Screening of High Oxalate-degrading Lactic Acid Bacterial Strains and Its Characteristics in Yogurt Fermentation
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摘要: 本实验以来源于自制酸奶、泡菜、酵头等特色发酵食品的49株乳酸菌为候选菌株，分光光度法测定菌株体外降解草酸盐能力和模拟胃肠道耐受性，主成分分析法评价各菌株发酵酸乳特性。结果表明，9株菌草酸盐降解率在70%以上，最高达86.96%；其中，菌株“四川郫县A1”、菌株“鄂温克”、菌株“鲁青6”在pH3.0酸溶液、人工模拟胃液、胆盐溶液、人工模拟肠液存活率均在50%以上；菌株“鲁青6”和菌株“鄂温克”发酵酸乳的感官评价、持水力、酸度、后酸度、破裂力、硬度、胶粘性、内聚力、咀嚼性、弹性等特性均较优；16S rDNA序列分析表明，菌株“鲁青6”为食窦魏斯氏菌，菌株“鄂温克”为副干酪乳杆菌。菌株“鲁青6”和菌株“鄂温克”既能高效降解草酸盐，又能耐受胃肠道环境，同时在酸乳中发酵特性优良，可作为功能酸乳开发候选菌株。Abstract: In this paper, 49 strains of lactic acid bacteria from self-made yogurt, pickles, fermented head and other characteristic fermented food were selected as candidate strains. The oxalate degradation ability and tolerance of simulated gastrointestinal tract in vitro were determined by spectrophotometry, and the characteristics of fermented yogurt were evaluated by principal component analysis. The result showed that the oxalate-degradation rate of 9 strains was more than 70%, the highest was 86.96%. Among them, the survival rate of the strains “Sichuan Pixian A1”, “Ewenki”, “Luqing6” in pH3.0 acid solution, artificial simulated gastric juice, bile salt solution and artificial simulated intestinal juice was more than 50%. The sensory evaluation, holding water capacity, titratable acidity, post-acidity, rupture force, hardness, gumminess, cohesiveness, chewiness and springiness of yoghurt fermented with the strains “Ewenki” and “Luqing6” were better. The strains “Ewenki” and “Luqing6” were Weissella cibaria and Lactobacillus paracasei. They could efficiently degrade oxalate and tolerate gastrointestinal environment, and at the same time, they had good fermentation characteristics in yoghurt and would be used as candidate strains for the development of functional yoghurt.
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食源性草酸在肠道的吸收和分解与高草酸尿症导致的草酸钙肾结石有密切关系[1-2]，虽然理论上可以通过控制食源草酸的摄入来减少肠道对草酸的吸收，进而降低尿液中草酸的浓度，但许多常见的食物均含草酸，导致控制草酸摄入量这一途径难以实现。因此，加强肠道微生物对草酸的分解，是预防草酸钙结石较为理想的方法[3-4]。
对于草酸盐降解菌，目前研究最深入的是食草酸杆菌（Oxalobacter formigenes），该菌能以草酸盐作为其生长代谢的唯一或主要碳源，降解草酸效果显著[5-7]。但草酸杆菌不能很好地适应胃肠道环境，并且其生长必须有高浓度草酸，致使其胃肠道长期定植的难度大大增加。因此，只能在高草酸尿症治疗中使用[5,8]。
