fermentation time on the activity of fermented rose SOD and total phenol content
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图 3 接种量对玫瑰花酵素SOD酶活力与总酚含量的影响
Figure 3. Effect of inoculum on the activity of fermented rose SOD and total phenol content
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图 4 初始pH对酵素SOD酶活力及总酚含量的影响
Figure 4. The effect of initial pH on enzyme SOD activity and total phenol content
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图 5 各因素交互作用对SOD酶活力和总酚含量的综合评分影响的响应面和等高线图
Figure 5. Response surface and contour map of the influence of the interaction of various factors on the comprehensive score of SOD enzyme activity and total phenol content
表 1 Box-Behnken实验因素和水平设计
Table 1 Factors and level of Box-Behnken experiment design
水平 因素 A发酵温度/℃ B发酵时间/h C接种量/g D初始pH 1 30 24 0.4 3.4 2 33 48 0.7 4.4 3 36 72 1.0 5.4 
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表 2 响应面试验设计与结果
Table 2 Box-Behnken design and results
序号 A：发酵
温度(℃)B：发酵
时间(h)C：接种量
(g)D：初始pH Y：综合
评分1 36 48 0.4 4.4 63.02 2 33 48 0.7 4.4 74.92 3 33 48 0.7 4.4 67.05 4 36 48 0.7 5.4 80.07 5 33 48 1 5.4 93.52 6 33 72 0.7 3.4 62.57 7 30 48 0.4 4.4 66.92 8 33 24 0.7 3.4 52.92 9 36 48 0.7 3.4 58.29 10 36 48 1 4.4 66.74 11 30 48 1 4.4 84.50 12 33 24 0.4 4.4 55.15 13 30 72 0.7 4.4 62.93 14 33 48 0.4 3.4 74.92 15 36 24 0.7 4.4 50.95 16 33 48 0.7 4.4 74.20 17 33 72 0.4 4.4 54.11 18 30 48 0.7 5.4 70.30 19 33 72 1 4.4 79.98 20 33 48 0.7 4.4 74.20 21 33 24 0.7 5.4 51.62 22 33 48 1 3.4 70.62 23 36 72 0.7 4.4 58.91 24 33 72 0.7 5.4 69.20 25 33 48 0.7 4.4 74.20 26 30 48 0.7 3.4 69.57 27 33 24 1 4.4 50.18 28 33 48 0.4 5.4 68.46 29 30 24 0.7 4.4 40.33 注：Y（综合得分）=（SOD酶活力+总酚酚含量分值）／2，其中SOD酶活力最大为100分，按线性分配相应分值；多酚含量最大值为100分，按线性分配相应分值。
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表 3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 Model 3646.9 14 260.49 19.25 < 0.0001 ** A-发酵温度 22.88 1 22.88 1.69 0.2144 B-发酵时间 624.24 1 624.24 46.14 < 0.0001 ** C-接种量 330.33 1 330.33 24.42 0.0002 ** D-初始pH 163.39 1 163.39 12.08 0.0037 ** AB 53.58 1 53.58 3.96 0.0665 AC 48.02 1 48.02 3.55 0.0805 AD 110.78 1 110.78 8.19 0.0126 * BC 237.78 1 237.78 17.58 0.0009 ** BD 15.72 1 15.72 1.16 0.2993 CD 215.5 1 215.5 15.93 0.0013 ** A2 144.2 1 144.2 10.66 0.0056 ** B2 1493.7 1 1493.7 110.41 < 0.0001 ** C2 32.37 1 32.37 2.39 0.1442 D2 14.14 1 14.14 1.04 0.324 残差 189.41 14 13.53 失拟项 146.04 10 14.6 1.35 0.4156 纯误差 43.37 4 10.84 总离差 3836.31 28 R2=0.9506 RAdj2=0.9013 注：**为差异极显著（P<0.01 ）；*为差异显著（P<0.05）
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表 4 发酵前后理化指标对比
Table 4 Comparison of physical and chemical indexes before and after fermentation
样品 SOD酶活力/（U/mL） 总酚/（mg/mL） 黄酮/（mg/mL） 花色苷/（mg/100mL） pH 可滴定酸/（g/100g） 发酵前 30.00± 5.30 4.31± 0.00 2.59 ±0.00 2.39±0.05 5.4 1.21±0.29 发酵后 132.07±2.31 6.28±0.29 3.48±0.10 5.64±0.12 4.19 2.82±0.27
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1. 何军波，贾庆超. 模糊数学评价结合响应面法优化黑蒜香菇酱制备工艺及抗氧化活性和储藏分析. 食品工业科技. 2023(19): 47-56 . 
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