Variation of Volatile Substances in High-salt Dilute Fermentation Process of Monascus Mixed Koji Production
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摘要: 为研究添加红曲复合制曲酿造酱油高盐稀态发酵过程中风味物质变化，通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）对稀醪中的挥发性风味物质进行分析，确定稀醪的固相微萃取最佳条件为：75 μm CAR/PDMS萃取头，添加2.5 g氯化钠、萃取温度50 ℃、萃取时间30 min。在该条件下，对不同酱油的挥发性物质种类数量及其占比进行分析，发现红曲酱油相比于其他酱油具有更高的酯类物质占比和丰度，并对稀醪发酵10、30、50、70、80、120、160 d样品检测得到醇类（14种）、酸类（7种）、酮类（9种）、酯类（15种）、酚类（6种）、醛类（3种）、吡嗪类（3种）、吡咯类（1种）、烯类（1种）、呋喃类（2种）和其他（4种），共65种物质。对比发现，红曲酱油挥发性物质中酯类的含量与种类最为丰富，是构成红曲酱油风味的的主要物质。经热图分析发现，稀醪发酵0~120 d是醛酮类、吡嗪、吡咯类物质含量的生成时期；醇类物质是在整个发酵期间均有某种物质显著增加，稀醪发酵80~180 d是酚类、酸类、酯类的显著增加时期；其中酯类香气物质的增加说明了红曲酵母的添加显著加强了酱油的酯类风味，改善了酱油风味。Abstract: To study the changes of flavor substances in the high-salt dilute fermentation process of soy sauce brewed by adding red koji complex, the volatilization in the dilute mash was analyzed by headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). For analysis of sexual flavor substances, it was determined that the best conditions for solid-phase microextraction of dilute mash were: 75 μm CAR/PDMS extraction head, 2.5 g sodium chloride, extraction temperature 50 ℃, extraction time 30 min. Under these conditions, the quantity and proportion of volatile substances in different soy sauces were analyzed, and it was found that meniscus soy sauce had a higher proportion and abundance of esters than other soy sauces, and it was fermented for thin mash10, 30, 50, 70, 80, 120, 160 d samples detected alcohols (14 types), acids (7 types), ketones (9 types), esters (15 types), phenols (6 types), Aldehydes (3 types), pyrazines (3 types), pyrroles (1 type), alkenes (1 type), furans (2 types) and others (4 types), a total of 65 substances. By comparison, it was found that the content and types of esters in the volatile substances of monascus soy sauce were the most abundant, and they were the main substances that constitute the flavor of monascus soy sauce. Through heat map analysis, it was found that the content of aldehydes ketones, pyrazines, and pyrrole substances was produced from 0~120 days of thin mash fermentation. Alcohol substances increased significantly during the whole fermentation period, and 80~180 days of thin mash fermentation was the period of significant increase of phenols, acids, and esters. The increase of ester flavoring substances indicated that the addition of red yeast significantly enhanced the flavor of ester and improved the flavor of soy sauce.