近年来，有研究表明乳酸菌能分解草酸盐作为碳源，但其生长不依赖草酸盐浓度，不以草酸盐作为唯一可利用碳源，是典型的兼性草酸营养型细菌，再加之乳酸菌在肠道内定植方面的天然优势，使其在预防高草酸尿症方面具有独特的优势[9-10]。已报道的能降解草酸盐的乳酸菌包括乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、肠球菌属（Enterococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）等[10-11]。通过酸乳摄入能定植于人体胃肠道的高效降解草酸盐乳酸菌是一种预防草酸钙肾结石的新途径，以往的研究只关注乳酸菌的草酸盐降解性能，鲜有涉及高效降解草酸盐菌株的酸乳发酵性能。因此，将这些高效降解草酸盐菌株应用于酸乳发酵，需要明确其酸乳发酵特性。
本实验通过检测从牧区自制酸奶、家庭自制泡菜、酵头等特色发酵食品分离的乳酸菌降解草酸盐能力、体外胃肠道耐受能力、发酵酸乳能力，以期获得既能高效降解草酸盐，又能耐受胃肠道环境，同时在酸乳中发酵特性优良菌株，为功能酸乳奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
49株乳酸菌（见表1） 北方民族大学生物科学实验示范中心保存；德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 1805） 宁夏夏进乳业股份有限公司；胃蛋白酶（500 U/mg）、牛胆盐 Biotopped公司；胰蛋白酶（250 U/mg） 北京拜耳迪生物公司；酵母提取物 英国Oxoid公司；牛肉浸粉 青岛海博生物技术有限公司；纯牛奶 伊利利乐枕纯牛奶；葡萄糖、草酸钠、氯化钠、碳酸氢钠、酸氢二钾、无水乙酸钠、柠檬酸二铵、硫酸镁、硫酸钙、硫酸锰、吐温80 天津市大茂化学试剂厂；酸溶液参考鲍雅静等[12]、胆盐溶液等参考张丽[13]、人工模拟胃液参考杨续金[14]、人工模拟肠液参考张磊[15]和王立平[16]文献配制；草酸盐培养基：MRS培养基[16]经高压蒸汽灭菌后，待温度冷却到约60 ℃时，在500 mL MRS培养基中加入500 mL使用0.22 μm滤膜过滤的20 mmol/L草酸钠溶液，使其最终浓度为10 mmol/L。
表 1 菌株编号及来源Table 1. Name and source of strains菌株名称 来源 菌株名称 来源 菌株名称 来源 菌株名称 来源 天水A1 甘肃天水农户自制
芹菜浆水鲜豆腐1 内蒙古通辽农户自制
鲜奶豆腐定西BII1 甘肃定西农户
自制浆水云南昆明A 云南昆明农户
自制泡菜天水A3 甘肃天水农户自制
芹菜浆水新乌1 新疆乌鲁木齐天山区
农户自制酸奶定西BI1 甘肃定西农户
自制浆水云大陈8 云南大理农户
自制泡菜武都AVII 甘肃武都农户自制
芹菜浆水酸豆腐A2 内蒙古通辽农户自制
酸奶豆腐江西南昌A2 江西南昌农户
自制泡菜鲁青2 山东青岛农户
发面引子山东菏泽1 山东菏泽农户发面引子 山南奶圈1 西藏山南牧民
自制奶圈江西南昌A5 江西南昌农户
自制泡菜云大段2 云南大理农户
自制乳扇山东菏泽7 山东菏泽农户面引子 藏嘎圈3 西藏贡嘎牧民
自制奶圈四川郫县A1 四川郫县农户
自制泡菜翼承1 河北省承德农户
发面引子贵腌10 贵州六盘水农户
自制腌肉青黄南5 青海黄南牧民
自制曲拉四川郫县A8 四川郫县农户
自制泡菜北海2-11 广西北海农户
自制泡菜甘酵10 甘肃平凉农户发面酵头 拉丝酸奶1 新疆阿克苏农户自制
拉丝酸奶鲁青6 山东青岛农户
发面引子晋太1-5 山西太谷农户
发面引子酸奶五1 宁夏银川平吉堡
农户自制酸奶山南酸奶1 西藏山南农户自制酸奶 鲁青7 山东青岛农户
发面引子北海2-4 广西北海农户
自制泡菜驼奶9 新疆阿勒泰市农户
鲜骆驼奶新D9 新疆富蕴县阿勒泰
农户自制酸奶鲁宾1 山东滨州农户
发面引子鲁济19 山东济南农户
发面引子山羊奶3 新疆阿勒泰市农户
鲜山羊奶新E5 新疆喀什农户
自制酸奶鲁宾4 山东滨州农户
发面引子荷A11 山东省菏泽市农户
发面引子酸奶二5 宁夏银川吴忠农户
自制酸奶定西BI2 甘肃定西农户
自制浆水湖北A 湖北孝感农户
自制泡菜定西BII2 甘肃定西农户
自制浆水宁奶 宁夏银川平吉堡鲜奶 定西BII4 甘肃定西农户
自制浆水甘庆10 甘肃庆阳农户
发面酵头安A 安徽合肥农户
自制泡菜鄂温克 内蒙古鄂温克旗农户
自制酸奶SC-30型恒温水浴锅 上海汉诺有限公司；UV765型分光光度计 上海精科有限公司；TMS-PRO质构仪 配有不同规格的圆柱探头P/75，美国FTC公司；UV-5500紫外分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 高效降解草酸盐菌株的筛选
1.2.1.1 草酸盐标准曲线的制备
以草酸能催化铬酸钾氧化甲基红的原理，用分光光度法测量草酸盐浓度[17-18]。取7个10 mL的容量瓶分别加入0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8 mL用1 mmol/L草酸钠储备液稀释成为50 mol/L草酸钠工作液，用蒸馏水定容到刻度后加入2.0 mL 0.4 mol/L盐酸，2.0 mL 0.1 mmol/L甲基红溶液，4 mL 1.0 mmol/L铬酸钾溶液，摇匀反应15 min，加入1 mL 1.0 mmol/L Zr（IV）摇匀终止反应。以蒸馏水做参比在515 nm处测其硫酸钙吸光度值。以草酸钠浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，在Excel中绘制标准曲线，回归方程y=−0.0189x+0.7701，决定系数R2=0.9912。
1.2.1.2 回收率实验
参考金朝霞[19]、董婷婷[20]的方法，取5 mL含10 mmol/L草酸钠的MRS培养基，37 ℃ 100 r/min摇床培养48 h，取1.5 mL培养培养液，2500 r/min离心10 min，取1 mL上清液于10 mL的刻度试管中，加5 mL蒸馏水，用少量0.25 mol/L NaOH或者0.1 mol/L盐酸调pH至中性，蒸馏水定容至10 mL再进行50倍稀释，取10 mL稀释液于离心管中，加2.0 mL饱和硫酸钙和20 mL 95%乙醇混匀。室温加盖静置3 h，2500 r/min离心10 min，倒出上清液，沉淀即为草酸盐待测物。同标曲的方法，加入2.0 mL 0.4 mol/L盐酸后做相同处理，以蒸馏水做参比在515 nm处测吸光度值，代入标曲中计算获得检测液中草酸钠的浓度。
培养基中草酸钠浓度（mmol/L）=检测液中草酸钠浓度（μmol/L）×500/1000
式中：500表示培养液到测定液的稀释倍数。
回收率（%）=对照培养基中草酸钠浓度×100/10
式中：10表示培养基配制时加入的草酸钠浓度10 mmol/L。
1.2.1.3 菌株降解草酸盐能力测定
将保存在−80 ℃的乳酸菌菌种在常温中融化后，按接种量为2%的比例接种于5 mL MRS培养基中、37 ℃100 r/min摇床培养18~24 h进行活化。取0.2 mL活化菌液接种于5 mL含10 mmol/L草酸钠的MRS培养基，37 ℃100 r/min摇床培养48 h。以不接种乳酸菌，同样培养的空白草酸钠培养基为对照。当方法回收率在90%~110%时，测定试验菌株培养液和对照培养液的草酸钠浓度，计算各菌株草酸钠降解率。
降解率（%）=（1−菌株培养液草酸钠浓度/对照培养液草酸钠浓度）×100
1.2.2 菌株体外肠胃道耐受性测定
参考孙敏等[21]、赵瑞香等[22]、柏建玲等[23]和朱宏等[24]方法，稍作改动。将活化后的菌株按2%的比例接种于5 mL MRS液体培养基中，37 ℃100 r/min摇床培养24 h后，取培养液2 mL，12000 r/min离心2 min收集菌体，在超净工作台中倒掉上清液并加2 mL灭菌生理盐水进行重悬；吸取菌悬液0.5 mL分别加入到4.5 mL pH3.0 盐酸溶液、人工模拟胃液、胆盐溶液、人工模拟肠液和灭菌生理盐水中，37 ℃100 r/min摇床培养4 h，取500 μL上述处理液到5 mL的MRS培养基中，37 ℃100 r/min摇床培养8 h后，在600 nm处测吸光度值，用以下公式计算菌株存活率，以保加利亚乳杆菌为对照（CK）。
存活率（%）=(B/A)×100
式中：A表示生理盐水中培养吸光度值；B表示各处理液中培养吸光度值。
1.2.3 菌株酸乳发酵特性评价
1.2.3.1 菌悬液的制备
将筛选出的乳酸菌按2%的比例接种到MRS液体培养基中，37 ℃ 100 r/min摇床培养24 h，12000 r/min离心2 min收集菌体并调整菌悬液波长600 nm出的吸光度值为2.5，用无菌蒸馏水清洗3遍。
1.2.3.2 菌株发酵酸乳
参考袁凤霞等[25]方法，在纯牛奶中按15%的比例加入白砂糖，搅拌溶解后，在高压灭菌锅中95 ℃、120 Pa灭菌5 min。准确量4 mL菌悬液加到灭菌的牛奶混合液中摇匀。在培养箱中40 ℃发酵8~12 h。以保加利亚乳杆菌发酵酸乳为对照（CK）。
1.2.3.3 酸乳品质感官评价
参照生庆海等[26]制作的感官评价表，随机选10名16级食品科学与工程班的学生对4 ℃冷藏12 h后熟的酸乳，按感官评价标准从气味、质地、口感三个方面进行评价，计算平均值（表2）。
表 2 酸乳感官评定标准表Table 2. Sensory evaluation standard of yoghourt评价指标 得分标准 气味（20分） 有浓烈的奶香味（20~15分） 奶香味淡或不明显（14~4分） 出现臭味等异味（3~0分） 质地（40分） 丝状粘稠或非常硬（40~35分） 光滑均匀且无乳清析出（34~25分） 比较均匀或有少量乳清析出（24~16分） 粗糙，有乳清析出（15~6分） 粗糙且颗粒感明显，乳清析出严重（5~0分） 口感（40分） 酸甜充分融合（40~30分） 酸甜分明有层次感（29~20分） 过酸（19~10分） 过甜（9~6分） 有苦味（5~0分） 1.2.3.4 酸乳质构特性的测定