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酱油是一种历史悠久的发酵调味品，迄今已有两千多年历史[1]，其酿造工艺为使用大豆或豆粕为蛋白质原料，面粉或小麦麸皮为淀粉原料，熟化后加入曲霉等微生物培养曲料，通过微生物产生的蛋白酶、淀粉酶等丰富酶系的降解作用和后期其他微生物的协同发酵下，获得色香味俱全的优质调味品[2]。随着中国经济突飞猛进的发展，人们生活水平显著提高，对酱油的品质有了更高要求，酱油工业的发酵方法经历了从以追求生产效率高的低盐固态发酵法为主，到以逐渐注重酱油风味品质的现代高盐稀态发酵法为主。酱油风味品质的追求，其本质是对于酱油产品中挥发性风味物质种类和总量的追求。挥发性风味物质作为酱油风味品质的重要组成部分，对酱油的香气和口感都有重要影响[3]。目前，国内外对酱油香气已进行了大量研究，Steinhaus 等[4]使用芳香提取物稀释分析技术（Aroma extract dilution analysis，AEDA）研究日本酱油，认为3-甲基丁醛等13种挥发性物质是酱油中的主要香气物质；赵佳豪等[5]利用气相色谱质谱联用仪（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）对比了中日酱油的挥发性风味物质，发现乙酸乙酯、2-苯乙醇等共17种差异挥发性风味物质，造成了中日酱油香气上的差异；张艳芳等[6]从低盐固态发酵酱油和高盐稀态发酵酱油中分析鉴定出52种挥发性物质，并对比出1-辛烯-3-醇为低盐固态发酵酱油主要成分，4-乙基愈创木酚为高盐稀态发酵酱油主要成分。无论是低盐固态发酵酱油、高盐稀态发酵酱油，还是国内外不同的酱油，均有研究者进行了大量的研究，而对酱油发酵过程中稀醪挥发性风味物质的研究却鲜见报道。
红曲为曲霉科真菌红曲霉（Monascus purpureus Went.）附着在粳米上的俗称，一般常用于黄酒[7]、醋[8]等调味品的发酵，其发酵过程中能够分泌辅酶Q10和洛伐他汀等抗氧化物质，具有降低血脂和预防癌症等作用[9]。赵吉兴[10]研究证明酱油中添加红曲后红色指数和色泽有明显增强，陈之瑶等[11]研究认为使用红曲制作的糖化增香曲进行酱油混合制曲能够增加氨基态氮等理化性质，Hsiao等[12]在酱油发酵中添加红曲霉，发现酱油的氨态氮和谷氨酸含量均有所提高。Lim等[13]利用红曲霉固态发酵大豆，发现发酵液酚含量和清除自由基能力有明显提高。目前对于添加红曲后酿造风味的变化并未见有详细研究。
本研究通过优化顶空固相微萃取的萃取参数选择一种适用于提取和分析酱油稀醪中挥发性风味物质的萃取方法，并对添加红曲霉菌混合制曲后的不同发酵时间段的稀醪样品香气成分进行分析，进一步研究红曲酿造酱油风味物质的发酵变化，为更有效利用红曲和提升酱油的品质提供理论依据和参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
高盐稀态酱油稀醪（主要原料为脱脂豆粕、麸皮、水、氯化钠等，盐度为17%，稀醪发酵10、30、50、70、80、120、160 d；编号分别为a、b、c、d、e、f、g） 由福建省潘氏食品有限公司提供，采用混菌制曲发酵（含红曲霉菌、米曲霉）；WSD生抽酱油、MT生抽酱油 购自当地超市；2-辛醇（色谱纯） 购自美国Sigma公司；其他试剂 均为色谱纯或分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
GC-2010-DSQ II气相色谱-质谱联用仪、HP-INNOWAX气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 美国Agilent公司；固相微萃取（SPME）装置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头（DCP）、75 μmCAR/PDMS萃取头（CP）、65 μmDVB /PDMS萃取头（DP） 美国Supelco公司；15 mL顶空钳口样品瓶 上海安谱公司；DF-1型号集热式磁力搅拌器 金坛市鑫渃实验仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 萃取头筛选试验