参考杨莹莹等[27]、徐鑫等[28]方法，选择TMS-75 mm型号的测试探头测量酸乳的破裂力、硬度、内聚性、胶黏性、咀嚼性和弹性等质构指标。条件如下：最小触发力设置为0.3 N、采样速度10 Hz、两次压缩停留间隔为0 s、测前和测后速率为30 mm/min。
1.2.3.5 酸乳持水力测定
参考孙敏等[21]、袁凤霞等[25]方法，准确称取发酵后的酸乳15 g，4500 r/min离心10 min后称取上清液的质量，并记录数据。持水力的计算公式如下所示：
X（%）=(A−B)×100/A
式中：X表示持水力，%；A表示样品质量，g；B表示上清液质量，g。
1.2.3.6 酸乳滴定酸度和后酸度测定
参考孙敏等[21]、袁凤霞等[25]方法，取5 g 4 ℃贮存0、3、6 d的酸乳、40 mL冷却煮沸水和5滴5 g/L酚酞酒精溶液，于三角瓶摇匀后，用已标定的NaOH标准溶液滴定到微红色，且颜色在 30 s内不消失即为滴定终点，记录消耗的 NaOH 标准溶液所用的毫升数。后酸度为第6和第0 d的酸度差。
1.2.4 菌株分子生物学鉴定
参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书；PCR扩增16S rDNA，50 μL PCR反应体系：25 μL 10×PCR Mix、1 μL 10 µmol/L的上下游引物（27F/1492R[29]）、1 μL模板DNA、22 μL ddH2O。PCR反应程序为：预变性94 ℃ 10 min；变性94 ℃ 1 min；退火56 ℃ 1 min；延伸72 ℃ 1 min；30个循环；后延伸72 ℃ 10 min，由南京金斯瑞生物公司进行测序。将测序序列在EZBioCloud 数据库中比对鉴定。分别以Weissella halotolerans（AB022926.1）和Lactobacillus bifermentans（M58809.1）16S rDNA序列为外群，利用MrBayes3.2.5构建系统发育树。
1.3 数据处理
实验重复3次，用Excel作图，SPSS 21软件对试验数据进行方差分析。
主成分分析法（PCA）评价[30]：采用SPSS21软件将发酵酸乳品质指标进行主成分分析，取累计贡献率不低于85%且特征值大于1.00的因子作为主成分。利用主成分对发酵酸乳进行综合评价，并将各主成分得分Fi 乘以相应权重后求和，就能得到综合评价函数。
2. 结果与分析
2.1 高效降解草酸盐菌株筛选
49株供试乳酸菌菌株表现出不同降解的效果，有7株乳酸菌的培养基中草酸的降解率小于0，占总数的14.3%，在培养的过程中不仅没有降解草酸钠，甚至出现草酸盐含量增长的现象；23株菌降解率0%~30%，占总数46.94%；降解率31%~69%的菌有10株，占20.41%；只有菌株“天水A1”、“四川郫县A1”、“驼奶9”、“鲁青6”、“鄂温克”、“拉丝酸奶1”、“山南酸奶1”、“鲁济19”、“云南昆明A”等9株菌的降解率在70%以上，占18.36%（图1），9株菌中降解率最高的是菌株“拉丝酸奶1”，达86.96%（图2）。
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2.2 菌株体外肠胃道耐受性
测定草酸盐降解率高于70%的9株菌体外胃肠道耐受性，结果如图3，在pH3.0的酸溶液中，9株高降解菌的存活率在31%～67%之间，其中最高的菌株是“鲁青6”存活率为66.36%；在人工模拟胃液中，9株菌的存活率在32%～61%之间，最高为菌株“鲁青6”，达60.13%；在胆盐溶液中，9株菌的存活率在35%～73%之间，最高是菌株“拉丝酸奶1”，达72.19%；在人工模拟肠液中，各菌株的存活率均在69%～155%之间，菌株“鲁青6”、“鄂温克”的存活率在100%以上，分别为116.12%和153.26%。选取在各个溶液中的存活率耐受性均高于50%的3株菌株“四川郫县A1”、“鄂温克”、“鲁青6”作为在胃肠道耐受性较好菌株。
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图 3 高效降解草酸盐菌株模拟胃肠道耐受性结果Figure 3. Result of tolerance of strains with high efficient degradation oxalate in artificial simulated gastrointestinal tract environment2.3 发酵酸乳特性评价
2.3.1 发酵酸乳品质感官评价
感官评价是发酵酸乳风味测评的一个重要手段，将体外胃肠道耐受性实验中筛选出的3株菌以及对照菌用于制作酸乳，在后熟之后对酸乳的质地、气味以及口感三个方面进行评价。结果如表3，气味指标得分最高的是菌株对照保加利亚乳杆菌、菌株“四川郫县A1”和菌株“鄂温克”菌株发酵酸乳；质地和口感得分最高的是对照保加利亚乳杆菌、菌株“鲁青6”和菌株“鄂温克”菌株发酵酸乳；总计得分最高的是对照保加利亚乳杆菌和菌株“鲁青6”发酵酸乳，最低的是菌株“四川郫县A1”发酵酸乳。