将酱醪取1850 mg（约1.6 mL）移入顶空萃取瓶中，添加2.0 g氯化钠、2 μL的内标2-辛醇（10 mg/L），放入磁力搅拌转子，置于恒温加热磁力搅拌器中，50 ℃水浴10 min预热，随后将老化后的萃取头插入顶空瓶中，推出纤维头进行萃取，保持50 ℃恒温水浴萃取30 min，重复3次。筛选相似度>80%的有效挥发性物质，对50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS三种萃取头萃取酱油稀醪30 d的挥发性物质进行分析比较。
1.2.2 单因素实验
以总峰面积和主要挥发性物质（A：乙酸；B：正己醇；C：2-壬基酮；D：3-呋喃甲醇；E：苯乙醇；F：2-甲氧基苯酚；G：3-甲基丁酸；H：2-甲基丙酸；I：2-甲氧基-4-乙烯基苯酚；J：2/3-甲基丁醇乙酸酯）的相对峰面积（即每个考察点相对于第一个考察点峰面积的相对百分数，如氯化钠添加量1.0 g的相对峰面积为100%）确定该萃取头顶空固相微萃取的条件。考察氯化钠添加量（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g），萃取温度50 ℃，萃取时间30 min；考察萃取温度（40、45、50、55、60 ℃），氯化钠添加量1.5 g，萃取时间30 min；考察萃取时间（10、20、30、40、50 min），氯化钠添加量1.5 g，萃取温度50 ℃；最后在最佳萃取条件下对酱油稀醪不同时期中的挥发性风味物质进行分析。
1.2.3 GC-MS分析
毛细管色谱柱：HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：高纯度氦气，柱流量：1 mL/min，不分流进样；进样口温度：250 ℃；离子源：EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，质量扫描范围m/z 33～500；ACQ方式 Scan MS ，接口温度250 ℃，连接杆温度150 ℃。
程序升温：起始温度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升至 220 ℃，保留8 min；后运行温度240 ℃，后运行时间5 min。
1.3 数据分析
定性方法：将测得物质谱图与 NIST11和Wiley 中标准谱图进行检索对比，并与相关文献报道的挥发性物质描述和保留指数相比较，确证所检出红曲酱油中香气物质的各种化学成分。
定量方法：采用半定量方法，添加 2 μL 2-辛醇（10 mg/L）作为内标，再利用被测物与内标物面积的比值来计算各种挥发性风味物质的质量浓度。
采用Excel 2016对数据进行初步的分析整理，使用Origin 2017软件和R软件绘制热图（Heatmap）进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 最佳萃取头选择
本实验比较了50/30 μm CAR/ DVB/PDMS萃取头（CDP）、75 μm CAR/PDMS萃取头（CP）、65 μm DVB/PDMS萃取头（DP）在顶空固相微萃取（HSME）中对萃取挥发性成分的影响。由图1萃取头的质谱图可知，三种萃取头之间萃取效果具有显著差异，萃取头DP萃取物质相较于萃取头CP和萃取头CDP，物质种类和总量皆明显少于后两种萃取头，萃取头CP与CDP相比出峰数量较为接近。
由图1可知萃取头CP萃取得到54种挥发性化合物，萃取头CDP萃取得到56种挥发性化合物，萃取头DP萃取得到48种挥发性化合物，说明萃取头CP和CDP在萃取效果具有相似水平，且优于萃取头DP。从不同萃取头萃取物质的总质量来看，可初步看出萃取头CP的萃取效果则明显优于其他两种萃取头。进一步通过主成分分析法（PCA）对萃取头萃取数据进行分析，结果如图2所示。第一主成分（PC1）贡献率占52.5%，第二主成分（PC2）贡献率占37.1%，累计达89.6%，符合主成分分析的要求，能够包含大部分原始变量信息[14]。
由图2（主成分分析图）可知，含有DVB涂层的萃取头DP和CDP落在PC1的负半轴部分，而萃取头CP落在PC1轴的正半轴。从PC2轴上看，萃取头CDP在正半轴，萃取头CP和DP在负半轴上。说明三种萃取头萃取的挥发性化合物种类和浓度具有显著差异。
由图3（载荷图）可知，分子量较大的大多处于PC1的负半轴，如2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、苯乙酸甲酯、2,6-二甲氧基苯酚、2-苯乙酯乙酸、苯乙酸乙酯、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚、2,4-双（1,1-二甲基乙基）苯酚等芳香族和杂环类大分子物质，说明萃取头DP和CDP对此类物质具有较强的吸附能力。这是因为萃取头中的DVB涂料中的苯环由于相似相溶原理，对芳香族和杂环类物质具有更强的萃取能力。同时由载荷图可知，小分子化合物（No.1~23）除乙酰胺（No.2）和吡啶（No.5）位于PC1负半轴外，其他都在正半轴，且大部分位于第四象限。说明萃取头CP对于低分子量、低沸点的化合物具有最佳的萃取效果，这与顾苑婷等[15]的研究报道相一致。可以得出不用萃取有具备不同的萃取优点，萃取头DP和CDP对大分子、高沸点物质萃取效果较佳，CP对于低沸点的香气物质萃取效果较佳。
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图 3 不同萃取头主成分分析图注：图3中数字附表中按照分子量从小到大排序的挥发性物质。Figure 3. Principal component analysis of different extraction heads综合以上分析，选取萃取头CP作为酱醪顶空固相微萃取的最佳萃取头进行下一步研究。
2.2 顶空固相微萃取条件优化单因素实验
2.2.1 氯化钠添加量对顶空固相微萃取的影响
酱油稀醪在顶空固相微萃取过程中需要加入蒸馏水对其进行稀释，其溶液中的离子强度将会降低。顶空固相微萃取SPME萃取体系中加入氯化钠，能够利用溶液中盐离子的“盐析”作用进行增强分析灵敏度和提高萃取效率[16]。研究氯化钠添加量对SPME萃取酱醪中挥发性物质的影响，结果如图4所示（以氯化钠添加1.0 g为100%）。随着氯化钠添加量的增加，相对总峰面积逐渐增加，氯化钠添加2.5 g时达到峰值，随后相对总峰面积下降。10种主要物质中，除物质H（2-甲基丙酸）外，其他物质的相对峰面积皆在2.5 g处达到峰面积，其中3-呋喃甲醇、苯乙醇、2-甲氧基苯酚在2.5 g处具有显著差异（P<0.05）。说明氯化钠的添加对SPME具有较大的促进作用，当添加量大于2.5 g时具有反作用。因此，选择氯化钠添加量2.5g为SPME的最适添加量。
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2.2.2 萃取温度对顶空固相微萃取的影响
SPME的萃取温度对萃取体系分析物的扩散速度具有重要影响，王志娟等[17]发现在一定温度范围内, 温度升高促进易挥发成分到达顶空及萃取纤维层表面。因此，选择合适的温度在研究高盐稀态酱油酱醅的挥发性成分具有重要意义。经研究分析，结果如图5所示，总峰面积的相对峰面积随着温度的升高而提高，40 ℃（相对40 ℃时的总峰面积为100%，下同）和45 ℃（相对于40 ℃时总峰面积的百分比102.53%）较为接近，50 ℃（120.94%）和55 ℃（123.80%）较为接近，60 ℃（133.66%）最高，说明温度的升高能够提高分析物的扩散速度和萃取效率。10种挥发性化合物的相对峰面积中，物质BCDEFI遵循相对总峰面积的增长趋势，但是物质BCDF在温度60 ℃处出现了不正常的增长，除物质B在55 ℃处有略微下降外，BCDF均在60 ℃处突然上升；相反的，物质AHJ的相对峰面积呈现先增加后减少的趋势，均在50 ℃出现峰值，尤其是物质HJ在温度60 ℃处出现相对峰面积低于100%（分别为73.33%和43.65%）的情况；物质G的趋势则是在波动，且在50 ℃（125.10%）和60 ℃（128.41%）出现较高且相接近的相对峰面积。综合以上情况说明，温度对不同化合物的影响程度不同，以物质C（相对分子质量142）为代表的大分子化合物在温度较高时的释放度增加，更快的吸附至萃取头中，由于吸附面积的一定，产生了竞争性吸附，从而降低其他物质的待分配系数，出现相对峰面积低于100%的情况，此情况与尹建邦的研究[18]相一致。因此，从萃取挥发性物质的丰度和相对浓度的角度来选择，把50 ℃作为最适的温度，作为后续研究的萃取温度。