表 3 各菌株发酵酸乳感官评价结果（分）Table 3. Sensory evaluation scores of yoghourts fermented with different strains (scores)2.3.2 发酵酸乳持水力
酸乳持水力是指经过高速离心后，酸乳凝胶体系中总固形物对水分的保持能力，在酸乳持水力越高，说明大分子物质对水分子的作用力越强，稳定性也越好。各菌株发酵的酸乳的持水力在45%~75%之间（图4），其中持水力最大的是菌株“鄂温克”发酵酸乳，达到了75.61%，菌株“鲁青6”发酵酸乳次之，持水力最小的是菌株“四川郫县A1”的为47.73%。
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图 4 菌株发酵酸乳持水力Figure 4. Holding water capacity of yoghourt fermented with different strains2.3.3 发酵酸乳酸度和后酸度
酸度是影响发酵酸乳口感的重要因素之一，后酸度对发酵酸乳贮藏期间的风味和贮藏时间有直接影响[31]。表4可知，菌株“鄂温克”发酵酸乳的酸度最高，但保存6 d后后酸度却最大，后酸度最小的是菌株“鲁青6”发酵酸乳，为10.66 °T，其酸度也适宜。从发酵酸乳酸度和后酸度方面比较，菌株“鲁青6”发酵酸乳较好。
表 4 菌株发酵酸乳酸度和后酸度（°T）Table 4. Titratable acidity and post-acidity of yoghourt fermented with different strains (°T)菌种 0 d滴定酸度 3 d滴定酸度 6 d滴定酸度 后酸度 四川郫县A1 61.26±1.1913d 64.34±0.8159d 75.06±0.5950d 13.81b 鲁青6 66.29±0.7905c 69.68±0.1834c 76.95±1.1012c 10.66d 鄂温克 77.70±0.5651a 84.01±0.5110a 97.52±0.5780a 19.82a 对照 67.66±0.5170b 77.41±1.2382b 78.71±0.5918b 11.04c 2.3.4 发酵酸乳质构特性
质地是评价酸乳感官质量的重要指标之一，质构仪是一种测定食品质地的现代化精密仪器，可模拟人体口腔再以具体的数据客观地测评发酵酸乳质地，使分析的结果更准确。如图5、图6，4株菌发酵酸乳的破裂力、咀嚼性、弹性以菌株“鲁青6”发酵酸乳的最高，硬度以菌株“鄂温克”发酵酸乳的最大，胶粘性和内聚力以菌株“鄂温克”和菌株“鲁青6”发酵酸乳最高。因此，菌株“鲁青6”发酵酸乳大多数质构指标较优。
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图 5 菌株发酵酸乳的破裂力、硬度、胶黏性、内聚力、咀嚼性Figure 5. Rupture force, hardness, gumminess, cohesiveness and chewiness of yoghourt fermented with different strains2.3.5 主成分分析法综合评价发酵酸乳品质
对酸乳的酸度、后酸度、持水力以及各质构指标进行主成分分析，根据特征值大于1、积累贡献率大于85%为标准能提取出两个主成分，如表5，这两个主成分的累计贡献率达到了85.538%，说明用这两个主成分能够反应原有变量的大多数数据的信息，其中，第一主成分的贡献率为63.224%，特征值为5.690；第二主成分的贡献率为22.314%，特征值为2.008。
表 5 总方差分解结果Table 5. Total variance explained成分 初始特征值 提取特征值 特征值 各特征值方差贡献率（%） 累积方差贡献率（%） 特征值 各特征值贡献率（%） 累积方差贡献率（%） 酸度X1 5.690 63.224 63.224 5.690 63.224 63.224 后酸度X2 2.008 22.314 85.538 2.008 22.314 85.538 持水力X3 0.680 7.559 93.098 破裂力X4 0.346 3.842 96.940 硬度X5 0.113 1.258 98.198 胶粘性X6 0.106 1.176 99.373 内聚力X7 0.042 0.472 99.845 咀嚼性X8 0.012 0.133 99.978 弹性X9 0.002 0.022 100.000 主成分旋转矩阵（表6），第一主成分里的高载荷指标有破裂力X4（因子载荷值为0.797）、内聚力X7（因子载荷值为0.882）、咀嚼性X8（因子载荷值为0.892）、弹性X9（因子载荷值为0.909）；第二主成分包含的高载荷指标有酸度X1（因子载荷值为0.923）、后酸度X2（因子载荷值为0.879）、持水力X3（因子载荷值为0.736）、硬度X5（因子载荷值为0.807）、胶粘性X6（因子载荷值为0.667）。