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图 5 不同萃取温度萃取物质相对峰面积对比Figure 5. Comparison of relative peak areas of extracted substances at different extraction temperatures2.2.3 萃取时间对顶空固相微萃取的影响
萃取时间指的是SPME时达到平衡所需要的时间，此时固相萃取头的吸附物质相对饱和，且萃取物质的组成较为合理，过长的萃取时间会改变原本萃取物质的组成成分，并有可能吸附水蒸气，降低萃取头使用寿命和增加柱流失。因此，本文研究了不同萃取时间对SPME萃取高盐稀态酱油酱醅中的挥发性成分的影响，结果见图6（以萃取时间10 min为100%）。相对总峰面积随着时间的增加而不断增长，挥发性物质DEGHJ均在30 min时有最大的相对峰面积，说明此类物质达到平衡的时间为30 min较为合适。具有高沸点、低分配系数的物质I（即2-甲氧基-4-乙烯基苯酚）的峰面积在40 min之后峰面积快速增长，说明此类物质需要较长时间的萃取。寇晓琳等[19]进行的研究同样说明，过长时间的萃取会导致高沸点物质的占比显著增加。因而可能导致对酱醅中挥发性成分构成研究的失真。因此，本研究认为选择萃取时间30 min较为合适，并以此作为后续研究的实验参数。
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图 6 不同萃取时间萃取物质相对峰面积对比Figure 6. Comparison of relative peak areas of extracted substances at different extraction times综上所述，筛选出使用75 μm CAR/PDMS萃取头的最佳顶空微萃取条件为将酱醪取1850 mg（约1.6 mL）移入顶空萃取瓶中，添加2.5 g氯化钠，2 μL的内标2-辛醇（10 mg/L），放入磁力搅拌转子，置于恒温加热磁力搅拌器中，50 ℃水浴10 min预热，随后将老化后的萃取头插入顶空瓶中，推出纤维头进行萃取，保持50 ℃恒温水浴萃取30 min。
2.3 最佳萃取条件下红曲酱油稀醪挥发性物质变化分析
2.3.1 红曲酱油与其他酱油挥发性物质对比
使用上述最佳萃取条件对红曲高盐稀态酱油稀醪发酵160 d（HQ）、WSD生抽酱油（WSD）和MT生抽酱油（MT）进行挥发性物质分析，由表1可知，HQ种类数最多，共计58种，其中酯类物质有15种，酯类占比最高，为50.94%±6.67%；WSD有48种挥发类物质，吡嗪类数量最多，为13种，但挥发类物质中占比最高的为酚类物质；MT的数量最少，为46种，但其种类物质较为均匀，酮类物质数量最多，为8种，而占比最高的物质类别为醇类。已有研究证明[20]，酯类物质自身具有果香、花香、蜂蜜香等芳香气味外，还能够调和其他物质的刺激感和苦味，缓冲盐的咸味，促进苯乙醇等风味物质的香气，赋予酱油更多的风味，是酱油中的重要风味物质[21]。因此能够认为红曲酱油的主要挥发性物质为酯、醇、酸、酮，与市场上现有的以醇、酚为主要挥发类物质的酱油产品具有明显差异。
表 1 不同酱油挥发性风味物质类别对比Table 1. Comparison of volatile flavor compounds in different soy sauces物质类别 数量（种） 占比（%） WSD HQ MT WSD HQ MT 醇类 6 11 6 15.90±1.97 11.77±1.90 29.67±4.97 酸类 3 7 5 14.83±1.26 16.70±2.57 12.89±2.05 酮类 5 8 8 3.77±0.39 13.92±1.96 19.02±2.76 酯类 8 15 4 11.08±0.23 50.94±6.67 3.54±1.47 酚类 3 6 5 19.20±3.83 2.16±0.57 4.56±2.50 醛类 4 2 5 8.00±1.54 2.13±0.60 4.01±1.89 吡嗪类 13 2 3 8.41±1.14 0.72±0.07 15.29±9.70 吡咯类 1 1 1 3.35±0.07 0.11±0.08 0.17±0.01 烯类 2 1 3 12.29±1.47 0.1±0.01 3.38±1.66 呋喃类 2 2 3 2.63±0.22 1.33±0.13 3.30±0.54 其他 1 3 3 0.53±0.13 0.13±0.03 4.16±0.46 合计 48 58 46 2.3.2 红曲酱油发酵期物质种类含量变化
根据上述SPME最优条件实验，对红曲高盐稀态酱油稀醪不同发酵时期（发酵10、30、50、70、80、120、160 d；编号分别为a、b、c、d、e、f、g）的挥发性风味物质进行分析研究，结合NIST11.0数据库比对和内标法计算。所有红曲酱油稀醪中检测分类出醇类（14种）、酸类（7种）、酮类（9种）、酯类（15种）、酚类（6种）、醛类（3种）、吡嗪类（3种）、吡咯类（1种）、烯类（1种）、呋喃类（2种）和其他（4种），共11大类，65种挥发性物质。由图7可知，挥发性物质总量变化趋势呈现波动上升，在发酵30 d和80 d出现两个波峰，其中80 d为最高峰（312.19±39.62）μg/kg。
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图 7 不同时期酱醪不同种类物质对比Figure 7. Comparison of different substances in sauce mash in different periods对比稀醪发酵前后（a与g处）可以发现，醇类、酮类、醛类、吡嗪类、烯类和其他类的物质含量是下降的，其中，醇类的下降尤为明显，接近50%；酸类、酯类、酚类、吡咯类和呋喃类的物质含量是增加的，其中，酯类和呋喃类物质的增加倍数接近或超过两倍。说明在高盐稀态酱油稀醪发酵时，挥发性物质变化主要是醇类物质的下降和酯类、呋喃类物质的生成。综上说明加入红曲霉对酿造酱油的挥发性风味，具有显著作用，对改善高盐稀态酱油的发酵工艺具有重要参考价值。
2.3.3 挥发性物质变化分析
本研究在对数据进行标准化后对数据进行聚类热图分析，使用HemI软件绘制图表，结果如图8所示。由图8可知，红曲酱油高盐稀态发酵50 d和80 d是挥发性香气物质生成的关键时期，在此时期大量的挥发性物质具有显著变化，且在发酵后期（80~160 d）大部分物质含量出现了增加。
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图 8 不同发酵时期酱醅主要挥发性物质热图注：图中颜色代表物质在该时期含量相对于平均值的离散值。Figure 8. Heat map of main volatile substances in soy sauce mash at different fermentation periods14种醇类挥发性物质有9种物质在不同的发酵过程中具有显著变化，正己醇C8、2-甲基丙醇C2；苯乙醇C11、2-戊醇C5；1-辛烯-3-醇C12、苯甲醇C10、3-（甲硫基）丙醇C9、3-甲基2-丁烯-1醇C3、正丁醇C1。酱油中的挥发性醇类物质主要两个来源：一是原料成分；二是发酵过程中的微生物代谢，主要是人为添加酵母的发酵，包括酒精发酵、氨基酸的还原反应和生物合成，以及碳水化合物的代谢途径[22]。可以发现，发酵前中期醇类物质形成的物质种类较少，正己醇和2-甲基丙醇含量减少，但醇类物质含量基本保持不变，说明醇类物质在稀醪发酵的前期主要为微生物的代谢，且保持相对平衡。被认为有玫瑰香气的苯乙醇主要的增长期为发酵中期，说明该时期是酵母菌发酵降解苯丙氨酸的高活性阶段[23]。正己醇一般认为来自于制曲原料中，具有一定的青草味[24]，随着发酵时间增加，正己醇的含量逐渐减少，说明其被微生物代谢利用或参与酯化反应。在发酵后期的80 d，醇类物质含量显著增长，主要为1-辛烯-3-醇C12、苯甲醇C10、3-（甲硫基）丙醇C9、3-甲基2-丁烯-1醇C3、正丁醇C1等5种醇类物质含量的增长。李杨等[25]研究认为1-辛烯-3-醇是米曲霉孢子的特征性挥发性成分，带有一种蘑菇的香气，可能主要来源于大曲发酵阶段。本实验发现，在发酵后期该物质具有显著变化，说明在发酵后期同样能够生成，或者说1-辛烯-3-醇的来源并非只有大曲培养阶段。