表 6 主成分载荷矩阵Table 6. Principal component loading matrix of PCA指标 主成分1 主成分2 酸度X1 0.301 0.923 后酸度X2 −0.373 0.879 持水力X3 0.646 0.736 破裂力X4 0.797 0.180 硬度X5 0.469 0.807 胶粘性X6 0.656 0.667 内聚力X7 0.882 0.194 咀嚼性X8 0.892 0.177 弹性X9 0.909 由表6可得出各主成分的表达式：
F1=0.301X1−0.373X2+0.646X3+0.797X4+0.469X5+0.656X6+0.882X7+0.892X8+0.909X9
F2=0.923X1+0.879X2+0.736X3+0.180X4+0.667X5+0.194X6+0.194X7+0.177X8
通过以上2个主成分可构建出酸乳的综合品质评价模型F：
F=5.690F1+2.008F2
根据的综合品质评价模型可得各菌株发酵酸乳综合得分，如表7，菌株“鲁青6”和菌株“鄂温克”发酵酸乳得分较高，表明菌株“鄂温克”和菌株“鲁青6”发酵酸乳品质最好。
表 7 高效降解菌株发酵酸乳的主成分得分和综合得分Table 7. Principal component scores and comprehensive scores of yoghourt fermented efficient degradation strains菌株 F1 F2 F 菌株平均综合得分 四川郫县A1 29.04 68.79 303.39 319.01±14.89c 33.84 69.97 333.05 31.91 69.24 320.59 鲁青6 46.30 70.79 405.59 404.52±7.41ab 47.16 71.23 411.34 44.06 72.67 396.64 鄂温克 44.59 89.87 434.20 414.34±17.46a 39.53 90.89 407.44 38.78 89.99 401.39 对照 42.86 72.78 389.99 382.8±7.61b 39.85 73.75 374.82 41.70 72.88 383.59 2.4 菌株分子鉴定
菌株“鲁青6”和“鄂温克”既能高效降解草酸盐，又能耐受胃肠道，同时酸乳发酵特性优良。提取菌株基因组 DNA，采用 PCR扩增16S rDNA序列，获得约1500 bp序列，测序后将序列在Ezbiocloud中比对，结果显示菌株“鲁青6”的16S rDNA序列与Weissella cibaria KACC11862（Type）的16S rDNA序列（AEKT01000037）相似度高达100%，菌株“鄂温克”的16S rDNA序列与Lactobacillus paracasei subsp. tolerans JCM 1171（Type）的16S rDNA序列（D16550）相似度高达100%，将序列和属其他种的16S rDNA用Bayes法构建系统发育树上，显示“鲁青6”与食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）聚在一起（图7），“鄂温克”与副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）聚在一起（图8）。因此，菌株“鲁青6”为食窦魏斯氏菌，菌株“鄂温克”为副干酪乳杆菌。
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图 7 基于16S rDNA用Bayes 法构建魏斯氏菌属系统发育树Figure 7. Phylogenetic tree of the genera Weissella based on 16S rDNA sequences![]()
图 8 基于16S rDNA 用 Bayes 法构建乳杆菌属系统发育树Figure 8. Phylogenetic tree of the genera Lactobacillus based on 16S rDNA sequences3. 结论与讨论
不同生境、不同种属的乳酸菌降解草酸盐的能力不同。Weese等[32]报道来自犬粪便样品的37株乳酸菌体外降解草酸盐活性最高65%。Federici等[33]报道动物双歧杆菌菌株（Bifidobacterium animalis）DSM10104降解率为61%，而长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）菌株MB 282和青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentic）菌株MB 238的降解率分别为35%和57%，短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）菌株MB 283的降解率为38%。本实验49株供试乳酸菌中，约38.77%降解率的菌株在30%以上，18.36%降解率的菌株在70%以上，降解率最高达86.96%。不仅具有降解能力的菌株比例高，部分菌株对培养基中的草酸盐的降解率也高于报道，提示我们中国民间传统发酵食品中蕴藏着丰富而独特的微生物资源，有待于进一步发掘。