醛酮类物质一般是具有令人愉悦的挥发性物质，如甜香、草香、焦香等[25]，能够增强酱油的风味。本实验发酵样品中的酮类变化较显著的分别为前期的乙偶姻T1、4-羟基-2-甲基苯乙酮T8和中期的苯乙酮T4、异佛尔酮T2；醛类变化显著的有前期的3-甲基2-丁烯醛Q1和中期的苯甲醛Q3。可以发现酮类物质和醛类物质含量的主要变化集中在发酵的前中期，说明酱油稀醪发酵前中期是醛酮类生成的关键时期。酱油中的醛酮类主要来自氨基酸的降解、微生物发酵代谢和脂类的氧化[26]，如苯甲醛可由乳酸菌通过代谢产生，其前体物是苯丙氨酸[27]。
酱油中的杂环类物质有吡嗪、呋喃、吡咯、酚类化合物等，这些物质能够赋予酱油特殊风味，如具有坚果香的2,5-二甲基吡嗪、烟熏味的愈创木酚和4-乙基愈创木酚等[28]。在稀醪发酵样品中发现2,5-二甲基吡嗪B2、甲基吡嗪B1、2-甲基-3-异丙基吡嗪B3三种吡嗪类物质的显著变化均在稀醪发酵的前期，说明吡嗪类物质的生成主要在稀醪发酵前期，吡嗪类物质的生成是由L-抗坏血酸（ASA）与L-谷氨酸（Glu）/L-天冬氨酸（Asp）进行的美拉德反应[29]。2,3-二氢苯并呋喃N2同样在稀醪发酵的前期具有显著性增长，与后期含量逐渐增多的3-呋喃甲醇N1不同。吡咯类中2-乙酰吡咯L1和部分酚类物质2-甲氧基苯酚（愈创木酚）F3、苯酚F1则主要在稀醪发酵中期具有显著变化，而2,6-二甲氧基苯酚F5、4-乙基-2-甲氧基苯酚（4-乙基愈创木酚）F4、2,4-双（1,1-二甲基乙基）苯酚F6则主要集中在发酵后期。据研究表明，酚类化合物是在发酵过程中通过曲霉降解和酵母发酵生成，如4-乙基愈创木酚由阿魏酸或者香草醛经酵母菌及细菌发酵生产[30]。酚类物质主要变化在发酵中后期，说明酚类物质的产生可能基于相关酸类和醛类含量以及酵母菌或细菌的数量。
在稀醪发酵液中发现的8种酸类物质中具有显著性变化的仅有2- 甲基丙酸S3、乙酸S1、戊酸S5这三种酸类，且集中在发酵后期，其他酸类的变化则较为稳定。其中具有干酪、奶制品香味的2- 甲基丙酸S3和酸香的乙酸S1的含量较高[25]。乙酸是由乳酸菌对柠檬酸的分解代谢形成的[31]，说明发酵后期乳酸菌的生长代谢十分旺盛，能够柔和酱油的口感，并与醇类物质反应生成酯类。
酯类物质在发酵中期具有显著变化的是2-甲基丁酸2-苯乙酯Z15、β-苯基乙基丁酸酯Z14、乙酸2-苯乙基酯Z12、1-丙烯-2-醇乙酸酯Z2，后期则为 4-羟基丁酸甲酯Z7、丁酸乙酯Z4、3-甲基-1-丁醇乙酸酯Z9、甲基丁酸酯Z3、乙酸乙酯Z1、2-羟基丙酸乙酯Z6、苯乙酸乙酯Z13、苯乙酸甲酯Z11、2-甲基丁酸乙酯Z8等。可以发现酯类物质含量基本都发生了显著变化，特别是发酵后期，说明在发酵后期具备有利于酯类形成的物质和条件，微生物生长代谢旺盛，在酯化酶的作用下合成酯类[32]。酯化酶为胞内酶，其作用方式为催化酵母细胞内的活性酸一酰基辅酶A与醇结合形成酯或由脂肪酸和醇生物合成脂肪酸酯，如具有浓烈水果香气的乙酸乙酯是酱油中的风味物质，由乙酰辅酶A与氨基酸或糖类降解后产生的高级醇反应生成[33]。酯类物质的含量丰富，能够赋予酱油良好的风味。
综合以上，可以发现醛酮类物质含量变化的主要在发酵前中期；醇类物质在稀醪发酵的整个时期均有显著变化；杂环类物质在前中后期均有不同物质的含量增加；酸类则是只有在发酵后期具有显著变化，尤其是乙酸和2-甲基丙酸；酯类物质在高盐稀态发酵中后期呈现大量增长，说明增加酱油中酯类物质的含量，可通过延长酱油高盐稀态的发酵时间，从而提升酱油的风味。此外，添加了红曲霉菌的酱油发酵中发现酯类物质的含量和丰度均为最高，酯类作为酱油中水果香和清香的香气主体，说明红曲菌的添加能够提升改善酱油风味有着重要作用，在酱油高盐稀态发酵过程中能够直接起到增香作用。
3. 结论
通过对50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB /PDMS三种萃取头萃取进行筛选试验，发现75 μm CAR/PDMS萃取头对高盐稀态红曲酱油酱醅的挥发性风味物质具有较好的萃取效果。使用该萃取头的最佳萃取条件为：添加2.5 g氯化钠、萃取温度50 ℃、萃取时间30 min。使用最佳萃取条件萃取下经顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）检测分析不同酱油间挥发性成分物质种类及其占比发现，红曲酱油中挥发性物质种类高达58种，其中酯类的占比和丰度最高。并对高盐稀态红曲酱油稀醪发酵不同时期样品进行研究，发现醇类（14种）、酸类（7种）、酮类（9种）、酯类（15种）、酚类（6种）、醛类（3种）、吡嗪类（3种）、吡咯类（1种）、烯类（1种）、呋喃类（2种）和其他（4种），共65种物质。
通过热图分析其不同时期的增长率，红曲酱油稀醪发酵前中期是醛酮类、吡嗪、吡咯类物质含量的生成时期；稀醪发酵中后期是酚类、酸类、酯类的显著增加时期；仅有醇类物质是在整个发酵期间均有某种物质显著增加。说明高盐稀态发酵法，发酵时间对酱油风味物质的生成具有至关重要的作用。挥发类物质中酯类物质是含量和丰度最高的种类，证明了红曲的添加对酱油的风味和品质具有显著的增强和改善作用。建议下一步对发酵过程中微生物生长调节与红曲酱油的风味物质的相关性和变化通路进行研究。
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图 3 不同萃取头主成分分析图
注：图3中数字附表中按照分子量从小到大排序的挥发性物质。
Figure 3. Principal component analysis of different extraction heads
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图 5 不同萃取温度萃取物质相对峰面积对比
Figure 5. Comparison of relative peak areas of extracted substances at different extraction temperatures
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图 6 不同萃取时间萃取物质相对峰面积对比
Figure 6. Comparison of relative peak areas of extracted substances at different extraction times
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图 7 不同时期酱醪不同种类物质对比
Figure 7. Comparison of different substances in sauce mash in different periods
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图 8 不同发酵时期酱醅主要挥发性物质热图
注：图中颜色代表物质在该时期含量相对于平均值的离散值。
Figure 8. Heat map of main volatile substances in soy sauce mash at different fermentation periods
表 1 不同酱油挥发性风味物质类别对比
Table 1 Comparison of volatile flavor compounds in different soy sauces
物质类别 数量（种） 占比（%） WSD HQ MT WSD HQ MT 醇类 6 11 6 15.90±1.97 11.77±1.90 29.67±4.97 酸类 3 7 5 14.83±1.26 16.70±2.57 12.89±2.05 酮类 5 8 8 3.77±0.39 13.92±1.96 19.02±2.76 酯类 8 15 4 11.08±0.23 50.94±6.67 3.54±1.47 酚类 3 6 5 19.20±3.83 2.16±0.57 4.56±2.50 醛类 4 2 5 8.00±1.54 2.13±0.60 4.01±1.89 吡嗪类 13 2 3 8.41±1.14 0.72±0.07 15.29±9.70 吡咯类 1 1 1 3.35±0.07 0.11±0.08 0.17±0.01 烯类 2 1 3 12.29±1.47 0.1±0.01 3.38±1.66 呋喃类 2 2 3 2.63±0.22 1.33±0.13 3.30±0.54 其他 1 3 3 0.53±0.13 0.13±0.03 4.16±0.46 合计 48 58 46 
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