本实验获得食窦魏斯氏菌菌株“鲁青6”和副干酪乳杆菌菌株“鄂温克”既能高效降解草酸盐，又能耐受胃肠道，同时酸乳发酵特性优良，但本实验仅进行了菌株体外降解草酸盐实验，后续开展2株菌体内降解实验和菌株安全性评价实验取得较好结果后，2株菌可作为功能酸乳开发候选发酵菌株。
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图 3 高效降解草酸盐菌株模拟胃肠道耐受性结果
Figure 3. Result of tolerance of strains with high efficient degradation oxalate in artificial simulated gastrointestinal tract environment
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图 4 菌株发酵酸乳持水力
Figure 4. Holding water capacity of yoghourt fermented with different strains
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图 5 菌株发酵酸乳的破裂力、硬度、胶黏性、内聚力、咀嚼性
Figure 5. Rupture force, hardness, gumminess, cohesiveness and chewiness of yoghourt fermented with different strains
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图 7 基于16S rDNA用Bayes 法构建魏斯氏菌属系统发育树
Figure 7. Phylogenetic tree of the genera Weissella based on 16S rDNA sequences
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图 8 基于16S rDNA 用 Bayes 法构建乳杆菌属系统发育树
Figure 8. Phylogenetic tree of the genera Lactobacillus based on 16S rDNA sequences
表 1 菌株编号及来源
Table 1 Name and source of strains
菌株名称 来源 菌株名称 来源 菌株名称 来源 菌株名称 来源 天水A1 甘肃天水农户自制
芹菜浆水鲜豆腐1 内蒙古通辽农户自制
鲜奶豆腐定西BII1 甘肃定西农户
自制浆水云南昆明A 云南昆明农户
自制泡菜天水A3 甘肃天水农户自制
芹菜浆水新乌1 新疆乌鲁木齐天山区
农户自制酸奶定西BI1 甘肃定西农户
自制浆水云大陈8 云南大理农户
自制泡菜武都AVII 甘肃武都农户自制
芹菜浆水酸豆腐A2 内蒙古通辽农户自制
酸奶豆腐江西南昌A2 江西南昌农户
自制泡菜鲁青2 山东青岛农户
发面引子山东菏泽1 山东菏泽农户发面引子 山南奶圈1 西藏山南牧民
自制奶圈江西南昌A5 江西南昌农户
自制泡菜云大段2 云南大理农户
自制乳扇山东菏泽7 山东菏泽农户面引子 藏嘎圈3 西藏贡嘎牧民
自制奶圈四川郫县A1 四川郫县农户
自制泡菜翼承1 河北省承德农户
发面引子贵腌10 贵州六盘水农户
自制腌肉青黄南5 青海黄南牧民
自制曲拉四川郫县A8 四川郫县农户
自制泡菜北海2-11 广西北海农户
自制泡菜甘酵10 甘肃平凉农户发面酵头 拉丝酸奶1 新疆阿克苏农户自制
拉丝酸奶鲁青6 山东青岛农户
发面引子晋太1-5 山西太谷农户
发面引子酸奶五1 宁夏银川平吉堡
农户自制酸奶山南酸奶1 西藏山南农户自制酸奶 鲁青7 山东青岛农户
发面引子北海2-4 广西北海农户
自制泡菜驼奶9 新疆阿勒泰市农户
鲜骆驼奶新D9 新疆富蕴县阿勒泰
农户自制酸奶鲁宾1 山东滨州农户
发面引子鲁济19 山东济南农户
发面引子山羊奶3 新疆阿勒泰市农户
鲜山羊奶新E5 新疆喀什农户
自制酸奶鲁宾4 山东滨州农户
发面引子荷A11 山东省菏泽市农户
发面引子酸奶二5 宁夏银川吴忠农户
自制酸奶定西BI2 甘肃定西农户
自制浆水湖北A 湖北孝感农户
自制泡菜定西BII2 甘肃定西农户
自制浆水宁奶 宁夏银川平吉堡鲜奶 定西BII4 甘肃定西农户
自制浆水甘庆10 甘肃庆阳农户
发面酵头安A 安徽合肥农户
自制泡菜鄂温克 内蒙古鄂温克旗农户
自制酸奶
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表 2 酸乳感官评定标准表
Table 2 Sensory evaluation standard of yoghourt
评价指标 得分标准 气味（20分） 有浓烈的奶香味（20~15分） 奶香味淡或不明显（14~4分） 出现臭味等异味（3~0分） 质地（40分） 丝状粘稠或非常硬（40~35分） 光滑均匀且无乳清析出（34~25分） 比较均匀或有少量乳清析出（24~16分） 粗糙，有乳清析出（15~6分） 粗糙且颗粒感明显，乳清析出严重（5~0分） 口感（40分） 酸甜充分融合（40~30分） 酸甜分明有层次感（29~20分） 过酸（19~10分） 过甜（9~6分） 有苦味（5~0分）
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表 3 各菌株发酵酸乳感官评价结果（分）
Table 3 Sensory evaluation scores of yoghourts fermented with different strains (scores)
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表 4 菌株发酵酸乳酸度和后酸度（°T）
Table 4 Titratable acidity and post-acidity of yoghourt fermented with different strains (°T)
菌种 0 d滴定酸度 3 d滴定酸度 6 d滴定酸度 后酸度 四川郫县A1 61.26±1.1913d 64.34±0.8159d 75.06±0.5950d 13.81b 鲁青6 66.29±0.7905c 69.68±0.1834c 76.95±1.1012c 10.66d 鄂温克 77.70±0.5651a 84.01±0.5110a 97.52±0.5780a 19.82a 对照 67.66±0.5170b 77.41±1.2382b 78.71±0.5918b 11.04c
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表 5 总方差分解结果
Table 5 Total variance explained
成分 初始特征值 提取特征值 特征值 各特征值方差贡献率（%） 累积方差贡献率（%） 特征值 各特征值贡献率（%） 累积方差贡献率（%） 酸度X1 5.690 63.224 63.224 5.690 63.224 63.224 后酸度X2 2.008 22.314 85.538 2.008 22.314 85.538 持水力X3 0.680 7.559 93.098 破裂力X4 0.346 3.842 96.940 硬度X5 0.113 1.258 98.198 胶粘性X6 0.106 1.176 99.373 内聚力X7 0.042 0.472 99.845 咀嚼性X8 0.012 0.133 99.978 弹性X9 0.002 0.022 100.000
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表 6 主成分载荷矩阵
Table 6 Principal component loading matrix of PCA
指标 主成分1 主成分2 酸度X1 0.301 0.923 后酸度X2 −0.373 0.879 持水力X3 0.646 0.736 破裂力X4 0.797 0.180 硬度X5 0.469 0.807 胶粘性X6 0.656 0.667 内聚力X7 0.882 0.194 咀嚼性X8 0.892 0.177 弹性X9 0.909
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表 7 高效降解菌株发酵酸乳的主成分得分和综合得分
Table 7 Principal component scores and comprehensive scores of yoghourt fermented efficient degradation strains
菌株 F1 F2 F 菌株平均综合得分 四川郫县A1 29.04 68.79 303.39 319.01±14.89c 33.84 69.97 333.05 31.91 69.24 320.59 鲁青6 46.30 70.79 405.59 404.52±7.41ab 47.16 71.23 411.34 44.06 72.67 396.64 鄂温克 44.59 89.87 434.20 414.34±17.46a 39.53 90.89 407.44 38.78 89.99 401.39 对照 42.86 72.78 389.99 382.8±7.61b 39.85 73.75 374.82 41.70 72.88 383.59
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